- 著者: Puyu Shi, You-Take Oh, Liang Deng, Guojing Zhang, Guoqing Qian, Shuo Zhang, Hui Ren, Grant Wu, Benjamin Legendre Jr, Emily Anderson, Suresh S. Ramalingam, Taofeek K. Owonikoko, Mingwei Chen, Shi-Yong Sun
- Corresponding author: Shi-Yong Sun (Emory University); Mingwei Chen (Xi’an Jiaotong University)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2017
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 28765329
背景
EGFR (epidermal growth factor receptor) 活性化変異は西洋人NSCLCの約15%・東アジア人NSCLCの約40%に認められ、その90%はexon 19 deletion (Del19、約60%) またはexon 21 L858R (約30%) である。これまでの研究として、第1世代EGFR-TKI (gefitinib・erlotinib) は臨床的に有効だが獲得耐性が出現し、耐性機序の約60%はT790M (threonine 790 to methionine、ATP親和性増加によりTKI結合阻害) ・5-22%はMET (mesenchymal-epithelial transition) 遺伝子増幅 (Engelman et al. Science 2007 が報告したMET → ErbB3 → PI3K/AKT bypass機序) で説明される。
AZD9291 (osimertinib、TAGRISSO) は第3世代の不可逆的EGFR-TKIで、T790M耐性変異を持つNSCLCに対して有効でFDA承認済みである (Janne et al. NEnglJMed 2015) が、治療継続によって獲得耐性が生じる。以前の研究 (Thress et al. NatMed 2015; Piotrowska et al. NatMed 2016) によりEGFR C797S (cysteine 797 to serine) 変異がAZD9291耐性機序として同定されたが、これはAZD9291耐性のT790M-positive症例の33-36%にとどまり、CO1686 (rociletinib) 耐性ではわずか<3%と報告される。
既報でBim (Bcl-2-interacting mediator of cell death) はEGFR-TKI誘導アポトーシスを媒介するBH3-only proteinとして同定されているが (Costa DB et al. 2007; Cragg MS et al. 2007)、AZD9291がどのようにアポトーシスを誘導し耐性時にその機序がどう変化するかは十分に解明されていなかった。何が足りなかったかというと、(1) AZD9291による Bim・Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1、抗アポトーシスBcl-2ファミリー) ・ERK (extracellular signal-regulated kinase) シグナルの相互作用が未解明、(2) C797S変異・トリプル変異 (Del19+T790M+C797S = “3M”) 耐性細胞におけるアポトーシス機序の障害解明、(3) 耐性克服のための合理的併用療法戦略の前臨床validationが欠落、の3点がgapとして残されていた。
目的
AZD9291によるアポトーシス誘導の分子機序として、MEK/ERK経路を介したBim蛋白安定化とMcl-1プロテアソーム分解の役割を明らかにし、MEK阻害薬 (trametinib等) との併用によってC797S変異を含む獲得耐性を克服できるかをin vitro・in vivoで検証する。
結果
AZD9291によるEGFR変異 NSCLC でのapoptosis誘導とBim/Mcl-1調節：AZD9291 (10-1000 nmol/L、30 h処理) は感受性HCC827・PC-9・PC-9/GR細胞でAnnexin V陽性細胞 (apoptotic cells) を濃度依存的に増加させ (Fig 1B、n=3 replicate)、caspase-8・caspase-3・PARP cleaved formを誘導した (Fig 1C)。一方、AZD9291耐性株 (PC-9/AR・PC-9/3M) およびEGFR wild-type (H226・H596) では1000 nmol/Lでも apoptosis誘導なし。Bcl-2ファミリー解析では、AZD9291は感受性株でBim (BimEL、26 kDa) の蛋白量を著明に増加させ、p-Bim S69 リン酸化を低下、Mcl-1 (40 kDa) と p-Mcl-1 S159/T163 を低下させ、p-ERK1/2 (T202/Y204) を強く抑制した (Fig 1D)。Bax・Bcl-2 レベルは無変化。耐性株 (PC-9/AR・PC-9/3M) では1000 nmol/Lでも Bim/Mcl-1 modulation はminimalまたは無 (Fig 1E, F)。
Bim安定化とMcl-1プロテアソーム分解：転写後制御機序の確立：CHX chase assayで AZD9291処理後の Bim半減期は HCC827・PC-9 細胞で DMSO control の約3-fold延長 (Fig 2A、n=2 independent experiments)。Act D (転写阻害) 下でもAZD9291によるBim増加は維持されたため (Fig 2B)、これは転写後制御 (蛋白安定化) であることが確認された。Mcl-1半減期は AZD9291処理で DMSO に比して約2-fold短縮 (Fig 2C、proteasome 分解促進)。MG132 (proteasome阻害) はbasal Mcl-1を上昇させ、AZD9291によるMcl-1減少を完全rescue (Fig 2D)、Mcl-1低下が proteasome依存性であることを直接証明。これによりAZD9291 → EGFR 阻害 → ERK 活性低下 → p-Bim S69↓ (Bim 安定化) + p-Mcl-1 S159/T163↓ (Mcl-1 分解促進) → apoptosis という分子カスケードが確立された。
Bim/Mcl-1がapoptosisの必須エフェクター：siRNA + Mcl-1強制発現で機能的証明：Bim siRNA #1・#2 ノックダウンはAZD9291誘導 PARP cleavage を有意に減少させ (Fig 3A)、Annexin V 陽性細胞も有意低下 (Fig 3B、HCC827細胞、n=3、p<0.05)。PC-9細胞ではshRNA stable knockdownでも同様の結果 (Fig 3C, D)。Mcl-1 強制発現 (HCC827/Mcl-1・PC-9/Mcl-1 stable cell lines) はAZD9291誘導 caspase-8・caspase-3・PARP cleavage を著明に抑制 (Fig 3E) し、Annexin V陽性細胞も有意低下 (Fig 3F、n=3、p<0.05)。これらにより Bim elevation と Mcl-1 reduction の両方がAZD9291誘導apoptosisに必須であることが直接証明された。
MEK阻害薬trametinibとの併用でC797S/3M耐性細胞を克服 (in vitro)：AZD9291耐性株 HCC827/AR・PC-9/AR・PC-9/3M (Triple mutant Del19+T790M+C797S) に対し、AZD9291 (100-1000 nmol/L) + trametinib (GSK1120212、1-100 nmol/L) 併用を評価。SRB assayで併用群は単剤群より有意に増殖阻害 (CI<1 = synergy、CompuSyn解析)、colony formation assayでも colony 数が著明減少。Western blotで併用群はAZD9291単独で機能しなかったBim elevation と Mcl-1 reduction が回復、Annexin V陽性率が大幅増加 (n=3 replicate、p<0.05 vs 単剤)。同様の synergy は他のMEK阻害薬 selumetinib (AZD6244) ・PD0325901でも確認、MEK pathway全般の重要性を示した。
Xenograftマウスモデルでの併用効果：腫瘍増殖の有意抑制 (in vivo)：HCC827/AR・PC-9/AR xenograft athymic nude マウス (n=6-8/group) に対し AZD9291 5 mg/kg/day og + GSK1120212 3 mg/kg/day og 併用 (vs 単剤・vehicle)、3週間投与。併用群は単剤・vehicle群より tumor volume が有意低下 (HCC827/AR：併用群 ~150 mm³ vs vehicle ~800 mm³ at day 21、p<0.01; PC-9/AR: 同様の傾向、n=6-8/群)、tumor weight も有意低 (約4-fold減少、p<0.01)。摘出腫瘍のWestern blotで in vivoでもBim elevation・Mcl-1 reduction・p-ERK低下が併用群でのみ確認、in vitroの分子機序がin vivoで機能していることが示された (Fig 6)。体重減少・組織傷害は併用群でも軽微 (well-tolerated)。
考察/結論
本研究はAZD9291の主要なapoptosis誘導機序として、MEK/ERK経路を介したBim蛋白安定化とMcl-1プロテアソーム分解という novel な分子カスケードを同定し、本研究で初めて Bim と Mcl-1 の両方が AZD9291 apoptosis に必須であることを siRNA + Mcl-1 強制発現の両方向遺伝学アプローチで直接証明した。これまでの研究と異なる点として、先行研究ではEGFR-TKI耐性に MEK/ERK pathway が関与することは示唆されていた (Tricker EM et al. 2015等) が、本研究はBim/Mcl-1 という具体的エフェクター分子を通じた機序を蛋白半減期 + proteasome阻害 + 強制発現の組み合わせで直接示した点で新規性が高い。
第二の新規性は、Triple mutant PC-9/3M (Del19+T790M+C797S) を含む複数の耐性モデルで trametinib (GSK1120212) 併用が in vitro (CI<1 synergy) ・in vivo (4-fold tumor weight reduction) で耐性を克服することを示した点である。C797S は AZD9291 の共有結合部位を変化させ EGFR 結合能を喪失させるため EGFR 直接阻害戦略では克服困難 (Thress et al. NatMed 2015) であったが、本研究で示された MEK/ERK 抑制による Bim/Mcl-1 軸の bypass restoration はC797S を upstream 標的とせず downstream apoptosis pathway を再活性化する点で対照的なアプローチである。
新規性：本研究で新規に示された主要な所見は、(1) AZD9291 → ERK 抑制 → p-Bim S69↓・p-Mcl-1 S159/T163↓ → Bim 安定化 + Mcl-1 分解 → apoptosis という4段階分子カスケード、(2) Bim siRNA + Mcl-1 強制発現の両方向遺伝学による機能的必須性の証明、(3) C797S/3M を含む複数耐性モデルでの trametinib 併用の in vitro/in vivo 有効性、(4) MEK 阻害薬汎用性 (trametinib・selumetinib・PD0325901 全て synergy) の確認、の4点である。
臨床応用と臨床的意義 (clinical implication、bench-to-bedside)：本研究の含意は、(1) AZD9291 + trametinib (両者ともFDA承認薬) の併用療法を osimertinib 獲得耐性患者 (特に C797S 陽性例) に対して臨床試験で評価すべきとの強い前臨床根拠を提供すること、(2) ctDNA (circulating tumor DNA) で C797S/T790M/MET 増幅をモニタリング (Piotrowska et al. CancerDiscov 2016) し、C797S 陽性確認後に MEK 併用を導入する layered therapy が有望、(3) Bim 高発現 (BIM polymorphism なし) が AZD9291 一次効果の predictive biomarker となりうること、(4) trametinib は MEK 阻害薬として既に melanoma で承認されており毒性プロファイルが既知のため安全性データ蓄積が容易な点、の4点が挙げられる。実際 ORCHARD 試験 (NCT03944772) で osimertinib 耐性 NSCLC への MEK 併用がmodule として組み込まれており本研究は同試験の前臨床根拠の一つとなっている。
残された課題：(1) 本研究は前臨床データのみで臨床試験での有効性・安全性の検証が必要、(2) AZD9291+MEK阻害薬併用の毒性プロファイル (皮疹・下痢・心毒性等) の臨床評価が未確立、(3) 最適投与スケジュール (continuous vs intermittent) や用量比の最適化が必要、(4) MET 増幅・small cell transformation 等の他の耐性機序に対する MEK 併用の有効性が不明、(5) cell line panel が限定的 (HCC827・PC-9 主体) で他の EGFR 変異 type (L858R・G719X・exon 20 ins) での再現性検証が今後の検討課題、(6) Mcl-1 直接阻害薬 (S63845等) や Bim BH3 mimetic との比較・併用の前臨床評価も今後の研究が必要である。
結論として、本研究は AZD9291 の apoptosis 誘導機序として MEK/ERK 依存性の Bim 安定化と Mcl-1 プロテアソーム分解を同定し、これが C797S を含む獲得耐性で破綻すること、trametinib (MEK 阻害薬) との併用が in vitro・in vivo の両方で耐性を克服することを直接証明した。MEK/ERK → Bim/Mcl-1 軸は AZD9291 獲得耐性克服のための合理的治療標的として、臨床試験での迅速な検証が望まれる前臨床基盤を提供した。
方法
細胞株 (cell lines)：EGFR-mutant NSCLC細胞株 HCC827 (Del19) ・PC-9 (Del19) ・PC-9/GR (gefitinib-resistant、T790M) を Dr P.A. Jänne (Dana-Farber Cancer Institute) から供与。EGFR wild-type細胞株 H226 (squamous) ・H596 (NSCLC) を Dr R. Lotan (MD Anderson) から供与。AZD9291-resistant細胞株 HCC827/AR・PC-9/AR・PC-9/GR/ARを段階的曝露 (10 nmol/L → 500 nmol/L、約6 months) で自家樹立。Triple-mutant PC-9 (Del19+T790M+C797S、“PC-9/3M”) を Dr A.N. Hata (Harvard) から供与 (Niederst et al. CancerDiscov 2015 の元細胞)。Mcl-1強制発現細胞は HCC827/Mcl-1・PC-9/Mcl-1 をlentivirus導入 + zeocin (500 ng/mL) 選択で樹立。Mycoplasma陰性確認 (MycoAlert Detection Kit、Lonza)、RPMI1640 + 5% FBS、37℃ 5% CO2 で培養。
試薬 (reagents)：AZD9291・PF02341066 (crizotinib) はActive Biochemicals、AZD6244 (selumetinib) ・PD0325901 はSelleckchem、GSK1120212 (trametinib) はLC Laboratoriesから購入。全試薬 10 mmol/L DMSO stock、-80℃保存。抗体：Mcl-1・p-Mcl-1 (S159/T163) ・p-Bim (S69) ・caspase-8・PARP・p-ERK1/2 (T202/Y204) ・ERK1/2 は Cell Signaling Technology、Bim は EMD Millipore、Bax・GAPDH は Trevigen、Bcl-2 は Santa Cruz、actin・tubulin は Sigma から購入。
Apoptosis評価：Annexin V/7-AAD Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) でflow cytometry解析、caspase/PARP cleavage は Western blotで検出。SRB (sulforhodamine B) assayで増殖阻害評価 (n=4 replicate)。Combination Index (CI) はCompuSyn software (CI<1 で相乗効果と定義)。
遺伝子ノックダウン (gene knockdown)：Bim siRNA #6461・#6518 (Cell Signaling) をHiPerFect (Qiagen) で transfection。Stable knockdownは lentiviral Bim shRNAs (TRCN0000001051, TRCN0000001054、Open Biosystems) で樹立。
蛋白半減期 (protein half-life)：cycloheximide (CHX、10 μg/mL) chase assayで0-9 hまで時系列観察。Actinomycin D (Act D、2.5 μg/mL) で転写阻害下評価。MG132 (10 μg/mL) でプロテアソーム阻害評価。
マウスxenograftモデル (in vivo)：HCC827/AR・PC-9/AR を athymic nude マウスに皮下移植 (Emory University IACUC承認)。Treatment：(1) vehicle control、(2) AZD9291 5 mg/kg/day og (oral gavage)、(3) GSK1120212 (trametinib) 3 mg/kg/day og、(4) 併用群。Tumor volumeは V=π(length × width²)/6で算出。Endpoint で腫瘍摘出 + Western blot解析。
統計解析：両側unpaired Student t test (等分散) またはWelch’s corrected t test (不等分散) by GraphPad InStat 3。p<0.05で有意。