- 著者: Solanki HS, Welsh EA, Fang B, Izumi V, Darville L, Stone B, Franzese R, Chavan S, Kinose F, Imbody D, Koomen JM, Rix U, Haura EB
- Corresponding author: Eric B. Haura, MD (Department of Thoracic Oncology, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Tampa, Florida, USA)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-02-22
- Article種別: Original Article (Mass spectrometry-based phosphoproteomics + cell line-based KRAS G12C resistance)
- PMID: 33619172
背景
KRAS変異は肺adenocarcinomaの約25%で観察され、これまでの研究では予後不良・従来の化学療法やreceptor tyrosine kinase (RTK; 受容体型チロシンキナーゼ) 阻害薬への抵抗性が報告されている。MEK阻害薬と細胞傷害性薬剤またはPI3K/Akt経路阻害薬の組み合わせも無効または毒性の問題があり、KRAS変異lung cancerへの有効治療開発はunmet medical needであった。
これまでの研究では、KRAS G12C特異的共有結合型阻害薬 (KRASi; ARS-1620) は GDP結合不活性体に rapid bindingして optimized pharmacokineticsで効果を発揮する。KRAS G12C変異はlung adenocarcinomaの11-16%に存在し、AMG-510 (sotorasib) およびMRTX-849 (adagrasib) のlung cancerでの早期臨床活性が示されていた (Hong et al. NEnglJMed 2020 KRYSTAL-1、NEnglJMed 2020)。
これまでの研究 (earlier work) では、RTKを介したRAS signaling exchangeの調節が示されており、RTK阻害薬がexchange反応を妨害してcellをKRASiに感作させることが報告されていた。Hallin 2020 (先行研究) のMRTX849 (adagrasib) 研究 (Hallin et al. CancerDiscov 2020)、Canon 2019 (先行研究) のAMG-510 (sotorasib) 研究 (Canon et al. Nature 2019) はadaptive bypass signaling via HER (Human Epidermal growth factor Receptor) kinases・FGFR1 (Fibroblast Growth Factor Receptor 1)・AXL (AXL receptor tyrosine kinase)・SHP2 (Src Homology Phosphatase 2; PTPN11)・SOS1 (Son of Sevenless homolog 1)・mTOR (mammalian Target Of Rapamycin)・MEK (Mitogen-activated Extracellular signal-regulated Kinase)・PI3K (Phosphoinositide 3-Kinase)・CDK4/6 (Cyclin-Dependent Kinase 4/6) を提示しているが、何が足りなかったかは「どの cotargeting strategyがどの細胞型に最適か、その underlying mechanismを system-level解析で解明したデータの不足」と「特に EMT (epithelial-mesenchymal transition) status と adaptive resistance pathwayの関連を体系的に提示する研究の欠如」であり、未解明の重要なギャップであった。本研究はこのギャップを埋め、mass spectrometry-based phosphoproteomicsという system-level解析で KRASi (KRAS G12C inhibitor) に対する adaptive signaling応答を世界で初めて細胞型特異的に解明した。
目的
KRAS G12C-mutant NSCLC cell lines (n=8) を対象に、(1) ARS-1620 (KRAS G12C inhibitor) 短時間処理後のmass spectrometry-based phosphoproteomics (phosphotyrosine [pY] + global phosphoSTY) でcell type-specific adaptive signaling responsesを定量、(2) EMT (epithelial-mesenchymal transition) status (E型 vs M型) と adaptive resistance pathwayの関連を解明、(3) cell type別の最適なcombination strategy (ERBB2/3・FGFR1・AXL・SHP2・SOS1阻害との組み合わせ) を同定、(4) ヒトKRAS G12C-mutant lung cancer tissue (SPORE442 dataset、n=59) で cell-line findingsをvalidationすることを目的とした。
結果
ARS-1620感受性の細胞型heterogeneity (Fig 1A、Sup Fig S1)：8 KRAS G12C NSCLC cell linesでARS-1620の感受性は heterogeneous: H358が最高感受性 (IC50 0.4 μM、2D culture vs 3D culture)、Calu1中程度 (IC50 ~3 μM)、H1792耐性 (IC50 >10 μM)。同様のheterogeneityがAMG-510でも観察された。1 μM doseでH358 (sensitive)・Calu1 (moderate)・H1792 (resistant) を選択しphosphoproteomics基準とした。Free G12C KRAS engagementはARS-1620 (1 μM) 6h時点で H358 81.5%・Calu1 70.6%・H1792 92.9%と差異あり、target engagementとgrowth inhibitionが必ずしも一致しないことを示した。
Time-course phospho-ERK・AKTのrebound (Fig 1)：Western blotで p-ERK (T202/Y204) と p-Akt (S473) が ARS-1620処理後6時間で抑制、24時間で大半の細胞でreboundする adaptive resistance pattern確認 (vs 持続抑制細胞)。Phosphoproteomicsで全 cell linesで共通の MAPK3/MAPK6 pY低下を確認、cell line固有の応答が主体。Pre-treatment vs post-treatmentのphosphoproteome PCAで H358・Calu1・H1792が明確に分離し、adaptive signaling変化のcell type特異性を visualization。
主要知見—Epithelial型でERBB2/3バイパス (Fig 2-3)：H358・H2122・H1373・H23 (E型 cell lines: E-cadherin/N-cadherin protein ratio高、TGFβ-EMT score低) ではARS-1620処理後にHER3 (ERBB3) Y1289 phosphorylation有意上昇 (vs DMSO control、>2-fold) + HER2 (ERBB2) protein発現増加 + HER2-HER3 heterodimer formation増加が観察された。E型 cell linesでafatinib (pan-HER inhibitor: HER1/HER2/HER3/HER4) + ARS-1620の組み合わせが顕著な相乗効果 (CDI <0.7、強い相乗効果) を示した。Erlotinib (EGFR-selective) との比較でafatinibの方が優越し、HER2/HER3 targeting (pan-HER) の重要性を示した。SHP2 inhibitor (RMC-4550) + SOS1 inhibitor (BI-3406) の組み合わせもE型細胞 (特にH358) で相乗効果を示し、SOS1 (pS1134低下) → SHP2 → MAPK reactivationがE型adaptive機構の一部を担うことを実証。
主要知見—Mesenchymal型でFGFR1/AXLバイパス (Fig 4-5)：H1792・Calu1 (M型 cell lines: E/N-cadherin ratio低、TGFβ-EMT score高) ではbasal FGFR1高発現 + ARS-1620処理後のAXL signaling feedback activationが顕著。FGFR1 inhibitor (AZD-4547) は ERK・mTORのfeedback activationを抑制 (vs DMSO 50%以上低下)、AXL inhibitor (cabozantinib) はPI3K経路を suppressionした。M型 cellsでARS-1620 + AZD-4547 または ARS-1620 + cabozantinibの組み合わせが相乗効果 (CDI <0.8) を示し、FGFR1/AXL targetingがM型 KRAS G12C lung cancerに有効であることを示した。E型 vs M型 cell lines比較で、basal ERBB2/3 (E型 vs M型 3-5倍高) と basal FGFR1 (M型 vs E型 2-4倍高)・AXL (M型 vs E型 5-10倍高) の発現differences確認 (CCLE data整合)。
ヒト腫瘍組織でのEMT-RTK相関 (Fig 6、SPORE442 dataset)：SPORE442 datasetでKRAS G12C-positive lung adenocarcinoma n=59 sampleを解析、ERBB3 expression vs EMT score (PCA-based) のSpearman correlation r=-0.57 (P=2.95E-06)、ERBB2 expression vs EMT score r=-0.42 (P<0.001) と有意な負相関 (epithelial scoreが高いほどERBB2/3発現高い)、FGFR1 vs EMT score r=+0.38 (P<0.01)・AXL vs EMT r=+0.51 (P=1.2E-05) と正相関を確認。これまでのcell line findingsがpatient tumour tissueでも再現可能であることを実証、translational relevanceを支持。
考察/結論
本研究は、mass spectrometry-based phosphoproteomicsという system-level解析で、KRAS G12C阻害薬 (ARS-1620) に対するadaptive signaling responseがepithelial-mesenchymal transition (EMT) status依存の細胞型特異的パターンを示すことを世界で初めて体系的に明示した。Epithelial cellsはERBB2/3 (HER3 Y1289 phosphorylation + HER2 expression + HER2-HER3 dimer formation) を介してERK・AKT signalingを補填し、mesenchymal cellsはFGFR1 + AXL signaling (basal高発現 + feedback activation) を介して耐性化するという二分法的モデルを実証した。それぞれに対応するcombination strategy (E型: afatinib・SHP2 inhibitor + SOS1 inhibitor、M型: AZD-4547・cabozantinib) が KRAS G12C inhibitorとの相乗効果を発揮することを示した。
これまでの研究との違いとして、Hallin 2020 (先行研究、MRTX849のcombination strategies) はHER inhibitor・mTOR・MEK・CDK4/6等多数のcombo候補を提示したが、cell type別の最適化は十分でなかった (これとは異なる本研究のsystematic EMT-stratified解析)。Adachi 2020 (先行研究、Adachi et al. ClinCancerRes 2020) はEMTがKRAS G12C inhibitor耐性の intrinsic + acquired機構として関連することを示したが、本研究は phosphoproteomicsでEMT-specific bypass pathways (ERBB2/3 vs FGFR1/AXL) を分子レベルで具体的に同定した点で対照的に優越する。新規な貢献として本研究で初めて (1) KRAS G12C inhibitor adaptive resistanceのEMT-stratified phosphoproteomics提示、(2) E型 cellsのpan-HER (afatinib) + KRASi combination優位性の同定、(3) M型 cellsのFGFR1 + AXL combination優位性の同定、(4) ヒトpatient tissue (SPORE442 n=59) でcell line findingsを cross-validation、(5) precision medicine framework for KRAS G12C lung cancer提示、を達成した。
臨床応用として、(1) KRAS G12C+ lung adenocarcinoma患者のEMT status (E-cadherin/N-cadherin IHC・TGFβ-EMT gene signature・ERBB3 vs FGFR1 expression) を pre-treatment評価し、E型 → KRASi + afatinib、M型 → KRASi + AZD-4547 or cabozantinibを選択する precision medicine framework提案、(2) 進行中の臨床試験 (CodeBreaK 101 sotorasib + afatinib・KRYSTAL-2 adagrasib combos) の patient enrichment biomarker rationale提供、(3) plasma circulating tumour DNA (ctDNA) vs tumour tissue EMT statusの一致検証、(4) SHP2 inhibitor (TNO155, RMC-4630, JAB-3068) + KRASiの臨床試験 (KRYSTAL-2、CodeBreaK 101) のmechanistic basis補強、(5) AXL inhibitor (bemcentinib BGB324) + KRASi新規trial designの根拠、(6) bench-to-bedside transitionで EMT-stratified clinical trial designを支持。
残された課題とlimitationとして、(1) cell line modelsの limited representation (8 cell lines、in vivoモデル未検証)、(2) acquired resistance機構 (on-target KRAS Y96D・H95Q・R68S・secondary RTK alterations) との関連解析未完、(3) EMTがdynamic state (epithelial-mesenchymal plasticity) でcell stateが時間で変化することの臨床的影響、(4) phosphoproteomics解析の cost・technical complexityによる clinical implementation困難性、(5) SHP2 inhibitor + SOS1 inhibitor + KRASiのtriple combo毒性検証、(6) immune microenvironmentへの影響評価 (KRAS G12C inhibition + anti-PD-1併用での EMT影響)、(7) brain metastases特化のEMT status・combination strategy検証、(8) co-mutation (STK11/LKB1・KEAP1・TP53) との関連解析、(9) tumor heterogeneityによる single cell-typeとは異なる mixed EMT population挙動、が今後の検討課題である。今後の研究としては、in vivo PDX model検証、acquired resistance専用 longitudinal phosphoproteomics、KRAS G12C + EMT-targeted therapy (TGFβ inhibitor等) combination、ctDNA-basedEMT score real-time monitoring、が必要である (Hong et al. NEnglJMed 2020、Canon et al. Nature 2019)。
方法
細胞株とdrug: KRAS G12C-mutant NSCLC cell lines (n=8) を使用: H358・Calu1・H1373・H1792・H23・H2122 (ATCC由来)、HCC-44 + HOP-62 (MD Anderson + NCI由来)、LU-99 (Janssen 提供)。Drugs: ARS-1620 + BI-3406 (MedChemExpress)、AMG-510 (sotorasib)・erlotinib・afatinib・AZD-4547 (FGFR1 inhibitor)・linsitinib・imatinib・cabozantinib (AXL inhibitor)・ceritinib・GDC-0941・RXDX-106 (Selleckchem)、すべてDMSO 10 mmol/L stock、−80°C保管。Combination index (CI) はCompuSyn softwareで計算、coefficient of drug interaction (CDI) = AB/(A·B) formulaで評価。
Mass spectrometry: Cell Signaling Technology protocol 8803に従い NCI-H358・NCI-H1792・Calu1の3 cell linesからのlysate (denaturing buffer)・reduction/alkylation・trypsin digestion・peptide desalting (各 n=3 biological replicates)。pY (phosphotyrosine) enrichment: anti-pY-1000 antibody + tandem mass tag (TMT) isobaric labeling + immobilized metal affinity chromatography (IMAC) enrichment。Global phosphorylation enrichment: TMT labeling → bRPLC fractionation → IMAC enrichment。Nanoflow ultra-HPLC (RSLCnano) + Q Exactive HF-X Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific) でLC-MS/MS。
データ解析: MaxQuant v1.6.2.10でpeptide identification + reporter ion quantification、PRIDE database (PXD021603-021611) で公開。LC-MRM (multiple reaction monitoring) analysisはTSQ Altis Triple Quadrupole MSで実施 (triplicate)、Skyline v20.1.0.76で評価。
TGFβ-EMT score算出: 105-probe set TGFβ-EMT signatureを用い、各データセットでprincipal component analysis (PCA) modelを構築し、PC1のloadingで低/高方向性を確立、PC1値増加 = TGFβ-driven EMT増加と定義。CCLE database (Cancer Cell Line Encyclopedia) でERBBファミリーおよびEMT markerのRNA/protein発現を確認。
統計: MaxQuantで differential expression解析 (control vs treatment timepoints)、Pearson correlation (基底発現 vs EMT score)、CDI < 1で相乗効果と定義。Western blot validation (p-ERK T202/Y204、p-Akt S473) で signaling rebound time courseを評価。