- 著者: Moshe Sade-Feldman, Keren Yizhak, Stacey L. Bjorgaard, John P. Ray, Carl G. de Boer, Russell W. Jenkins, David J. Lieb, Jonathan H. Chen, Dennie T. Frederick, Michal Barzily-Rokni, Samuel S. Freeman, Alexandre Reuben, Paul J. Hoover, Alexandra-Chloé Villani, Elena Ivanova, Andrew Portell, Patrick H. Lizotte, Amir R. Aref, Jean-Pierre Eliane, Marc R. Hammond, Hans Vitzthum, Shauna M. Blackmon, Bo Li, Vancheswaran Gopalakrishnan, Sangeetha M. Reddy, Zachary A. Cooper, Cloud P. Paweletz, David A. Barbie, Anat Stemmer-Rachamimov, Keith T. Flaherty, Jennifer A. Wargo, Genevieve M. Boland, Ryan J. Sullivan, Gad Getz, Nir Hacohen
- Corresponding author: Gad Getz (Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA); Nir Hacohen (Massachusetts General Hospital / Broad Institute, Boston/Cambridge, MA, USA)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-11-01
- Article種別: Original Article
- PMID: 30388456
背景
抗PD-1、抗CTLA-4などの免疫チェックポイント阻害剤 (ICB) は、メラノーマ治療に革命をもたらし、進行メラノーマにおいて高い奏効率を示している。しかし、多くの患者は治療に不応であるか、あるいは獲得耐性により疾患が進行し死亡に至る。ICB治療の成功または失敗に関連する因子を特定することは、免疫療法の理解と適用拡大のために喫緊の課題である。これまでに、応答予測因子として、腫瘍浸潤CD8+ T細胞の密度 (Tumeh et al. Science 2014)、IFN-γ応答シグネチャー (Ayers et al. 2017)、部分的に疲弊したCD8+ T細胞の頻度 (Daud et al. 2016)、血中T細胞再活性化の程度 (Huang et al. 2017) などが報告されてきた。しかし、腫瘍内のT細胞の「状態 (state)」が治療応答をどのように規定するのか、またどのT細胞状態が効果的な応答に必須であるのかについては、依然として未解明な点が多かった。
T細胞疲弊 (T cell exhaustion) は、慢性的な抗原曝露によって誘導されるT細胞の機能不全状態であり、その不均一性、特に「最終的に疲弊したT細胞 (terminally exhausted T cells)」と「前駆体/メモリー様T細胞 (progenitor/memory-like T cells)」の区別は、マウスのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) 感染モデルで徐々に解明されつつあった (Im et al. 2016; Utzschneider et al. 2016)。しかし、これらのT細胞状態がヒト腫瘍において単細胞レベルでどのように定義され、ICB治療応答と関連するのかについては、詳細な解析が不足していた。従来のバルク腫瘍生検や限られたマーカーセットを用いた研究では、個々の細胞の正確な状態を特定することが困難であり、チェックポイント阻害剤に対する応答の細胞基盤を解釈する能力が制限されていた。この知識ギャップを埋めるためには、高次元の単一細胞解析技術を適用し、腫瘍微小環境における免疫細胞の多様な状態を包括的に解明する必要があった。特に、PD-1ブロックがT細胞の機能不全を克服するメカニズムは、依然として詳細には理解されていない。また、治療応答を予測する信頼性の高いバイオマーカーの確立も急務であった。
目的
本研究の目的は、免疫チェックポイント阻害薬治療を受けたメラノーマ患者の治療前および治療中の腫瘍から分離したCD45+免疫細胞を単一細胞レベルで解析し、治療応答または非応答に関連する特定の細胞状態を定義することである。具体的には、以下の点を目的とした。
- メラノーマ腫瘍微小環境における免疫細胞の多様な構成と、それがICB治療への応答とどのように関連するかを包括的にマッピングすること。
- 特にCD8+ T細胞集団において、治療応答を予測する特徴的な細胞状態を同定し、その分子プロファイルを詳細に解析すること。
- 同定されたT細胞状態に関連する転写因子やエピジェネティックな制御メカニズムを解明すること。
- 腫瘍組織における特定のT細胞マーカーの頻度が、独立したコホートにおいてICB治療への臨床応答および患者の生存を予測するバイオマーカーとして機能するかを検証すること。
- 疲弊したT細胞の機能を再活性化させるための新規治療標的を同定し、in vitroおよびin vivoモデルにおいてその治療効果を検証すること。 これらの目的を達成することで、ICB治療の成功と失敗の根底にある細胞メカニズムを理解し、より効果的な治療戦略の開発と、患者層別化のためのバイオマーカーの同定に貢献することを目指した。
結果
免疫細胞のクラスタリングと治療応答との関連: scRNA-seq解析により、16,291個のCD45+免疫細胞が11の主要なクラスターに分類された (B細胞、形質細胞、単球/マクロファージ、樹状細胞、NK細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞など) (Fig 1B)。奏効群の病変ではB細胞、メモリー様T細胞、ナイーブ様T細胞が富化しており、非奏効群の病変では終末分化マクロファージや疲弊したT細胞が富化していることが示された (p=0.003 for G1 B cells, p=0.03 for G10 T cells in responders; p=0.003 for G3 myeloid cells, p=0.005 for G6 T cells, p=1.3 x 10⁻⁵ for G11 T/NK cells in non-responders) (Fig 1D)。特に、LAG3、PDCD1、HAVCR2、TIGIT、CD38、ENTPD1などのT細胞疲弊関連遺伝子を多く発現するクラスター (G6、G11) は非奏効病変で有意に富化していた。疲弊T細胞シグネチャーは非奏効病変で有意に濃縮され (p=0.002)、活性化T細胞シグネチャーは奏効病変で濃縮された (p=2 x 10⁻⁴) (Fig 1E)。
CD8+ T細胞の2つの主要な状態の同定: CD8+ T細胞 (n=6,350 cells) をさらに詳細にサブクラスタリングした結果、2つの主要な細胞状態が同定された (Fig 2A)。一つは「CD8_G」と命名され、IL7R、TCF7、REL、FOXP1などのメモリー、活性化、細胞生存に関連する遺伝子の発現が高く、共抑制分子の発現が低い特徴を持つ。もう一つは「CD8_B」と命名され、CD38、HAVCR2、ENTPD1、PDCD1、BATF、LAG3、CTLA4などのT細胞疲弊に関連する遺伝子の発現が高い特徴を持つ (Fig 2B)。奏効病変ではCD8_G細胞が有意に富化しており (CD8+ T細胞中の58% vs 非奏効群の26%、p=1.4 x 10⁻⁶)、非奏効病変ではCD8_B細胞が富化していた (p=0.005) (Fig 2C)。ほとんどの奏効患者ではCD8_G/CD8_B比が1を超え、非奏効患者では1未満であった。抗原提示経路またはIFN-γ経路に欠陥があることが知られている6つの非奏効サンプルを除外すると、CD8_G/CD8_B比による応答予測能はさらに向上し、AUC (Area Under the Curve) は0.95 (p=3.8 x 10⁻⁷) に達した。
TCF7陽性CD8+ T細胞のバイオマーカーとしての有用性: TCF7はCD8_G細胞で高頻度に発現するトップマーカーとして同定された。独立した抗PD-1治療メラノーマ患者コホート (n=33 patients) のFFPE組織切片を用いた免疫蛍光染色により、CD8+ T細胞中のTCF7陽性細胞の頻度が高い患者は、応答率が有意に高く (p=3.9 x 10⁻⁶)、全生存期間も延長することが示された (ハザード比 (HR) 約0.4、ログランクp=0.03) (Fig 3H)。TCF7+CD8+ T細胞の比率による応答分類の予測能は高く、AUCは0.91 (p=2.4 x 10⁻⁶) であった (Fig 3G)。TCF7+CD8+ T細胞は腫瘍巣内にも浸潤しており、間質に限定されるものではなかった。
TCRクローン性とT細胞状態間の関係: TCRシーケンス解析により、CD8_GとCD8_Bの間でTCRクローンタイプが共有されていることが示され、これらが同一クローン由来の異なる分化状態であることを示唆した (Fig 7)。奏効群ではCD8_G細胞におけるクローン拡大が優位であり、非奏効群ではCD8_B細胞におけるクローン拡大が優位であった。特に、TCF7+のCD8_G細胞は、疲弊細胞の前駆体として機能する「progenitor/stem-like」な性質を持つ可能性が示唆された。また、治療後に主に検出されるCD8_5クラスターのT細胞は、ベースラインサンプルとのTCR共有がほとんどなく、腫瘍外で生成され、その後腫瘍に遊走する可能性が示唆された。
エピジェネティックな景観と転写因子ネットワーク: ATAC-seq解析により、CD39+TIM3+ (DP) 細胞とCD39-TIM3- (DN) 細胞 (n=5 patients) の間でクロマチンアクセシビリティパターンが顕著に異なることが明らかになった (Fig 6C)。DP細胞ではPD-1、Tim-3、LAG-3、CD39などの疲弊関連遺伝子のプロモーター領域が開いている一方、DN細胞ではTCF7、LEF1、IL7R、SELLなどのメモリー関連遺伝子のプロモーター領域が開いていた (Fig 6D)。SCENIC解析では、DN細胞はTCF7、LEF1、FOXO1による制御ネットワークが、DP細胞はTOX、EOMES、BATF、IRF4による疲弊プログラムがそれぞれ制御していることが示された。BATFとTCF7は、それぞれDPとDN細胞において最も高いピークモチーフ濃縮と発現を示し、これらの転写因子が各細胞状態に特有の主要遺伝子の発現を制御していることが示唆された (Fig 6E)。DP細胞では858個の差次的アクセシブル領域が、DN細胞では424個の領域が同定された (FDR < 0.01)。
CD39 (ENTPD1) を新規治療標的として同定: 疲弊したCD8_B細胞で高発現するCD39 (ATPをAMPに変換し免疫抑制を誘導するエクトヌクレオチダーゼ) に着目した。in vitroのPDOTS 3D培養モデルにおいて、CD39阻害剤 (POM-1) は抗PD-1単剤の効果を増強し、抗CTLA-4、抗Tim-3、抗LAG-3のいずれとの併用でも相乗効果を示した。B16F10マウスモデル (n=5 mice per group) を用いたin vivo実験では、抗CD39抗体と抗PD-1抗体の併用が、単剤療法と比較して腫瘍増殖抑制と生存期間延長を顕著に増強した (p<0.01) (Fig 5F, 5G)。この併用療法は、腫瘍内のCD8+ T細胞浸潤を増加させ、CD39+疲弊細胞の頻度を減少させる効果も確認された。CD39阻害剤の効果はCD8+ T細胞に依存的であり、IFN-γ産生CD8+ T細胞の頻度増加 (p=0.04) とT細胞増殖の促進が観察された。抗CD39抗体と抗PD-1/CTLA4のトリプル併用療法では、40日目の生存率が60%に達し、単剤療法や二重併用療法と比較して顕著な改善を示した (Fig 5K)。
考察/結論
本研究は、ヒトメラノーマにおける免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) 治療応答の単細胞基盤を詳細に定義し、CD8+ T細胞集団内に存在する「TCF7陽性メモリー様前駆細胞 (TCF7+ memory-like progenitor)」と「TCF7陰性疲弊終末分化細胞 (TCF7- exhausted terminal cell)」という二分された状態が、ICB応答の決定因子であることを明らかにした。TCF7+ CD8+ T細胞は自己再生能を保持し、ICBによる再活性化に応答可能な「再生可能プール」として機能し、その腫瘍内頻度がICB応答の強力な予測バイオマーカーとなることを示した。この発見は、マウスLCMV感染モデルで提唱されたTCF7+ progenitor exhausted cellの概念をヒト腫瘍へと拡張する重要な業績である (Im et al. 2016; Utzschneider et al. 2016)。
先行研究との違い: これまでの研究では、バルク腫瘍の遺伝子発現データを用いてIFN-γシグネチャーやT細胞活性化/疲弊シグネチャーが応答と関連することが示されてきたが (Ayers et al. 2017; Prat et al. 2017; Riaz et al. 2017)、本研究は単一細胞レベルで個々のT細胞の状態を区別することで、単なるT細胞浸潤の増加ではなく、特定のT細胞状態のバランスが応答を規定することを明らかにした点で、これまでの報告とは対照的である。
新規性: 本研究で初めて、TCF7がヒトメラノーマにおけるICB応答予測の単一転写因子バイオマーカーとして機能することをin situで検証した。また、疲弊T細胞で高発現するCD39 (ENTPD1) を新規治療標的として同定し、CD39阻害が他のチェックポイント阻害剤との併用で抗腫瘍免疫を増強する可能性をin vitroおよびin vivo (n=5 mice per group) で初めて実証した。
臨床応用: 本研究の知見は、複数の臨床的意義を持つ。第一に、FFPE組織の免疫蛍光染色によるTCF7+CD8+ T細胞の頻度測定は、既存のPD-L1 TPS (Tumor Proportion Score) などとは独立した、実装可能なICB応答予測バイオマーカーとなる。これは、患者層別化と治療選択の最適化に貢献する可能性がある。第二に、CD39は腫瘍T細胞疲弊の新規標的であり、抗CD39抗体と他のチェックポイント阻害剤との併用療法は、疲弊T細胞の再プログラムを促し、メラノーマおよび他の癌種における新たな治療戦略として有望である。これは、抗CD39抗体の臨床試験を強く動機付けるものである。
残された課題: 今後の検討課題として、いくつかの点が残されている。第一に、TCF7+からTCF7-へのT細胞分化を決定する転写因子 (TOX、NR4A、BATFなど) の治療的モジュレーションの可能性をさらに探る必要がある。第二に、組織常在メモリーT細胞 (TRM) とTCF7+ progenitor T細胞の関係を解明することが重要である。第三に、本研究で同定されたTCF7+比率の予測価値が、非小細胞肺癌や大腸癌MSI-Hなどの他の癌種や異なる免疫療法レジメンにおいても一般化可能であるかを検証する必要がある。第四に、ネオアジュバント設定や養子細胞療法製品において、TCF7+細胞の比率を最適化する戦略 (例: IL-7やIL-15経路の利用) の検討が求められる (Hurton et al. 2016; Shum et al. 2017)。最後に、CD39阻害剤 (表面酵素阻害) の安全性プロファイルと至適用量を臨床的に確立することが今後の課題である。本研究は、腫瘍T細胞の評価を単なる細胞数から細胞状態の質へと転換させ、Pardoll et al. NatRevCancer 2012が提唱した免疫チェックポイント阻害のメカニズム解明に貢献し、免疫療法開発の基礎パラダイムを更新した点で、重要な貢献である。
方法
Discovery cohortにおける単一細胞RNAシーケンス解析: 抗PD-1または抗CTLA-4治療を受けたメラノーマ患者32例から採取された48個の腫瘍検体 (17個が奏効、31個が非奏効) から、合計16,291個のCD45+免疫細胞を単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq; Smart-seq2プロトコル) で解析した。患者の応答はRECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) 基準 (Eisenhauer et al. EurJCancer 2009) に基づいて分類された (complete response (CR) およびpartial response (PR) を奏効、stable disease (SD) およびprogressive disease (PD) を非奏効)。品質管理後、各細胞から中央値2,588個の遺伝子が検出された。
バイオインフォマティクス解析: scRNA-seqデータは、SeuratおよびPhenographクラスタリングアルゴリズムを用いて解析され、t-SNE法により次元削減と可視化が行われた。遺伝子発現の差分解析にはFisher’s Exact testが用いられ、Benjamini-Hochberg法によるFDR補正が行われた。転写因子活性の推定にはSCENIC解析が、遺伝子セット濃縮解析にはGSEAおよびMSigDBが利用された。CD8+ T細胞の分化経路を推定するため、Monocle v. 2.5.4を用いた軌跡解析が実施された。
TCRシーケンス解析: 各T細胞のTCR配列は、scRNA-seqデータからMiXCRツールを用いて再構築された (Bolotin et al)。これにより、同一患者の治療前後サンプル間で検出される「persistent TCR」、単一サンプル内で複数T細胞に検出される「enriched TCR」、単一T細胞のみに検出される「singlet TCR」、および複数患者間で共有される「common TCR」の4種類のクローン性パターンが定義され、各T細胞状態と臨床転帰との関連が解析された。
Validation cohortにおけるTCF7の検証: 独立した抗PD-1治療メラノーマ患者コホート (n=33患者、43検体) のFFPE腫瘍組織切片に対し、免疫蛍光 (IF) 染色を用いてDAPI、CD8、およびTCF7の発現が評価された。CellProfilerソフトウェアを用いた自動画像解析により、CD8+ T細胞中のTCF7陽性細胞の頻度が定量され、ICB応答および全生存期間との関連がKaplan-Meier曲線とログランク検定で評価された。
エピジェネティック解析: フローサイトメトリーでソーティングされたTCF7陽性/陰性CD8+ T細胞、またはCD39+TIM3+ (DP) およびCD39-TIM3- (DN) CD8+ T細胞 (n=5患者) のクロマチンアクセシビリティは、ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) により比較された。Bowtie 2.2.1 (Langmead et al. NatMethods 2012)とSamtools 1.3 (Li et al. Bioinformatics 2009)を用いてリードがアラインされ、Homerバージョン4.9を用いてピークが同定された (Heinz et al. MolCell 2010)。EdgeR 3.14.0 (Robinson et al. Bioinformatics 2010)を用いて差次的アクセシビリティ領域が特定され、GREATおよびCIS-BPデータベースを用いて転写因子モチーフが解析された。
機能的検証: 3D患者由来オルガノイド腫瘍スフェロイド (PDOTS) およびマウスB16F10メラノーマ皮下モデルを用いて、CD39 (ENTPD1) 阻害剤 (POM-1、抗CD39抗体) と抗PD-1、抗Tim-3、抗LAG-3抗体の単剤または併用治療の効果が評価された。MDOTS (Murine-derived Organotypic Tumor Spheroids) システムでは、CT26 GFP+細胞とソーティングされたCD8+ T細胞サブセット (DNまたはDP) を共培養し、抗PD-1抗体存在下での腫瘍細胞死が評価された。B16F10マウスモデルでは、腫瘍増殖抑制と生存期間が測定され、CD8+ T細胞浸潤とサイトカイン産生がフローサイトメトリーで解析された。