- 著者: Desai N, Trieu V, Yao Z, Louie L, Ci S, Yang A, Tao C, De T, Beals B, Dykes D, Noker P, Yao R, Labao E, Hawkins M, Soon-Shiong P
- Corresponding author: Neil Desai (American BioScience, Inc., 2730 Wilshire Boulevard, Suite 110, Santa Monica, CA 90403)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2006
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article (Preclinical / Translational)
- PMID: 16489089
背景
パクリタキセル (paclitaxel) はイチイ (Taxus brevifolia) 由来のジテルペノイド化合物で、microtubule 安定化作用によって乳癌・肺癌・卵巣癌などの広範な悪性腫瘍に対する standard chemotherapeutic agent として位置づけられている。しかしパクリタキセルは水溶性が極めて低いため臨床製剤は CrEL (Cremophor 由来 ethoxylated castor oil-based vehicle) とエタノールを用いる必要があり、CrEL 自体が重度の hypersensitivity 反応・anaphylaxis・末梢神経毒性の主要因として知られていた。175 mg/m² 投与で血漿中 CrEL 濃度は 0.4% に達し、24 時間にわたり 0.1% 以上が持続することが報告され (Sparreboom et al. BrJCancer 1995 等の既報)、premedication (corticosteroid + antihistamine + histamine-2 receptor blocker) でも致死的アレルギーが完全には予防できない点が controversial な安全性課題であった。
ABI-007 (Abraxane / nab-paclitaxel) は 130-nm の HSA (human serum albumin) 結合ナノ粒子製剤であり、Cremophor とエタノールを完全に排除した革新的製剤として開発された (Ibrahim et al. ClinCancerRes 2002)。第 III 相試験 (n=454 転移性乳癌) では ABI-007 260 mg/m² が Cremophor paclitaxel 175 mg/m² に対し奏効率を有意改善 (33% vs 19%, P=0.001) し、first-line では 42% vs 27% (P=0.029) を示していた。しかしながら ABI-007 の優れた臨床有効性の 分子基盤は未解明 であり、特に (1) 腫瘍内パクリタキセル濃度の formulation 差、(2) 内皮細胞を介した能動輸送機序、(3) Cremophor が active drug delivery を妨害するかどうか、という 3 つの mechanistic question について前臨床的検証が 不足 していた。アルブミンは endothelial cell 表面の gp60 (albondin) 受容体を介して caveolae 経由で transcytosis を受けることが知られていたが、ABI-007 の腫瘍送達への寄与については仮説段階にとどまり、これまでの文献では明確な実験的証拠が 欠落 していた。本研究はこの knowledge gap を 5 種類のヒト腫瘍異種移植モデルと in vitro 内皮細胞アッセイの並列実験で埋めることを目的とした。
目的
nude マウスへのヒト腫瘍異種移植モデルを用いて (1) ABI-007 と CrEL paclitaxel の抗腫瘍活性を equitoxic dose で比較し、(2) [³H] 標識パクリタキセルを用いて腫瘍内薬物濃度・分布動態を定量し、(3) HUVEC (human umbilical vascular endothelial cell) と HLMVEC (human lung microvessel vascular endothelial cell) を用いた in vitro binding/transcytosis assay で endothelial transport 機序を解明し、(4) CrEL が gp60 経路・albumin binding を阻害するかを検証して ABI-007 の優れた効果の分子機構を統合的に明らかにする。
結果
毒性プロファイル (LD50 / MTD) で ABI-007 が有意に低毒性: 全 cell line + non-tumor-bearing animals を pool した mortality 曲線から、ABI-007 の LD50 は 47 mg/kg/d、CBP は 30 mg/kg/d と算出され、ABI-007 は CBP より約 1.57 倍高い LD50 を示した (P=0.017 ANOVA、Table 1, Fig 1)。30 mg/kg/d 投与時の mortality は ABI-007 で 4% (3/72) に対し CBP で 49% (23/47) と 12 倍以上の差があり (P<0.0001 Fisher’s exact)、MTD は ABI-007 30 mg/kg/d、CBP 13.4 mg/kg/d となった (これらが equitoxic dose、4% mortality 両群)。CrEL 媒介の毒性回避が定量的に示された。
5 cell line での抗腫瘍活性 — 乳癌・卵巣癌で ABI-007 優位: equitoxic dose (ABI-007 30 vs CBP 13.4 mg/kg/d) で 5 cell line を比較すると感受性は lung > breast ≈ ovary > prostate > colon の順 (Table 2, Fig 2)。MX-1 (breast) では tumor-free survivor 比が ABI-007 10/10 vs CBP 1/5、median time-to-recurrence >103 vs 22 日 (P=0.004)、tumor doubling time >95 vs 31.2 日 (P=0.0015)。SK-OV-3 (ovarian) では tumor-free survivor 7/29 vs 0/10、TTR 63 vs 26 日 (P<0.001)、doubling time >51 vs 44.2 日 (P<0.0001)。PC-3 (prostate) は TTR 48 vs 26 日 (P=0.04) で ABI-007 有意延長、doubling 52.9 vs 40.2 日 (NS)。HT29 (colon) は TTR 36 vs 26 日 (P=0.003)、doubling 44.9 vs 29.4 日 (P=0.01) で ABI-007 有意。H522 (lung) は両群とも highly responsive (tumor-free 9/10 vs 7/10、NS)。
腫瘍内パクリタキセル濃度 33% 上昇 (n=126 MX-1 mice、2 independent experiments): 等量 20 mg/kg i.v. 投与での腫瘍内 [³H] パクリタキセル AUC は ABI-007 3,632 nCi·h/g vs CBP 2,739 nCi·h/g と ABI-007 が 33% 高値 (P<0.0001 ANOVA, Fig 3)。Absorption constant Ka は ABI-007 0.43 h⁻¹ vs CBP 0.13 h⁻¹ と ABI-007 が 3.3 倍高速 (P<0.0001) で、5 分という最早期 time point から既に formulation 差が顕在化し 3 時間で最大乖離。組織 partitioning kinetics の formulation 依存性が明確に示された (n=2 independent experiments で再現)。
Endothelial binding (9.9 倍) と transcytosis (4.2 倍) の formulation 差: HUVEC への paclitaxel-Flutax binding は ABI-007 が CBP の 9.9 倍 (P<0.0001, Fig 4A)、HLMVEC monolayer での transcytosis (経内皮輸送) は ABI-007 が CBP の 4.2 倍 (P<0.0001, Fig 4B)。ABI-007 の transcytosis は methyl β-cyclodextrin (caveolar transport の既知阻害剤) で完全抑制され、albumin-gp60-caveola 経路に依存することが立証された。CrEL EL 添加実験では endothelial binding が dose-dependent に抑制され IC50 0.010% (Fig 4C)、albumin への paclitaxel binding 抑制 IC50 は 0.0017% (Fig 4D) で、いずれも臨床的に達成される血漿中 CrEL 濃度 (0.1-0.4%) を大きく下回る濃度で阻害が完成。これは CrEL が active transport pathway を能動的に阻害することを mechanistic evidence として示した。
統合機構モデル: 以上の data を統合すると ABI-007 では (1) CrEL なし → albumin-paclitaxel nanoparticle が遊離状態で循環、(2) gp60/albondin 受容体結合 → caveolin-1 介在 caveolae 形成 → transcytosis、(3) 腫瘍間質への active delivery、(4) SPARC など stromal albumin-binding protein による retention、というカスケードが ABI-007 の優れた intratumor accumulation の分子基盤を構成することが示された。CrEL paclitaxel ではステップ (1) (2) で CrEL ミセルがパクリタキセルを sequester し、さらに albumin/gp60 結合を阻害して active transport を抑止する。
考察/結論
本研究は 5 種ヒト腫瘍異種移植モデルと in vitro 内皮細胞アッセイの並列実験により、ABI-007 (nab-paclitaxel) が CrEL paclitaxel と比較して優れた抗腫瘍活性を示す機序として (a) 33% 高い腫瘍内薬物濃度、(b) 9.9 倍の内皮細胞 binding、(c) 4.2 倍の transcytosis、(d) gp60/caveola 経路依存性、(e) CrEL の active transport 阻害 の 5 軸を同時に証明した最初の包括的前臨床研究である。
① 先行研究との違い: これまでの paclitaxel formulation 研究は in vitro 細胞毒性比較 (IC50) か血漿 PK 解析が主であり、腫瘍内薬物濃度と active transport 機序を統合的に評価した報告は これまでに 限定的であった。Phase I/PK 研究の Ibrahim 2002 (Ibrahim et al. ClinCancerRes 2002) では ABI-007 の human MTD が 300 mg/m² と CBP の 175 mg/m² より高いことを示したが、その理由は plasma PK のみで説明されていた。本研究は 対照的に active transport 機序という新たな視点を提示し、CrEL が単なる溶解 vehicle ではなく能動的に drug delivery を阻害する factor であることを これまでの 受動拡散モデルとは 異なる 形で実証した。先行する vascular normalization 研究 (Jain et al. Science 2005) は受動的な漏出 (EPR effect) に焦点を当てていたが、本研究は能動的な内皮 transcytosis という別経路を提示した点で 相違 がある。
② 新規性: ABI-007 の優れた腫瘍送達の分子基盤として gp60-caveolae-transcytosis 経路を 本研究で初めて 系統的に証明した点に 新規な 知見がある。CrEL の active transport 阻害作用は これまで報告されていない novel な mechanism であり、IC50 0.010% (endothelial binding) と IC50 0.0017% (albumin binding) という具体的な数値で阻害強度を定量化した点でも novelty が高い。さらに方法論的に [³H] 標識による腫瘍内濃度測定と Flutax 標識による HUVEC/HLMVEC transcytosis assay を結合した実験設計は新規であり、 first to demonstrate endothelial cell が paclitaxel formulation 間で能動輸送差を駆動する main site であることを示した。
③ 臨床応用: 本研究の機序解明は nab-paclitaxel の 臨床応用 に直接的なエビデンスを提供する。乳癌で確立した Phase III データ (Gradishar et al. JClinOncol 2005) に加え、NSCLC・膵癌 (gemcitabine 併用 MPACT 試験) への適応拡大の 臨床的有用 性が分子レベルで裏付けられた。bench-to-bedside の橋渡しとして、SPARC 高発現腫瘍 (膵癌・乳癌 luminal B 等) で nab-paclitaxel の臨床効果が特に高い理由は本研究の albumin-gp60-SPARC retention モデルから予測可能であり、臨床現場での patient stratification (SPARC IHC、albumin-binding capacity assay 等) への translational 応用が期待される。
④ 残された課題: 本研究には複数の limitation がある。第一に xenograft model は immunocompromised mouse でヒト免疫系を欠くため、ICI 併用効果は評価できていない。第二に gp60 receptor の発現量と nab-paclitaxel 効果の dose-response 関係は確立されておらず、bio marker としての gp60 IHC の臨床有用性は 今後の検討 が必要である。第三に CrEL 阻害の臨床的意義 (新規 CrEL-free formulation 開発の差別化指標としての価値) は前向き比較試験で検証されるべき。第四に SPARC の役割は本研究では mechanistic confirmation がなく 今後の研究 で SPARC-knockdown xenograft などで直接証明する必要がある。第五に caveolin-1 dependent transcytosis は他の albumin-bound 製剤 (近年の albumin-conjugated immunoconjugate 等) にも適用可能か、汎用性検証が future research direction として残る。
結論として、ABI-007 (nab-paclitaxel) は CrEL paclitaxel と比較して (a) 抗腫瘍活性向上、(b) 腫瘍内薬物濃度 33% 上昇、(c) 内皮 binding 9.9 倍、(d) transcytosis 4.2 倍、(e) gp60/caveola 依存性、(f) CrEL の active transport 阻害解除、という 6 つの機序的優位性を示した。これらの所見は nab-paclitaxel の乳癌・NSCLC・膵癌での臨床的成功を支持する分子基盤を提供する。
方法
動物・腫瘍モデル: female athymic nude mice (NCr-nu strain, Charles River, body weight 21-25 g, 6-8 週齢) に H522 (lung)、MX-1 (breast adenocarcinoma)、SK-OV-3 (ovarian adenocarcinoma)、PC-3 (prostate adenocarcinoma)、HT29 (colon adenocarcinoma) の 5 種 NCI 由来 cell line を 30-40 mg fragment として s.c. 移植 (n=10 mice/dose/xenograft、計 n=50 mice/dose 以上の biological replication を確保)。腫瘍が median 160 mg に達した時点で treatment 開始。Dose-finding study は non-tumor-bearing mice (n=2-4/dose) で 13.4-100 mg/kg/d (i.v., qd×5d) を実施。Tumored animals は 10 mice/dose/xenograft (SK-OV-3/ABI-007 は n=30、MX-1/CBP は n=5) を組成し、ABI-007 13.4-45 mg/kg/d vs CBP (Cremophor-based paclitaxel) 13.4-30 mg/kg/d を比較。
PK / 腫瘍取り込み: athymic mice n=126 (MX-1 600 mm³ 腫瘍保有) を 7 time point (5, 15, 30 分・1, 3, 8, 24 時間) × n=9/time point に割り付け、[³H] paclitaxel (≥99% 純度、25 μCi/mg specific activity) として ABI-007 または CBP を 20 mg/kg i.v. bolus 投与。摘出腫瘍を combustion + liquid scintillation counting で radioactivity 定量、area under the curve (AUC) と absorption constant Ka を WinNonLin で算出。
in vitro binding/transport: HUVEC を Costar 3614 96-well plate に confluent まで培養し Flutax (Oregon Green paclitaxel)-labeled ABI-007 vs CBP を 20-640 μg/mL で 1 時間処理して fluoroskan で endothelial binding を定量。HLMVEC を Transwell insert (Falcon HTS FluoroBlok) に 84,000 cells/insert で seeding、5% HSA + 0 or 10 mmol/L methyl β-cyclodextrin (caveolar transport inhibitor) を含む EBM-PRF medium で transcytosis を 20 μg/mL Flutax 添加で連続モニター。HSA 結合は immobilized HSA-coated plate に 0.5 μg/mL Flutax + Diluent 12 (CrEL/ethanol) gradient で評価し IC50 を Prism で算出。
統計: LD50 は Boltzmann sigmoidal equation で fit (GraphPad Prism)、MTD は mortality <10% を満たす最高用量と定義。Tumor doubling time と recurrence は Kaplan-Meier 法 (StatView, SAS Institute) で評価、treatment 間比較は ANOVA for repeated measures + log-rank test、cell line mortality 比較は Fisher’s exact test。