- 著者: Sara Redaelli, Monica Ceccon, Marina Zappa, Geeta G. Sharma, Cristina Mastini, Mario Mauri, Marion Nigoghossian, Luca Massimino, Nicoletta Cordani, Francesca Farina, Rocco Piazza, Carlo Gambacorti-Passerini, Luca Mologni
- Corresponding author: Luca Mologni (School of Medicine and Surgery, University of Milano-Bicocca, Monza, Italy; E-mail: luca.mologni@unimib.it)
- 雑誌: Cancer Research
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-10-15
- Article種別: Original Article
- PMID: 30322862
背景
ロルラチニブ (lorlatinib、PF-06463922) は、未分化大細胞リンパ腫 (ALCL)、非小細胞肺がん (NSCLC)、神経芽腫など、ALK (anaplastic lymphoma kinase) 活性化を伴う多様ながん種の治療に用いられる第3世代ALK/ROS1阻害薬である Sharma et al. Cancers 2018。この薬剤は、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブなどの第1〜2世代ALK阻害薬に対する耐性変異の大部分、特に高頻度で出現するG1202R変異やL1196M変異に対して、亜ナノモルから低ナノモルの強力な活性を示すことが報告されている Zou et al. CancerCell 2015。ALK阻害薬は、これらのALK陽性患者に対する特異的治療法として開発されてきた Mologni et al. ExpertOpinInvestigDrugs 2012。
しかし、標的療法における薬剤耐性の出現は依然として主要な課題であり、lorlatinib自体への耐性獲得も不可避である。クリゾチニブはNSCLCにおいて化学療法を上回る有効性を示し Shaw et al. NEnglJMed 2013、難治性ALCLや炎症性筋線維芽細胞腫瘍 (IMT) 患者においても優れた奏効率を示したが GambacortiPasserini et al. JNatlCancerInst 2014、その長期的な有効性は薬剤耐性クローンの選択によって制限されてきた Katayama et al. SciTranslMed 2012。耐性メカニズムの解明は、クリゾチニブ不応を克服するための新規薬剤開発を導いてきた。
lorlatinibは、既存のALK阻害薬に耐性を示す変異型ALKに対しても活性を示すが、lorlatinib耐性メカニズムに関する体系的な理解はまだ不足していた。特に、ALK陽性NSCLCだけでなく、ALK依存性がんであるALCLや神経芽腫においても、lorlatinib耐性の前臨床的理解が求められていた。先行研究では、lorlatinib治療後に再発した臨床症例において、C1156Y-L1198F複合変異が同定されている Shaw et al. NEnglJMed 2016。しかし、複数のがん種および複数のモデルにわたる包括的なlorlatinib耐性解析は不十分であり、on-target (ALKキナーゼドメイン変異) およびoff-target (バイパス経路活性化) の両面からの詳細な解析が必要とされていた。特に、ALK依存性腫瘍における耐性メカニズムの多様性と複雑性を考慮すると、異なる腫瘍タイプ間で耐性プロファイルがどのように異なるのか、また、それらの耐性メカニズムを標的とした併用療法が有効であるかどうかの検証は、臨床的意義が高い未解明な課題であった。本研究は、この知識ギャップを埋めることを目的としている。
目的
本研究の目的は、ALK依存性がんである未分化大細胞リンパ腫 (ALCL)、非小細胞肺がん (NSCLC)、および神経芽腫の3つの異なる腫瘍モデルにおいて、in vitroおよびin vivoでlorlatinib耐性を誘導し、その根底にある耐性メカニズムを包括的に同定することである。具体的には、on-targetメカニズムとしてのALKキナーゼドメイン変異、およびoff-targetメカニズムとしてのバイパス経路の活性化に焦点を当てて解析する。さらに、同定された耐性メカニズムに対して、小分子阻害薬を用いた治療的介入（阻害薬の組み合わせ）がlorlatinib感受性を回復させる可能性を探索し、その有効性を検証することも目的とする。これにより、lorlatinib耐性克服のための個別化された治療戦略開発に貢献する知見を得ることを目指す。本研究は、lorlatinib耐性メカニズムの多様性を明らかにし、将来的な治療戦略の最適化に資する重要な情報を提供することを目指す。
結果
ALCL in vitroでの耐性変異：複合変異と高濃度選択: Karpas-299 (K299) およびSUP-M2細胞を100 nmol/L lorlatinibで選択した耐性株 (LR100) は、親株と比較して約100倍のIC50値上昇を示した (Fig. 1A, B)。ALKリン酸化の解析から、ALKの再活性化が耐性に関与することが示唆された (Fig. 1C, D)。変異解析では、G1202R変異が両LR100集団の約25%に検出され、K299-LR100ではさらにG1269A変異が15%に認められた (G1202RとG1269Aは相互排他的)。SUPM2-LR100ではC1156F/L1198F複合変異が25%に認められた。lorlatinib濃度を1 μmol/Lまで増量した選択 (LR1000) では、K299ではG1269Aクローンが優勢となり、最終的にG1269A/G1202R複合変異の出現がクローンシークエンスで確認された。これは、G1269Aクローンが独立してG1202R変異を獲得したことを示唆する。また、lorlatinib依存的な薬物依存表現型 (drug addiction) を示す細胞株も誘導された (Fig. 1E, F)。これらの細胞は、低濃度lorlatinibで増殖が低下し、薬剤存在下でのみ正常増殖を示した。NPM/ALK転写レベルの増加も観察され、これが耐性と薬物依存性の両方に寄与する可能性が示唆された。
ALCL in vivoでの耐性変異：N1178HとG1269Aが主要変異: lorlatinib段階増量療法で再発した10個の独立腫瘍の超深部シークエンス解析では、N1178H変異がn=5/10例 (50%)、G1269A変異がn=4/10例 (40%)、L1196M変異がn=2例、G1202R変異がn=3例、I1171T変異がn=2例などが同定され、N1178HとG1269Aが最頻変異であった (Table 1)。一部の腫瘍ではN1178H+G1269A、N1178H+C1156Yなどの複合変異も認められた。耐性細胞株のIC50値は親株の6〜175倍に増加し、in vivoでの到達用量とIC50値の間に相関 (r=0.644、p=0.044) が示された (Fig. 2B)。N1178H変異の特異的機序として、NPM-ALK N1178H変異体が野生型と比較して細胞質への偏在を示すことが免疫蛍光顕微鏡法で確認された (Fig. 3A, C)。これは、N1178H変異がNPM-ALKの異常な細胞質局在を誘導することで、機能的に過発現を擬似する機序が示唆された。BaF3細胞発現系ではN1178H単独ではIC50の大幅シフトは見られず (RR 2.1倍)、この機序が従来のキナーゼ変異とは異なることを示した。
ALK非依存的バイパス経路：PI3K/AKT-RAS/MAPKシグナルの転写活性化: lorlatinib感受性変異 (L1196M) を持つ耐性腫瘍 (AS4、BS1) やN1178H変異腫瘍 (BD1) を含む3つの耐性腫瘍のRNA-seq解析では、約4,000の有意に発現変動する遺伝子が同定された (Fig. 3E)。Subramanian et al. ProcNatlAcadSciUSA 2005 でPI3K/AKT/mTOR経路 (AKT_UP.V1_UP、RAPA_EARLY_UP.V1_DN) とRAS/MAPK経路のシグネチャーが有意に濃縮された (Fig. 3G, H)。PI3Kファミリー遺伝子として、PIK3CG (PI3K-p110γ触媒サブユニット)、PIK3C2G (クラスII PI3K-C2γ)、PIK3IP1 (PI3K/AKT活性化の負の制御因子; 著明な減少) が変動した (Fig. 3I)。タンパク質レベルでもp-ERK1/2、p-AKT (Ser473・Thr308)、p-S6の亢進が3つの耐性腫瘍全例で確認された (Fig. 3J)。機能検証として、panPI3K阻害薬pictilisibがAS4細胞でlorlatinib感受性を約5倍回復させ (IC50約5倍減少、p=0.0365)、lorlatinib+pictilisib+trametinibの三剤併用でアンカレッジ非依存性コロニー形成を著明に抑制した (Fig. 4B, D)。また、G1期停止 (pG1) 誘導後にpictilisibを投与するとPIK3IP1が4倍増加し、lorlatinib感受性がほぼ完全に回復した (Fig. 4E, F)。MEK阻害薬trametinibもlorlatinib感受性を部分的に回復させた (Fig. 4J)。
NSCLC H3122 (EML4-ALK variant 1)：EGFRバイパス活性化: H3122細胞を100 nmol/L lorlatinibまで選択した耐性株 (H3122-LR100、選択期間約3.5ヶ月) ではALKキナーゼドメイン変異は認められず、EGFR活性化がon-target変異なしの主要耐性機序として同定された (Fig. 5E, G)。親株H3122は10 nmol/L lorlatinib添加後4時間でEGFRのrapid activationを示し、これが耐性クローンの迅速選択の適応的基盤である可能性が示唆された。erlotinib (EGFR阻害薬) 添加によりH3122-LR100のlorlatinib感受性が回復した (Fig. 5I)。さらに、upfront ALK+EGFR二剤併用 (lorlatinib+erlotinib) は単剤よりも耐性クローン出現を遅延させた (Fig. 5J, K)。In vivo H3122異種移植モデルでも、H3122-LR100が親株とは異なりlorlatinib治療に反応しないことが確認された (Fig. 5D)。
NSCLC H2228 (EML4-ALK variant 3a/b)：複合的バイパス経路、三剤を要する: H2228 (EML4-ALK variant 3a/b) の耐性選択はH3122より著明に遅く (約7ヶ月を要した) (Fig. 5C)。H2228-LR100ではEGFR活性化に加えてMEK経路の活性化も認められた (Fig. 5F, H)。EGFR阻害薬erlotinibのみではH2228-LR100の耐性を解除できず (Fig. 5L)、lorlatinib+erlotinib+trametinib (MEK1/2阻害薬) の三剤併用が細胞生存の著明な抑制に必要であった (Fig. 5M)。variant 3とvariant 1の間で耐性獲得速度と機序の複雑さが異なることが示され、EML4-ALK融合バリアントが耐性プロファイルに影響することが示唆された。
神経芽腫CLB-GA (ALK R1275Q)：NF1短縮変異+ErbB4/EGFR過発現によるRAS-MAPK恒常的活性化: CLB-GA (ALK R1275Q、非MYCN増幅) は親株ではlorlatinibに高感受性を示したが、1 μmol/Lまで選択した耐性株 (CLB-GA-LR1000) ではin vitro・in vivoともにlorlatinibに完全耐性を示した (Fig. 6A, B)。WES解析でヘテロ接合性NF1短縮変異が同定され、RAS/MAPK経路の恒常的活性化基盤となった (Fig. 6E)。phospho-RTK arrayでEGFRとErbB4の選択的なhyperphosphorylationが確認され (Fig. 6D)、RNA解析ではEGFRが約3倍、ERBB4が約300倍の転写亢進が認められた。afatinib (panErbB阻害薬) はErbB4活性を効果的に阻害したが、細胞増殖への効果は限定的であり、lorlatinibとの相乗効果も弱かった (Fig. 6G, I)。一方、trametinib (MEK阻害薬) はERK1/2活性を抑制し (Fig. 6H)、lorlatinib感受性を完全回復させた (Bliss independence modelとの差: Δfa=-0.34) (Fig. 6I)。多剤耐性トランスポーター (ABCB1、ABCG2) の発現増加も認められたが、verapamilはlorlatinib感受性に影響しなかった。
考察/結論
本研究は、ALK依存性がんの3種類の異なる腫瘍モデルにおいて、lorlatinib耐性が多様なon-targetおよびoff-targetメカニズムを通じて生じることを体系的に示した最初の包括的前臨床研究である。各腫瘍種特異的な耐性プロファイルが存在することが明確に示された。
先行研究との違い: これまでのALK阻害薬耐性研究では単一の耐性変異やバイパス経路に焦点が当てられることが多かったが、本研究はlorlatinib耐性において、特にALCLモデルで複数のALK複合変異が段階的に蓄積すること、および異なる腫瘍種で多様なoff-targetバイパス経路が活性化することを示した点で、これまで報告されていない複雑な耐性メカニズムの全体像を明らかにした。例えば、Shaw et al. NEnglJMed 2016 ではC1156Y/L1198F複合変異が報告されたが、本研究ではC1156F/L1198F変異をin vitroで同定し、その進化過程を詳細に解析した。また、Gainor et al. CancerDiscov 2016 がG1269A変異をlorlatinib感受性であると報告したのに対し、本研究ではG1269Aがin vitroおよびin vivoで高頻度に出現し、lorlatinibに対する感受性低下を引き起こす主要な変異であることを示しており、この点において対照的な結果が得られた。さらに、Yoda et al. CancerDiscov 2018 では、lorlatinib治療後にG1269A単独変異およびG1269A/G1202R複合変異を持つ患者が報告されており、本研究のin vitroおよびin vivoでの複合変異の進化の知見が臨床的意義を持つことを裏付けている。
新規性: 本研究で初めて、ALCLにおいてN1178H変異がNPM-ALKの細胞質局在を変化させ、機能的に過発現を擬似することで耐性に関与するという新規メカニズムを同定した。これは従来のキナーゼドメイン変異による耐性とは異なる、ALKの細胞内局在変化を介した耐性獲得の可能性を示唆する。また、神経芽腫におけるNF1短縮変異とErbB4/EGFR過発現の組み合わせによるRAS-MAPK経路の恒常的活性化がlorlatinib耐性に関与することも新規な知見である。これらの知見は、ALK依存性がんにおけるlorlatinib耐性の多様性と複雑性を深く理解するための重要な基盤を提供する。
臨床応用: 本知見は、lorlatinib耐性後の治療戦略が耐性機序に応じた個別化を必要とすることを強く示唆する。ALCLではPI3K阻害薬とlorlatinibの併用、NSCLC (variant 1) ではerlotinibとlorlatinibの併用、NSCLC (variant 3) ではerlotinibとtrametinibを加えた三剤併用、神経芽腫ではtrametinibとlorlatinibの併用が各モデルでの耐性克服に有効であることが示された。これは、臨床現場において、再生検による耐性機序の解明が次治療選択の前提条件となることを強調する重要な含意を持つ。特に、NSCLCにおけるEGFRバイパスメカニズムの高頻度な出現は、初回治療からのALK/EGFR併用阻害が有益である可能性を示唆するが、毒性の問題も考慮する必要がある。また、MAPK経路は3つの異なる腫瘍タイプ全体でALK非依存性に関与する共通の経路であることが示され、広範な臨床応用が期待される。
残された課題: 今後の検討課題として、in vivoモデルにおける複合変異の進化経路をさらに詳細に追跡し、その選択圧と薬剤濃度との関係を解明する必要がある。また、N1178H変異によるNPM-ALKの細胞質局在変化の分子メカニズム、特にNPM1との二量体形成や細胞質タンパク質との結合の役割をさらに深く解明することが残されている。さらに、多剤耐性トランスポーター (ABCB1、ABCG2) の発現増加がin vivoでのlorlatinib耐性にどのように寄与するか、特に脳内移行への影響を含め、その臨床的意義を評価することも重要である。本研究は前臨床モデルでの知見であり、これらの結果を臨床試験で検証し、患者個別化医療へと繋げるためのさらなる研究が求められる。
方法
ALK陽性ALCL細胞株 (Karpas-299 [K299]、SUP-M2 [SUPM2])、NSCLC細胞株 (H3122: EML4-ALK variant 1、H2228: EML4-ALK variant 3a/b)、神経芽腫細胞株 (CLB-GA: ALK R1275Q変異; SH-SY5Y: ALK F1174L変異) を対象に、段階的なlorlatinib曝露による耐性細胞株誘導を行った。in vitro選択プロトコルでは、細胞を初期濃度から100 nmol/L、さらに1 μmol/Lへと段階的にlorlatinib濃度を増加させ、細胞が親株と同程度の増殖速度を回復するたびに薬剤濃度を上げた。
In vivo研究では、6週齢の雌SCIDマウス (n=10、lorlatinib治療群) の皮下に1000万個のKarpas-299細胞を移植した。腫瘍が平均200 mm³に達した後、マウスを無作為にビヒクル単独群 (n=4) またはlorlatinib治療群 (n=10) に割り付けた。lorlatinibは0.1 mg/kgから開始し、腫瘍の再発または部分退縮後の安定化に応じて0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kgと段階的に増量する個別化プロトコルで経口投与を1日2回行った。治療は0.5 mg/kg (n=4)、1 mg/kg (n=3)、2 mg/kg (n=3) の異なる用量で停止され、得られた10個の独立した耐性腫瘍をex vivo細胞株として樹立した。NSCLCおよび神経芽腫細胞のin vivo耐性確認のためには、ヌードマウスに親株または耐性株の皮下腫瘍 (100万個の細胞) を確立し、NSCLCでは1 mg/kg、神経芽腫では1.5 mg/kgのlorlatinibを1日2回、2週間投与した。動物実験プロトコルはミラノ・ビコッカ大学の動物福祉倫理委員会によって承認され、イタリア保健省によっても承認された。本研究は前臨床研究であり、臨床試験識別子 (NCT番号など) は存在しない。
ゲノム解析として、全エクソームシークエンス (WES) を平均80xの深度で実施し、変異は耐性細胞のリードで25%超、対照細胞のリードで5%未満の頻度で存在する場合にコールした。RNA-seqはpolyA選択、paired-endで約5000万クラスターの深度で実施し、Dobin et al. Bioinformatics 2013 を用いてアラインメントし、Love et al. GenomeBiol 2014 で差次発現解析を行った。ALKキナーゼドメインの超深部シークエンス (平均10,000x coverage) およびSangerシークエンスも実施し、複合変異はクローンSangerシークエンスで確認した。
バイパス経路解析として、Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit (R&D Systems) を用いて49種類のヒト受容体型チロシンキナーゼ (RTK) のリン酸化状態を評価した。ウエスタンブロット解析により、ALK、EGFR、S6リボソームタンパク質 (RPS6)、p44/42 MAPK (Erk1/2)、STAT3、HER4/ErbB4、AKT、およびそれらのリン酸化型タンパク質の発現レベルを評価した。
機能検証として、細胞増殖アッセイ (CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay System)、アポトーシス検出 (eBioscience Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC)、ソフトアガーコロニー形成アッセイを実施した。pictilisib (panPI3K阻害薬)、trametinib (MEK1/2阻害薬)、erlotinib (EGFR阻害薬)、afatinib (panErbB阻害薬) との組み合わせ実験を行い、lorlatinib感受性回復効果を評価した。免疫蛍光顕微鏡法により、NPM-ALK N1178H変異体の細胞内局在を野生型と比較して評価した。統計解析には、GraphPad Prismソフトウェアを用い、IC50値、相対抵抗性 (RR) 指数、およびBliss Independenceモデルに基づく併用効果を算出した。統計的有意差は、一元配置分散分析 (ANOVA) または対応のない両側t検定を用いて評価した。