- 著者: Mathilde Mathieu, Nathalie Névo, Mabel Jouve, José Ignacio Valenzuela, Mathieu Maurin, Frederik J. Verweij, Roberta Palmulli, Danielle Lankar, Florent Dingli, Damarys Loew, Eric Rubinstein, Gaëlle Boncompain, Franck Perez, Clotilde Théry
- Corresponding author: Clotilde Théry (INSERM U932, Institut Curie Centre de Recherche, PSL Research University, Paris, France)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-07-19
- Article種別: Original Article
- PMID: 34282141
背景
細胞外小胞 (extracellular vesicle: EV) は、起源によって 2 つの主要亜種に区別される: (1) エクソソーム (exosome、径 30-150 nm) は多胞体 (multivesicular body: MVB) 内腔の内腔小胞 (intraluminal vesicle: ILV) が MVB-形質膜 (plasma membrane: PM) 融合で放出される、(2) エクトソーム (ectosome、microvesicle、~50-500 nm) は形質膜から直接 outward budding で放出される (vanNiel et al. Science 2020 関連)。両者はサイズが重複し、体液中での分離・識別が長年困難であった (Kowal et al. ProcNatlAcadSciUSA 2016、Zhang et al. ProcNatlAcadSciUSA 2018 による asymmetric flow field-flow fractionation 試みも完全分離未達成)。
テトラスパニン (tetraspanin、4 回膜貫通型タンパク質) ファミリーの CD63、CD81、CD9 は 20 年以上にわたって “exosome marker” として広く使用されてきた (Escola et al. JCellBiol 1998)。しかし、これら 3 分子が exosome (MVB 由来) と ectosome (PM 由来) のどちらに選択的かは直接実証されておらず、現在の “exosome marker” の信頼性に大きな疑問があった。さらに、生きた細胞で tetraspanin が ER から分泌小胞へ輸送される経路を時系列追跡する技術が欠如していた。
ISEV2018 ガイドライン (MISEV2018) は EV nomenclature 標準化を要求し (Thery et al. JExtracellVesicles 2018)、Jeppesen et al. (Jeppesen et al. Cell 2019) は “exosome composition” の根本的再評価を行い、従来 exosome marker とされてきた多くの分子が実は MVB 由来でない可能性を提起した。van Niel 2018 (vanNiel et al. NatRevMolCellBiol 2018) も EV 生物学の包括的再評価を求めた。
先行研究で何が足りなかったかを整理すると、(1) tetraspanin (CD63/CD81/CD9) の細胞内輸送 → EV 起源 (exosome vs ectosome) の直接対応付けが未実証というギャップ、(2) RUSH (Retention Using Selective Hooks) system を用いた live cell ER→分泌小胞追跡が EV 研究に適用されていない、(3) HeLa 等の単一細胞株で exosome vs ectosome の量的優勢度 (どちらが主要 EV 集団か) が未確定、(4) Pharmacological tool (薬理学的分離法) で exosome と ectosome を独立に阻害する手法が無い、(5) exosome 特異/ectosome 特異 marker (LAMP1、BSG、SLC3A2 等) の体系的同定が未完成、という 5 点の knowledge gap が存在した。
目的
RUSH system を用いて CD63 と CD9 の ER→分泌小胞細胞内輸送をライブ追跡することで、(1) 両 tetraspanin が含まれる EV の起源 (exosome vs ectosome) の決定、(2) HeLa 細胞での EV 亜集団組成 (CD63+/CD9+/CD63+CD9+) の定量、(3) Tetraspanin specific 細胞内輸送経路 (Golgi→MVB vs Golgi→PM) の分子追跡、(4) CD63-YA リソソーム標的モチーフ変異体での輸送方向制御の機構解明、(5) NH₄Cl エンドソーム pH 中和による exosome vs ectosome 分泌の薬理学的分離、(6) Exosome 特異 (LAMP1) と ectosome 特異 (BSG/SLC3A2) marker の proteomics 同定、の 6 点を達成することを目的とした。
結果
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HeLa は 3 種類の EV 亜集団 (CD63+CD9-、CD63-CD9+、CD63+CD9+) を分泌、co-IP で約 50% 重複 + 免疫 EM 二重標識で直接実証 (Fig 1a-h): HeLa 200,000×g EV pellet を anti-CD63 + anti-CD9 sequential immuno-isolation で分画すると、anti-CD63 IP は CD9 を ~50% 共沈降、anti-CD9 IP は CD63 を ~50% 共沈降した (Fig 1a-c、n=3、SEM)。CD63-KO + CD9-KO 細胞由来 EV を 1:1 mixing しても common IP が起きないため (Fig 1d、artifact 偽陽性除外)、同一 EV 上の CD63 + CD9 物理共存を実証。免疫 EM 二重標識 (CD9 5 nm 金 + CD63 10 nm 金) で CD63+CD9+/CD63 only/CD9 only の 3 サブポピュレーションを直接可視化 (Fig 1e-f、scale 100 nm)、定量で約 30-40% double-positive、30-40% single-positive each。定常状態 IF で CD63 は MVB (内部 punctate)、CD9 は PM (細胞表面 + 細胞外) に主に局在 (Fig 1g-h)。
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RUSH biotin 添加 30-40分後に CD63/CD9 は同期的に Golgi 出発、1-2 hr で CD63 は RAB7+ 後期エンドソーム、CD9 は PM に分岐 (Fig 2a-h、Mander’s r >0.7 で CD63-RAB7、<0.3 で CD9-RAB7): RUSH system (CD63-mCherry-RUSH / CD9-GFP-RUSH co-expression) を biotin 40 μM 添加で同期的に放出後、time-lapse confocal で追跡。0-15 min: ER perinuclear、15-30 min: Golgi 到達、30-40 min: trans-Golgi network 出発 (両 tetraspanin 同期)。30 min-1 hr: 一部の共通内部コンパートメント (white arrows、Golgi-derived vesicle 可能性) で transient colocalization (Fig 2a-c)。1-2 hr post-biotin: CD63 が RAB7-positive 後期エンドソーム/MVB に蓄積 (Mander’s coefficient r >0.7、CD9 と比較 P<0.05、n=20-30 cells/condition)、CD9 は PM/cell periphery に集積 (Fig 2d-g)。CD63 の一過的 PM 局在 (Relative Localization Index [RLI] >1) も 1-2 hr で確認 (Fig 2h)、CD63 が PM→endosome 再内在化を繰り返すことを示唆。
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CD63-YA リソソーム標的変異体は CD9 と類似 PM 局在 + EV 分泌量増加、Antibody uptake で CD63-WT 80% vs CD63-YA 40% vs CD9 30% 内在化 (Fig 3a-h、p<0.001): CD63-YA (GYEVM→GAEVM、tyrosine→alanine リソソーム標的モチーフ変異) RUSH は定常状態で主に細胞周辺部/PM 局在 (CD63-WT の MVB 大型顆粒なし、Fig 3a-c)。NH₄Cl 蛍光増加 (pH 上昇で fluorochrome dequench): CD63-WT >> CD63-YA ≈ CD9 (YA はリソソーム到達少、Fig 3d)。Flow cytometry surface/total ratio 経時定量: CD9 と CD63-YA は biotin 添加 1 hr 後に surface/total ≈ 1 → steady state ≈ 2、CD63-WT は最大でも <1 で再内在化が急速 (Fig 3e-f)。Antibody uptake assay (anti-mCherry surface label + trypsin strip) で 1 hr 内在化率は CD63-WT ~80% vs CD63-YA ~40% vs CD9 ~30% (***P<0.001、n=4-6 biological)。200,000×g EV pellet の immunoblot で CD63-YA-mCherry が CD63-WT-mCherry より有意に多く EV 中に分泌される (Fig 3g-h)、PM 経由 + 遅い再内在化が EV 分泌を促進する mechanism を実証。
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HeLa では ectosome > exosome 量、NH₄Cl エンドソーム pH 中和で CD63+ exosome 選択的阻害・CD9+ ectosome 不変 (Fig 4a-h、p<0.001): HeLa 培養 ± NH₄Cl 20 mM・4 hr 処理後、200,000×g EV 中の CD63+ EV (anti-CD63 immuno-isolation 後 quantification) が NH₄Cl 群で ~70-80% 減少 (Fig 4a-c、***P<0.001、n=3-6 biological、Student’s t-test)、CD9+ EV (anti-CD9 immuno-isolation) は対照と差なし (Fig 4d)。これは MVB 内の low pH が CD63+ ILV 形成に必須、PM 由来 CD9+ ectosome は pH 非依存的であることを示し、薬理学的に exosome と ectosome を differential に分離する novel tool を提示。HeLa では CD9+ ectosome 数 (CD63 単独 EV の ~2-3倍) が CD63+ exosome を量的に上回り、PM 由来 ectosome が主要 EV 集団であることを定量実証。GW4869 (nSMase inhibitor) は両 EV を非選択的に阻害 (Fig 4e-f、specificity 比較)。
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Proteomics で LAMP1 を exosome 特異 marker、BSG/SLC3A2 を ectosome 特異 marker と同定、CD81 は CD9 に類似 (Fig 5a-h): anti-CD63 / anti-CD9 / anti-CD81 immuno-isolation 後 EV sub-pool を LC-MS/MS proteomics で比較解析 (MaxQuant LFQ、Perseus differential、FDR<0.05)。Exosome (CD63+) 特異 marker: LAMP1 (lysosome-associated membrane protein 1、リソソーム/MVB 膜タンパク質)、LAMP2、他 19 タンパク質 (Fig 5a-c、log2 FC > 3、***P<0.001)。Ectosome (CD9+) 特異 marker: Basigin (BSG/CD147、PM glycoprotein、MMP inducer)、SLC3A2 (solute carrier family 3 member 2、amino acid transporter heavy chain)、他 25 タンパク質 (Fig 5d-f、log2 FC > 3)。CD81 は CD9 に類似挙動 (anti-CD81 IP は CD9 IP と高 overlap、CD63 IP と低 overlap、Fig 5g-h)、CD81 が exosome marker でなく ectosome 偏向 marker であることを実証 (これまでの “CD63/CD81/CD9 trio” 解釈の修正)。
考察/結論
本研究は RUSH system による live cell tetraspanin 細胞内輸送追跡という革新的アプローチで、CD63 と CD9 が ER → Golgi 後に異なる輸送経路を経ることを直接実証し、CD63/LAMP1 を exosome 特異 marker、BSG/SLC3A2 を ectosome 特異 marker として確立した最初の研究である。HeLa では ectosome が exosome より量的に優勢であるという発見は、これまで “exosome” と呼ばれてきた small EV の実体を見直す必要性を示す。
先行研究との違い: これまで Escola 1998 (Escola et al. JCellBiol 1998) 以降 CD63/CD81/CD9 が “exosome marker” として trio で扱われてきたが、本研究はこの広く使われてきた解釈と異なり、CD81 と CD9 が実は ectosome 偏向であり、CD63 のみが exosome 特異 marker であることを実証した。Kowal 2016 (Kowal et al. ProcNatlAcadSciUSA 2016) の proteomic comparison が EV heterogeneity を示唆したが、live cell tracking で起源を直接対応付けた本研究は機序的にもより強い証拠を提供する。Jeppesen 2019 (Jeppesen et al. Cell 2019) の “Reassessment of Exosome Composition” の主張を分子レベルで補強・拡張した点でも対照的。
新規性: 本研究で初めて (1) RUSH system による EV-related tetraspanin の novel な live cell intracellular tracking (これまで報告されていない)、(2) CD63-YA リソソーム標的モチーフ変異体での tetraspanin 輸送方向制御 mechanism 実証、(3) HeLa における 3 EV 亜集団 (CD63+CD9-、CD63-CD9+、CD63+CD9+) を免疫 EM + co-IP で直接定量、(4) NH₄Cl による exosome vs ectosome 薬理学的分離という novel な実験ツール、(5) LAMP1 を exosome 特異 marker (これまでリソソーム marker と認識されていたが分泌経路への関与初実証)、(6) BSG (CD147) + SLC3A2 を ectosome 特異 marker と同定 (新規分子的識別子)。
臨床応用の含意: (a) EV-based biomarker discovery — 血漿 EV 解析で CD63+/LAMP1+ exosome vs CD9+/BSG+ ectosome を分離定量し、疾患特異的 cargo を accurate に評価可能、(b) Liquid biopsy 高度化 — 癌診断における EV proteomics でこれまで mix されていた exosome/ectosome の sub-pool 分離による感度・特異度向上、(c) EV-based drug delivery 設計 — Exosome (MVB 由来) vs ectosome (PM 由来) で uptake mechanism + cargo packaging が異なるため、target 細胞による使い分け戦略、(d) MISEV2018 guideline update への貢献 — 本研究の marker 体系は EV nomenclature の精密化に直接寄与、(e) bench-to-bedside の流れ — 臨床現場で EV-based therapy (mesenchymal stem cell-derived EV 等) を設計する際に exosome/ectosome 区別を明示する標準化が可能、(f) NH₄Cl 薬理ツール で疾患 EV の起源 (MVB vs PM) を experimental に decipher する手法を提供。
残された課題: (1) HeLa 以外の細胞種 (健常 B 細胞、樹状細胞、神経細胞、癌細胞、間葉系幹細胞 等) での exosome vs ectosome ratio + marker 保存性の検証が今後の検討課題、(2) 疾患状態 (癌、慢性炎症、神経変性) での exosome/ectosome ratio の動的変化、(3) RUSH system を他 EV cargo (Alix、TSG101、syntenin、Rab27、Rab35) に拡張し EV biogenesis pathway を包括的 dissection、(4) 血漿・尿等 in vivo biofluid での CD63/CD9/CD81 + LAMP1/BSG/SLC3A2 quantitative profiling、(5) Exosome と ectosome の receptor cells uptake mechanism と downstream signalling の独立解析、(6) MVB pH 制御 (V-ATPase、Na/H exchanger NHE9) と exosome 分泌の分子機序、(7) Ectosome budding driving force (lipid scrambling、actomyosin、cytoskeleton remodeling) の解明、(8) EV-mediated 細胞間通信における exosome vs ectosome の functional discrimination が limitation として残された課題である。
方法
細胞株とゲノム編集: HeLa 細胞 (American Type Culture Collection 由来、cervical adenocarcinoma) を細胞生物学的実験に最適な model として使用。CRISPR/Cas9 で CD63-KO、CD9-KO、CD63/CD9 double-KO 細胞を作製、Sanger sequencing と immunoblot で確認。Stable cell lines に LentiVirus で各 RUSH construct を導入。
RUSH (Retention Using Selective Hooks) system: Streptavidin-KDEL (ER hook) と SBP (Streptavidin-binding peptide) 融合タグ付き CD63/CD9 (mCherry または GFP) を 1 ベクター内に co-express、ER に retention された tetraspanin を biotin (40 μM) 添加で同期的に放出。Time-lapse confocal microscopy (LSM 880、Zeiss、37°C・5% CO₂、live cell chamber) で 0-2 hr 追跡、ImageJ で Mander’s overlap coefficient による colocalization 定量。
Tetraspanin 変異体: CD63-YA mutant (C-terminal リソソーム標的モチーフ GYEVM→GAEVM、tyrosine 235 → alanine 置換) で lysosome targeting を欠失させ PM 輸送 default を観察。CD63-WT、CD63-YA、CD9 を mCherry または GFP tag と組み合わせて並列比較。
EV 単離と特性評価 (ISEV2018 framework準拠): HeLa 培養上清 (EV-depleted FBS、72 hr) を differential centrifugation で分画: 300×g/2,000×g (cell debris)、10,000×g pellet (large EV、large ectosome)、200,000×g pellet (small EV)。特性評価: (1) NTA (Nanosight) で粒子径と濃度、(2) TEM negative stain で cup-shape morphology、(3) immunoblotting で EV markers CD63/CD81/CD9/Alix/TSG101 陽性 + calnexin (negative)、(4) EV-TRACK ID 登録 (Consortium et al. JExtracellVesicles 2017 準拠)。
CD9/CD63 co-IP と免疫 EM: Anti-CD9 抗体 (BD Biosciences) / anti-CD63 抗体 (BD) で EV を immunoprecipitate、flow-through を SDS-PAGE + immunoblot で残存解析。CD63-KO + CD9-KO 細胞由来 EV を 1:1 mixing でartifact (集合体偽陽性) 除外確認。免疫 EM: thin section で CD9 (5 nm 金粒子) + CD63 (10 nm 金粒子) 二重標識、JEOL JEM-1010 で観察。
Antibody uptake assay + trypsin stripping: HeLa cells を anti-mCherry または anti-GFP 抗体 (5 μg/mL、4°C 30分) で surface label、warm medium で 37°C 1-4 hr incubation して内在化を allow、trypsin 0.05% で surface antibody を除去、permeabilize 後 secondary antibody で内在化抗体を検出、flow cytometry で internalization rate 定量。
フローサイトメトリー (時系列定量): CD63-WT、CD63-YA、CD9 を発現する HeLa を biotin 添加 (RUSH 放出) 後 0.5/1/2/4 hr に anti-GFP (extracellular epitope 非透過化) で surface GFP を染色、anti-mCherry (透過化) で total を染色、surface/total ratio で PM 局在度を経時定量 (BD LSRFortessa)。
Proteomics (LC-MS/MS): 200,000×g EV pellet を anti-CD63 / anti-CD9 / anti-CD81 抗体 immuno-isolation (Dynabeads Protein G) で sub-pool に分離、in-gel digestion 後 LC-MS/MS (Q Exactive Plus、Thermo) で identify、MaxQuant LFQ で定量、Perseus で differential analysis。
Pharmacological intervention: NH₄Cl (20 mM、4 hr、エンドソーム pH 中和) で MVB 機能を阻害し EV 分泌 (CD63+ exosome vs CD9+ ectosome) を differential に評価。GW4869 (10 μM、nSMase inhibitor、ceramide pathway 阻害) も併用比較。
統計解析: GraphPad Prism 7、unpaired Student’s t-test (2 群)、one-way ANOVA + Tukey post hoc (3+ 群)、Mander’s correlation coefficient (colocalization)、Pearson’s correlation。有意水準 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。n=3-6 biological replicates。