- 著者: Yifan Wang, Nan Li, Wen Jiang, Weiye Deng, Rui Ye, Cai Xu, Yawei Qiao, Amrish Sharma, Ming Zhang, Mien-Chie Hung, Steven H. Lin
- Corresponding author: Steven H. Lin (The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 1515 Holcombe Blvd., Houston, TX 77030)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-08-01
- Article種別: Original Article
- PMID: 30068711
背景
非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) において KRAS は最も頻度の高い oncogene 変異であり、放射線抵抗性と臨床的予後不良に関連する (Ding et al. Nature 2008, Imielinski et al. Cell 2012)。Skoulidis らは共変異パターンに基づき KRAS-mutant 肺腺癌を KP (KRAS+TP53)、KL (KRAS+STK11/LKB1)、KC (KRAS+CDKN2A/B) の 3 亜型に層別化し、KL 亜型は化学療法・放射線療法・免疫チェックポイント阻害剤に対して特に難治性であることを示した (Skoulidis et al. CancerDiscov 2015)。LKB1 (Liver Kinase B1, STK11) は AMPK の主要上流キナーゼで AMPK-mTOR 経路を介して細胞増殖・代謝・autophagy を制御し、NSCLC の 15-30% で変異不活化を受ける tumor-suppressor である (Koyama et al. CancerRes 2016)。
放射線抵抗性に対する分子標的併用戦略として、本研究グループは過去の high-content clonogenic スクリーンで MEK 阻害剤を KRAS-mutant NSCLC の有望な放射線増感剤として同定し、trametinib (MEK1/2 inhibitor、BRAF-V600E melanoma 既承認) が in vitro / in vivo で放射線感受性を増大することを報告していた (Lin et al. JThoracOncol 2014)。しかしながら、trametinib radiosensitization の効果は同じ KRAS-mutant 細胞間でもばらつきがあり、その変動要因 (どの co-mutation 状態が responder か) は未解明であった。さらに既存研究では Kras-Lkb1 マウスモデルが Kras / Kras-p53 と比較して radiotherapy 単独に最も resistant であることが示されており (Herter-Sprie et al. NatCommun 2014)、この KL 亜型の放射線抵抗性をどのように克服するかが大きな臨床的 gap として残されていた。共変異に依存した radiosensitization 機序の体系的解明、特に LKB1 status が trametinib 増感に与える影響と分子基盤の同定は不足しており、本研究はこの knowledge gap を埋めるべく、KP/KL 細胞パネル・CRISPR isogenic ペア・syngeneic マウスモデルで多層解析を実施した。
目的
KRAS-mutant NSCLC において trametinib radiosensitization の効果を決定する co-mutation 因子を同定し、KL 亜型と KP 亜型での感受性差を駆動する分子機序 (p53-MDM2-senescence 軸と LKB1-AMPK-autophagy 軸の相互作用) を解明し、autophagy 阻害剤を含む 3 剤併用が KL 亜型以外でも synergy を獲得しうるかを syngeneic マウス腫瘍モデルで前臨床的に検証すること。
結果
KL 細胞での trametinib radiosensitization の選択性: KP/KL ヒト NSCLC 細胞パネルでの clonogenic survival assay により、trametinib は KL 細胞 (A549, H460) で DER0.5 >1.2 の radiosensitization を発揮するが、KP 細胞 (H441) では効果なし という選択性が示された (Fig 1A-C)。A549-control は DER0.5 = 1.87、H460-control は DER0.5 = 1.29 (いずれも sensitizer 定義 ≥1.2 を満たす) (Fig 3D-E)。Triple mutant H23 (KRAS-LKB1-p53) は trametinib radiosensitization を示さず (Suppl Fig S1D)、後述する p53-dependent senescence 機序の必要性を示唆した。
p53 依存性 senescence の誘導 (KL 亜型のみ): SA-β-Gal 染色は H460 KL 細胞では trametinib + 放射線で有意に増加 (P <0.001) したが、H441 KP 細胞では変化なし (Fig 2A-B)。Senescence marker p21 は A549/H460 KL 細胞で combination 処理により単剤を超えて顕著に上昇したが H441 では変化なし (Fig 2C)。CRISPR p53 KO により A549/H460 で trametinib radiosensitization が消失し、p21 上昇と senescence も消失した (Fig 2D-E、Suppl Fig S1C)、p53 が必要因子であることを確認した。機序として trametinib は MDM2 Ser166 リン酸化を強く抑制 (ubiquitin ligase 活性低下) し、放射線誘導 p53 Ser15 リン酸化と total p53 安定化と相まって p21 を強力に upregulation する (Fig 2F)。
LKB1 が trametinib radiosensitization の決定因子: LKR13 isogenic 系で、Lkb1 KO と p53 KO はいずれも放射線抵抗性を増大 (Fig 3A)、加えて Lkb1 KO は trametinib にも抵抗性を付与した (Fig 3B、P*=0.046, P**=0.003)。Trametinib 用量依存的 radiosensitization は** Lkb1-KO クローンでのみ観察され**、scrambled control と p53-KO では検出されなかった (Fig 3C、P*=0.033)。逆に LKB1 をヒト KL 細胞 (A549, H460) に過剰発現させると trametinib radiosensitization が抑制され (Fig 3D-E、A549-LKB1 と H460-LKB1 で DER0.5 が control 値から低下)、senescence 誘導も阻害された (Fig 3F、Suppl Fig S3A)。LKR13 でも同じ pattern が再現された (Suppl Fig S3B-C)。
AMPK-autophagy 軸が LKB1 依存性耐性を媒介: Combination 処理後の Western blot で AMPK 活性化 (phospho-AMPK-Thr172) は LKB1-WT 細胞でのみ強く誘導され、LKB1 欠損細胞では完全に消失 した (Fig 4A-B、Suppl Fig S4)。AMPK 活性化剤 AICAR (0.5 μmol/L) は LKB1 を欠く A549 でも AMPK を活性化でき (Fig 4C)、clonogenic assay で trametinib radiosensitization を abrogated (Fig 4D)。逆に LKR13 で AMPKα1 siRNA knockdown を行うと scrambled LKR13 で DER0.5 = 0.95 (耐性) が AMPK-KD で DER0.5 = 1.38 (感受性) に転換 (Fig 4E-F)、LKB1-AMPK 軸の必要性を確立した。Autophagy markers LC3B II/I 比と phospho-ULK1-Ser555 は LKB1-WT で combination 後に強く上昇するが、Lkb1-KO では baseline 低下し誘導も認めず (Fig 5A-B、Suppl Fig S5A-B)。HCQ (50 μmol/L) または ATG5 siRNA は A549-LKB1 細胞で senescence を回復させ trametinib radiosensitization を再付与 (Fig 5C-F、Suppl Fig S5C-D)。Lkb1-KO 細胞は baseline ROS が elevated であった (Suppl Fig S5E)。
Syngeneic マウス: KL 腫瘍は組合せに極めて感受性: 5×10⁵ LKR13-Lkb1-KO 細胞由来 s.c. 腫瘍に対し、trametinib 単剤・chemoradiation 単剤はいずれも tumor growth を抑制せず、combination 群のみが有意な腫瘍制御と長期生存 を達成 (Fig 6B-C、P <0.0001、Suppl Fig S8)。肺転移結節数は control / chemoradiation 群で多数、trametinib 単剤で減少 (P =0.026 vs control)、combination でさらに削減 (P =0.04) (Fig 6D-E)。Combination 群の腫瘍では p21 蛋白発現が著明に上昇 (Fig 6F)。LKR13-scrambled 腫瘍では trametinib 単剤・chemoradiation 単剤ともそれぞれ単独で腫瘍を抑制し combination の有意上乗せは認めず (P =0.060)、しかし HCQ+trametinib+chemoradiation の triple 併用で scrambled 腫瘍でも有意な追加抑制を達成 (P <0.001, Fig 6G)、autophagy 阻害が KL 以外の KRAS 腫瘍にも応用可能性を示した。
考察/結論
本研究は KRAS-mutant NSCLC における trametinib radiosensitization の co-mutation 依存性 を体系的に解明し、(1) KL 亜型 (KRAS+LKB1-mutant) では trametinib + 放射線が p53-MDM2-p21 senescence 軸を介して相乗的細胞死を誘導すること、(2) LKB1-WT 細胞では LKB1-AMPK 軸が autophagy を活性化し senescence からの rescue を介して耐性を生じること、(3) autophagy 阻害 (HCQ または ATG5 KD) または LKB1 KO により耐性が解除されること、を細胞レベル・isogenic CRISPR ペア・syngeneic マウス腫瘍モデルの 3 階層で検証した点で重要な前臨床基礎研究である。
① 先行研究との違い: 既存研究は KL 亜型を「化学療法・放射線療法・ICB に難治性」とまとめて記述していた (Skoulidis et al. CancerDiscov 2015、Koyama et al. CancerRes 2016) のと 対照的に、本研究は KL 亜型に対し trametinib + 放射線という特異的に有効な治療コンビネーション を同定し、tumor suppressor の喪失が必ずしも治療耐性を意味しないという counterintuitive な findings を提示した。また Herter-Sprie 2014 が示した「Kras-Lkb1 は radiotherapy 単独に最も resistant」という観察を踏襲しつつ、これに MEK 阻害を加えると逆に synthetic lethal-like vulnerability に転化することを示し、これまでの「LKB1 mutation = poor prognosis」一辺倒の見方と相違する新しい治療概念を提案した。
② 新規性: tumor suppressor LKB1 の wild-type 残存が MEK 阻害 + 放射線という外的 stress に対し AMPK-autophagy という防御機構を能動的に発動する ことを示したのは本研究で初めてであり、tumor suppressor が「保護」として機能するという観察自体が novel concept である (metformin が AMPK 活性化により抗腫瘍効果を発揮するという既存パラダイムと逆方向の現象)。trametinib の MDM2 Ser166 リン酸化抑制を介した p53 stabilization という分子機序も novel な radiosensitization メカニズムである。
③ 臨床応用: KL 亜型は KRAS-mutant NSCLC の約 20-30% を占め、ICB 抵抗性・化学療法低感受性として現状治療選択肢が限られている。本研究の bench-to-bedside メッセージ として、(a) KRAS-LKB1 共変異 status は trametinib + 放射線併用 (とりわけ stage III NSCLC の curative chemoradiation 領域) に対する predictive biomarker として開発可能、(b) NCT01912625 を含む既存 phase I 試験 (trametinib + chemoradiation for stage III NSCLC) のサブグループ解析を LKB1 status で行うことで responder enrichment 戦略を構築可能、(c) KL 以外の KRAS 腫瘍 (KP, KC) でも HCQ など autophagy 阻害剤との 3 剤併用 (放射線 + trametinib + HCQ) で同等の synergy が獲得できる可能性が示唆され、HCQ は既承認薬で臨床応用への障壁が低い、というすぐに transl ational に活用可能な含意がある。
④ 残された課題: limitation として、(i) subcutaneous マウス腫瘍モデルは肺微小環境を完全には再現せず、orthotopic Kras-Lkb1 単結節モデルは細胞の aggressive nature により dissemination が早く実施困難であった (intraparenchymal radiotherapy 実験不可)、(ii) CRISPR KO による単一遺伝子 isogenic ペアは遺伝子背景は揃うが GEMM (genetically engineered mouse model) での tumor evolution 全体を反映していない、(iii) p53 status (KRAS-LKB1-p53 triple mutant H23 では radiosensitization が消失) を踏まえると、KL かつ p53-WT を選別するための clinical biomarker assay の精緻化が future research direction として必要、(iv) LKB1 欠損による DNA damage repair pathway (RAD50, XRCC1) への影響と MAPK 経路との interconnection、(v) AMPK 活性化が cell type / context によって senescence と autophagy のいずれを優位に駆動するかの調整機構、(vi) ICB と本 combination の重畳効果と毒性プロファイル、(vii) HCQ の薬物動態と臨床用量での autophagy 阻害十分性の検証、などが今後の検討課題として残る。
総括として、本研究は co-mutation を responder identification の鍵とする precision radiation oncology の concept を実証し、KL 亜型 NSCLC を「最難治」から「特異的に有効な治療標的を持つ亜型」へと再定義する patient stratification 戦略の前臨床基盤を提供した重要な研究である。
方法
細胞株パネル: ヒト NSCLC 細胞は ATCC または John Minna 研究室 (UT Southwestern Medical Center) から取得。KL (KRAS+LKB1-mutant): A549, H460; KP (KRAS+TP53-mutant): H441; KRAS-p53-LKB1 triple mutant: H23。マウス Kras-mutant 肺腺癌細胞 LKR13 (Tyler Jacks/Jonathan Kurie 研究室提供、Kras-mut, p53-WT, Lkb1-WT) を CRISPR knockout の isogenic platform として使用。
Identifier / 試薬: trametinib (MEK1/2 阻害剤、BRAF-V600E melanoma 既承認、NSCLC 化学放射線併用 phase I = NCT01912625)、AICAR (Acadesine, AMPK 活性化剤)、hydroxychloroquine sulfate (HCQ, autophagy 阻害剤) — いずれも Selleck Chemicals。照射は Shepherd mark I-68A Cesium irradiator。Cell 認証は MD Anderson Characterized Cell Line Core Facility で 6 ヶ月毎に short tandem repeat (STR) 法で確認、mycoplasma 定期検査。
CRISPR KO: lentiCRISPRv2 (Feng Zhang 研究室提供、Addgene #52961) で sgRNA をクローニングし 293FT で lentivirus 生成、LKR13 にトランスフェクション後 puromycin 2-5 μg/mL で 2-3 週間 single-cell クローン選択。Sanger sequencing + Western blot で KO 確認。3 クローン/genotype を取得。siRNA は ATG5 (Cell Signaling #6345)、AMPKα1 (Santa Cruz sc-29674)、control (CST #6568)。
Clonogenic survival assay: trypsinize → 6-well 6-replicate、trametinib (10-60 nmol/L) で 4-5 時間処理後 0/2/4/6 Gy 照射、24 時間後薬剤洗浄、2-3 週間後 0.1% crystal violet/20% methanol 染色、≥50 cell colony をカウント。Dose Enhancement Ratio (DER0.5) = (DMSO 50% 生存に必要な放射線量)/(薬剤群 50% 生存に必要な線量) で算出、DER0.5 ≥1.2 を radiosensitizer 定義。
機序解析: Senescence は SA-β-Gal 染色 (Sigma CS0030、随機 5-6 視野 blue cell counting + flow cytometry BioVision K991) + p21 Western blot で評価。Autophagy は LC3B II/I 比 (CST 3868) + phospho-ULK1-Ser555 (CST 5869、AMPK 下流標的)。AMPK 活性は phospho-AMPK-Thr172 (CST 2535)。p53 軸は phospho-p53-Ser15 (CST 9284) + phospho-MDM2-Ser166 (CST 3521) + total p53 (CST 2524 mouse、SC 47698 human)。ROS は CellROX Green (Thermo Fisher C10444、5 μmol/L 30 分、flow cytometry FL1)。
Syngeneic マウス実験: 8-10 週齢 male 129S background mice (Jackson Lab)。LKR13-Lkb1-KO または scrambled control 細胞 5×10⁵ を s.c. 右大腿に注入、腫瘍径 10 mm で 6 群にランダム化 (control / chemoradiation / trametinib / chemoradiation+trametinib / HCQ / HCQ+chemoradiation+trametinib、各群 n=6-10)。Chemotherapy: paclitaxel 10 mg/kg + carboplatin 30 mg/kg i.p. day 1、Radiotherapy: 2 Gy × 5 daily (合計 10 Gy)、trametinib 2 mg/kg p.o. daily × 5、HCQ 60 mg/kg i.p. daily × 5。腫瘍体積 = 0.5×length×width²、週 2-3 回測定。肺転移は day 7 で 3 匹/群を犠牲死、H&E 3 切片/sample でカウント。
統計解析: 群間比較は Student’s t-test、生存比較は log-rank test、解析は SigmaPlot 10.0 と GraphPad Prism 7.0、有意水準 P <0.05。