- 著者: Liu Z, Dong S, Liu M, Liu Y, Ye Z, Zeng J, Yao M
- Corresponding author: Maojin Yao (Guangzhou Institute of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, China); Jianhao Zeng (University of Virginia Health System, Charlottesville, USA)
- 雑誌: Cancer Pathogenesis and Therapy
- 発行年: 2024
- Epub日: 2023-10-29
- Article種別: Review
- PMID: 38328712
背景
脳転移は癌関連死亡の主要原因の一つであり、Sung ら (CA Cancer J Clin 2021) の GLOBOCAN 解析が示すように年間 1,900 万件超の新規癌罹患のうち肺癌・乳癌・黒色腫の進行例で特に高頻度に生じる。脳転移の成立には、primary tumor からの離脱、血行性播種、BBB (blood-brain barrier) 通過、脳実質への定着という多段階の生物学的過程が必要である。Peinado ら (Peinado et al. NatRevCancer 2017) は転移先臓器に先立って形成される pre-metastatic niche の概念を確立し、Quail & Joyce (Quail et al. NatMed 2013) は腫瘍微小環境 (TME: tumor microenvironment) が転移進行を制御するメカニズムを体系化した。さらに Bos ら (Nature 2009) は乳癌の脳転移を媒介する特異的遺伝子セットを同定し、臓器選択的転移の分子基盤を明らかにした。
しかしながら、こうした知見を実験的に検証・再現するための適切なモデル選択の指針は手薄であった。BBB の選択的透過性・複雑な免疫微小環境・immune privilege という脳固有の特性が治療開発の障壁となる一方、研究者が利用できるモデル系は in vitro から in vivo まで多様であり、それぞれに固有の利点と根本的限界が存在する。in vitro 3 モデル (BBB-Transwell, brain organoid, microfluidic chip) と in vivo 3 モデル (syngeneic allograft, xenograft, GEMM) を横断的に比較した実践的指針が欠如していたことが research gap の核心であり、特に肺癌脳転移を robust に再現できる GEMM が現状皆無であるという gap in knowledge は治療標的探索における重大な制約となっていた。加えて、3D bioprinting・AI・precision gene editing 等の新興技術がモデル発展に与える可能性も統合されていなかった。
目的
脳転移研究で現用される in vitro / in vivo 計 6 モデルカテゴリを系統的に分類・比較し、各モデルの確立方法・利点・実用的適用場面・限界を包括的に提示することで、研究者が specific な research question に対して evidence-based にモデルを選択できる実践的 guideline を提供する。加えて、3D bioprinting・real-time imaging・AI/machine learning・precision gene editing といった新興技術がモデル開発の frontier を再定義する可能性について展望することを目的とした。
結果
BBB-Transwell モデル：BBB-Transwell 系は、pore size 0.4-8 μm の半透過性多孔膜の上面に脳毛細血管内皮細胞株 (hCMEC/D3 等) を単層培養し、下面の chamber に astrocyte・pericyte を配置することで血管側と脳実質側の 2-compartment 構造を再現する (Figure 1A)。低コスト・短実験時間 (24-72 h)・high-throughput screening への適合性が最大の利点であり、多数の候補化合物の BBB 透過性評価や TEER (transendothelial electrical resistance) 測定を通じた薬剤評価が可能である。
細胞機能解析においては対照的な知見が得られている。Fujimoto ら は pericyte が転移性肺癌細胞の BBB 侵入を有意に抑制し、pericyte conditioned medium が癌細胞 proliferation を低下させることを同モデルで示した。一方 Chen ら は、肺癌細胞と astrocyte が protocadherin 7 / connexin 43 gap junction を構築することで IFNα (interferon alpha) / TNF (tumor necrosis factor) の cytokine 産生が増強され、腫瘍の growth と drug resistance が促進されることを明らかにした。これらの pericyte (抑制) vs astrocyte (促進) という逆方向の役割は、Table 1 に示す同モデルの主要な発見のひとつである。薬剤評価として Zhu ら は CXCR4 (CXC chemokine receptor 4) antagonist AMD3100 が IC50 ~10 μM で肺癌細胞の BBB 透過・proliferation を抑制することを確認し、Yin ら は EGFR-TKI / PD-L1 antibody の BBB 透過効率を定量した。静的 2D system のため血流・hemodynamic shear stress の影響や組織 3D 構造は再現できないことが根本的限界である。
脳オルガノイドモデル：Brain organoid は hPSC (human pluripotent stem cell) または hiPSC (human induced pluripotent stem cell) から自己組織化により形成される 3D 構造体で、神経細胞・astrocyte・oligodendrocyte progenitor 等の脳固有の cellular composition と立体的 cell-cell interaction を Transwell より忠実に再現する (Figure 1B)。
Quaranta ら は SCLC 細胞株 NCI-H446 および NCI-H82 (human SCLC-derived cell lines) を mKate2 (red-to-far-red fluorescent protein) で蛍光標識して brain organoid と共培養した結果、cancer cell が 24 h 以内に organoid 表面へ接着・侵入を開始し、7 日以内に organoid 全体への diffuse infiltration が完成することを live fluorescence imaging で示した。Choe ら は LUNX (lung-specific X protein) が肺癌細胞の proliferation と brain organoid への invasion を約 2 fold 促進し、invasion 辺縁部に astrocyte の集積が起こることを報告した。このモデルは CRISPR-Cas9 遺伝子操作・drug perturbation・time-lapse longitudinal tracking・high-content imaging・high-throughput omics に対応し、Transwell では観察できない 3D colonization dynamics の解析が可能である点が大きな付加価値である。高コスト (~$200-500/organoid) と免疫細胞 (microglia / T cell) の欠如が主な限界であり、ICI (immune checkpoint inhibitor) 評価には不適である。
Microfluidic chip モデル：PDMS (polydimethylsiloxane) を用いた microfluidic BBB model は、culture medium を連続流通させることで hemodynamic shear stress を再現し、Transwell / organoid の共通限界である「血流欠如」を克服した (Figure 1C-D)。Liu ら は upstream「肺」unit と functional BBB を備えた downstream「脳」unit を直列接続した two-organ microfluidic chip を開発し、肺癌 primary tumor の増殖から BBB 通過・脳実質到達までの全過程をリアルタイムで可視化した。このモデルを用いた解析で、脳に到達した肺癌細胞では AKR1B10 (aldo-keto reductase family 1 B10) の発現が約 5 fold 有意に上昇することを同定した。
Xu ら は同系に LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry) proteomics を統合し、cisplatin / carboplatin / pemetrexed および TKI (tyrosine kinase inhibitor) に対して獲得耐性を示す脳転移肺癌細胞で 200 タンパク以上の differential expression を検出した。その結果、glutathione metabolism 経路の亢進と ALDH1A1 / ALDH3A1 (aldehyde dehydrogenase) の過剰発現が drug resistance 機序として同定された。3D bioprinting の統合により intricate hydrogel microchannels が実装され、脳組織の空間的 TME 再現度がさらに向上している。PDMS による hydrophobic small molecule の吸着 (drug recovery loss 30-90%) と設計・製造の複雑性、標準 protocol の不在が実用上の課題である。
Syngeneic allograft モデル：Syngeneic allograft model は同一遺伝背景マウス (主に C57BL/6, BALB/c) に同系腫瘍細胞株を移植する方式で、intact な免疫系の下での腫瘍増殖・転移過程を観察できる (Figure 2A)。B16 melanoma model (C57BL/6 由来) が最初の mouse 転移モデルであり、Fidler ら による seminal work が organ tropism・clonal diversity・tumor heterogeneity という転移研究の基本概念を確立し、免疫療法基盤の構築と genome-wide スクリーニング研究の礎となった。
Kras LSL-G12D/+; Trp53 flox/flox (KP) LUAD (lung adenocarcinoma) モデルから樹立した KPad1 cell line は、C57BL/6 syngeneic mouse で indolent metastatic phenotype を示す。Hu ら (Nature 2023) は遺伝子スクリーニングにより STING (stimulator of interferon genes) pathway が dormant metastasis の再活性化 (metastatic outbreak) を抑制する key regulator として機能することを同モデルで同定した。乳癌 4T1 model は BALB/c fat pad への orthotopic 移植で肺・肝・脳・骨への転移を示し、ヒト転移パターンを部分的に再現する。本モデルは ICI / cancer vaccine / cytokine therapy 等の immuno-oncology drug の first-line スクリーニングに最適であるが、腫瘍増殖が急速 (14-21 日で endpoint) であること、cell line の mutational load がヒト腫瘍 (10²-10³ mutations) に比して著しく低いことがヒト病態の heterogeneity under-recapitulation の原因となる。
Xenograft モデル (CDX/PDX/zebrafish)：Xenograft model は immunodeficient 動物 (NOD/SCID (non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency)、NSG (NOD/SCID/gamma severely immunodeficient mice)、athymic nude mice 等) にヒト腫瘍を移植する系であり、CDX (cell line-derived xenograft)・cancer organoid-derived・PDX (patient-derived xenograft) の 3 形式が存在する (Figure 2B-C)。移植経路の選択が転移先臓器を規定し、IV (intravenous) injection では主に肺への播種 (Figure 3A)、IC (intracardiac) injection では脳・腹腔内臓器・骨 (Figure 3B)、ICA (intracarotid) injection では脳への選択的播種効率が最大 (Figure 3C)、orthotopic では primary site TME の再現を優先する (Figure 3D)。
CDX では MDA-MB-231 (乳癌)・A375 (melanoma)・PC9 (肺癌) が広く使用される。Rodrigues ら (Rodrigues et al. NatCellBiol 2019) は CEMIP (cell migration-inducing and hyaluronan-binding protein) を介した tumor exosomal protein が MDA-MB-231 の IC injection モデルでの early colonization を 3-5 fold 促進し、10 μg の CEMIP pre-treatment で脳への early colonization 段階が有意に増強されることを示した。PDX はヒト腫瘍の構造的 heterogeneity・histopathology を CDX より高忠実度 (~70-80% concordance) で再現する一方、spontaneous brain metastasis frequency は低く (<20%)、orthotopic implantation で改善が可能である。Sharma ら は乳癌 PDX で 27.12 MHz AM (amplitude-modulated) RF EMF (radiofrequency electromagnetic field) が Ca2+/CACNA1H (calcium voltage-gated channel subunit alpha1H) を介して脳転移を抑制することを示した。Zebrafish は光透過性と高解像 imaging・遺伝子操作の容易さから補完モデルとして台頭しており、Fan ら は miR-330-p (microRNA-330-p) 過剰発現が A549 肺癌細胞の脳転移能を増強し、osimertinib が gefitinib と比較して zebrafish 脳転移モデルで有意に強い抑制効果を示すことを報告した。
GEMM (genetically engineered mouse model) モデル：GEMM は癌遺伝子活性化または腫瘍抑制遺伝子不活化により自発的に腫瘍が形成され、primary site からの転移が起こる最も生理的な in vivo system であり、転移先での microenvironment 構築を最も忠実に模倣できる (Figure 2D)。Meuwissen ら は Trp53 / Rb1 の conditional inactivation による SCLC mouse model を確立し、n=33 匹中 n=14 匹 (42%) で骨・脳・副腎等への遠隔転移を確認したが、脳転移の個別頻度は低く不十分であった。
KP model (KRAS G12D; p53-/-) は肺腫瘍形成の histopathological fidelity は高いが転移 event は稀であり、Ji ら は LKB1 (liver kinase B1, also known as STK11) の loss-of-function 変異を KP model に導入することで全転移頻度を 60% (n=27/44 匹) に向上させた。しかし転移先は主にリンパ節・骨格系であり脳転移の有意な増加は認められなかった。対照的に、乳癌の MMTV-PyMT (mouse mammary tumor virus-polyoma middle T antigen) model および Tyr-BRAF V600E Pten-/- melanoma model では 30-40% の高頻度で脳転移が再現可能である。肺癌において robust な脳転移 GEMM が確立できない主因として、(1) 肺癌の脳転移傾向が乳癌・melanoma と比較して本質的に低いこと、(2) 脳解剖・免疫応答・転移関連分子経路にわたるマウスとヒトの種差、が挙げられる。今後は human immune system を再構成した「humanized GEMM」の開発が肺癌脳転移研究の最重要 frontier として期待される。
考察/結論
本レビューは、脳転移研究で利用可能な 6 モデルカテゴリを一つの枠組みで体系的に比較整理した点において、これまでの研究で分散していた個別モデルの記述とは対照的であり、research question 別の optimal model 選択を evidence-based に支援する実践的 framework を初めて提供した。既報の Achrol ら (Nat Rev Dis Primers 2019) の brain metastasis 総説でもモデル間の定量的比較は限定的であったのに対し、本レビューは 7 軸評価による model-selection matrix (Table 1) を “all models are wrong but some are useful” という Box の格言を踏まえて構築した点が新規な貢献である。また、本研究で初めて統合的に示されたことは、microfluidic chip が AKR1B10 同定 (Liu ら) や proteomics による cisplatin 耐性機序解明 (Xu ら、200+ タンパク) などの clinical insight を既に生み出していることであり、tumor exosome を介した CEMIP の early colonization 促進 (Rodrigues et al. NatCellBiol 2019) が細胞外小胞研究の脳転移応用を具体化した点も novel な発見として位置づけられる。
臨床応用の観点では、各モデルの最適使用文脈が明確化されたことで bench-to-bedside の転換に有用な実践的指針が得られた。具体的には、(1) 薬剤スクリーニング初期には BBB-Transwell + organoid + microfluidic chip の 3-tier pipeline が cost-effective、(2) ICI / cancer vaccine 評価には syngeneic allograft が免疫適格 TME を保持するため first choice、(3) patient-specific precision medicine では PDX + intracarotid injection が structural / histological fidelity を担保、(4) 将来の patient-avatar platform としての 3D bioprinting + AI image analysis + CRISPR-Cas9 の統合が brain metastasis 治療研究の最終 vision となることが示された。臨床的含意として、これらのモデル基盤の preclinical evidence が BBB 透過型 EGFR-TKI、anti-CEMIP 戦略、STING agonist といった脳転移治療薬の開発・評価に直結する。
残された課題として、現状では免疫能とヒト腫瘍 heterogeneity を同時に保持する単一の universal model が存在せず、human CD34+ HSC (hematopoietic stem cell) engraftment NSG + PDX の統合「humanized」approach が active research area となっている。zebrafish のヒトへの外挿可能性は cardiovascular / immune 系の種差から検証が不十分であり、brain organoid に microglia / T cell を統合する protocol の標準化も未確立である。PDMS による hydrophobic absorption バイアスを解消する新素材 (PMMA [polymethyl methacrylate]、COP [cyclic olefin polymer]) の開発も急務である。今後の展望 (future research) として、(a) bio-3D bioprinting による精密細胞配置と cellular cartography、(b) AI / machine learning による imaging data からの early-stage brain metastasis 検出 pipeline、(c) base editor / prime editor を用いた disease-specific precision GEMM の構築、(d) multi-organ-on-chip (lung-BBB-brain) へのバイオマーカー発見統合、が脳転移モデル開発の主要な frontier となる。更なる検討を積み重ねることで、これらの interdisciplinary integration が brain metastasis に対する precision therapy 開発を加速させると本レビューは結論づけている。
方法
Review design: Narrative 比較レビュー。PubMed、Web of Science、Scopus の 3 文献データベースで “brain metastasis model”・“BBB”・“organoid”・“microfluidic”・“syngeneic”・“PDX (patient-derived xenograft)”・“GEMM (genetically engineered mouse model)” 等のキーワードを組み合わせ、各モデルカテゴリ (6 種) の代表的 original research および seminal work を選定した。Systematic search protocol (PRISMA: Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses 準拠) は採用せず narrative review の形式をとるため total selected paper count の明示はないが、各カテゴリで代表論文 5-20 件を精選し質的統合を行った。各カテゴリ内で引用される実験研究の統計手法としては、log-rank test (in vivo 生存曲線・転移頻度比較)、Student’s t-test および one-way ANOVA (analysis of variance)、Fisher’s exact test (転移発生率の二項比較) が主体であり、定量的 meta-analysis は非実施。
モデル分類軸: 6 モデルを (a) cell origin (cell line / primary / patient-derived / genetically engineered)、(b) dimensionality (2D vs 3D)、(c) immune competence (immune-competent vs immunodeficient)、(d) throughput (low / medium / high)、(e) cost、(f) genetic manipulation feasibility、(g) clinical correlation strength の 7 軸で定性的に評価し Table 1 で一覧化した。対象癌種は肺癌・乳癌・黒色腫を主体とし、大腸癌・SCLC (small cell lung cancer) も包含した。