- 著者: Nicole de Buhr, Maren von Köckritz-Blickwede
- Corresponding author: Nicole de Buhr (nicole.de.buhr@tiho-hannover.de); Maren von Köckritz-Blickwede (maren.von.koeckritz-blickwede@tiho-hannover.de) (Department of Physiological Chemistry & Department of Infectious Diseases, Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), University of Veterinary Medicine Hannover, Germany)
- 雑誌: Journal of Immunology Research
- 発行年: 2016
- Epub日: 2016-04-14
- Article種別: Review
- PMID: 27294157
背景
Brinkmann et al. Science 2004によって発見された好中球細胞外トラップ (NETs)は、核DNA、ヒストン、顆粒タンパク質からなる細胞外網状構造であり、病原体捕捉、自己免疫、敗血症、癌転移など多様な病態に関与することが報告されている (Brinkmann et al. 2004; Fuchs et al. 2007; Kessenbrock et al. 2009; Cools et al. 2013)。NETsの可視化手法は免疫蛍光顕微鏡、SEM (走査型電子顕微鏡)/TEM (透過型電子顕微鏡)、ライブセルイメージング、フローサイトメトリー、PicoGreen蛍光分光など多岐にわたるが、手法間の感度、特異度、バイアスプロファイルの比較と分類体系が不在であり、論文間での再現性が低いという課題が残されていた。加えて、古典的な細胞溶解を伴うsuicidal NETosis (Brinkmann型)、細胞生存を維持したまま核DNAを小胞放出するvital NETosis、およびミトコンドリアDNA放出型の3つのNET形成機構が同定され、各機構を区別して検出できる方法論的枠組みが求められていた。これらの背景から、NETs研究の進展には、既存の可視化・定量化手法の包括的な評価と、新たな標準化されたアプローチの確立が不足しているという課題が残されていた。例えば、NETsは寄生虫 (Abi Abdallah et al. 2012)、ウイルス (Saitoh et al. 2012)、真菌 (Urban et al. 2006)、細菌 (McCormick et al. 2010) などの様々な病原体を捕捉することが示されており、宿主免疫防御において重要な役割を担う。しかし、NETsの不適切な排除は、全身性エリテマトーデス (SLE) や全身性血管炎 (SVV) などの自己免疫疾患、血栓症、癌などの非感染性疾患においても有害な結果をもたらすことが示唆されている (Knight et al. 2012; Fuchs et al. 2010; Cools et al. 2013)。このため、NETsの形成と分解の間のバランスが、健康と疾患の両方において重要である。DNaseによるNETs分解の障害は、ループス腎炎などの自己免疫疾患と関連しており、DNase欠損個体はSLEを発症しやすいことが報告されている (Hakkim et al. 2010)。これらの複雑な病態におけるNETsの役割を正確に理解するためには、信頼性の高い可視化・定量化手法が不可欠である。
目的
NETsのin vitro、in situ、ex vivo、in vivo、intravitalでの可視化と定量化に用いられる全ての顕微鏡技術とアッセイを系統的にレビューし、各手法の利点、限界、および適切な適用範囲を比較することで、NETs研究の標準化に向けた指針を提供することを目的とする。また、suicidal NETosis、vital NETosis、ミトコンドリアDNA放出型という3つのNETs形成機構に応じて、最適な方法選択の推奨を提示する。本レビューは、NETs研究における既存の技術的課題を解決し、将来の研究の方向性を示すことを目指す。
結果
NETs形成の3機構と手法選択への影響: 古典的なsuicidal NETosisはNADPHオキシダーゼ依存性であり、3〜4時間かけて核膜崩壊、クロマチン脱凝縮、細胞死を伴う。一方、vital NETosisは小胞放出型で5〜15分と迅速であり、細胞生存を保持し、酸化バースト非依存性である。さらに、ミトコンドリアDNA放出型は生存好中球からミトコンドリアDNAのみが放出される。これらの3つのNETs形成機構は異なる動態と分子メカニズムを持つため、単一の手法では全ての機構を網羅的に検出することは困難である。例えば、Fuchs et al. JCellBiol 2007はTEMを用いてsuicidal NETosisの詳細な動態をライブセルイメージングで示し、核膜崩壊が刺激後約60分で開始され、細胞死に至るまで平均3.5時間を要することを示した (Table 1)。
DNA染色色素の限界と抗体ベース免疫蛍光の優位性: SYTOX (シアニン色素)、DAPI (4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)、HoechstなどのDNA染色色素は、壊死とNETosisの区別に有用であるが、LL-37などのカチオン性抗菌ペプチドがDNA色素の結合を阻害する重要な限界がある (Table 1)。SYTOX存在下でNETs形成自体が阻害される可能性もあるため、並行したサンプル調製が必要である。また、観察者バイアスも高く、自動画像解析（ImageJや専用オープンソースツール）との併用が推奨される。これに対し、抗ヒストン、抗MPO、抗NE (好中球エラスターゼ)、抗H3cit (シトルリン化ヒストンH3)などの抗体を用いた免疫蛍光法は、カチオン性抗菌ペプチドの干渉を回避でき、色素よりも感度が高い。しかし、抗H3cit単独ではH3cit非依存性NETs形成（PAD4非依存経路）を見落とす可能性があるため、MPO + H3cit + DNAなどの複数マーカー共染色により特異度を向上させることが推奨される (Table 1)。例えば、PAD4欠損マウスではH3citレベルが野生型と比較して約50%減少することが報告されている。
フローサイトメトリーとイメージングフローサイトメトリーの応用: フローサイトメトリーは高スループットで自動化されており、数千細胞規模で観察者バイアスなく解析できるが、H3cit抗体法はH3cit非依存性NETsを見落とす可能性がある。Gavillet et al. AmJHematol 2015は、H3citとMPOに対する抗体を用いたフローサイトメトリーアッセイを開発し、Rac2-/-およびPAD4-/-マウスモデルでNETosisの有意な障害 (約50%減、p<0.001) を検出した (n=3 replicates)。イメージングフローサイトメトリーは、vital NETosisとsuicidal NETosisの区別が可能な唯一の手法であるが、既に溶解した細胞を見落とす限界がある。この手法は、単一細胞解析と組み合わせることで、個別のNETsイベントの特性評価に推奨される (Table 1)。この方法では、NETs形成中の細胞を約70%の精度で特定できることが示されている。
電子顕微鏡 (SEM/TEM) の役割とピットフォール: SEM/TEMは優れた形態学的詳細を提供し、NETsの三次元構造の可視化に唯一有効である。しかし、フィブリンがSEMでNETsを模倣するという重大なピットフォールがあるため、蛍光顕微鏡との併用による検証が必須である。生体試料ではアーティファクトの混入も多く、in vitroの制御されたシステムでの標準にとどまることが多い。例えば、Brinkmann et al. Science 2004はTEMを用いてNETsの形態を詳細に記述し、細菌を捕捉する網状構造を明確に示した。また、KrautgartnerとVitkovはRR-OsO4 (ルテニウムレッド・四酸化オスミウム) 染色技術を報告し、TEMによるNETsと細菌の相互作用解析を改善した。
PicoGreen蛍光分光法の感度限界と実験カテゴリー分類の提案: PicoGreenは細胞外DNA定量における高スループットスクリーニングに適するが、1時間で20%未満の微小なNETs集団を検出できないという感度限界がある。壊死性DNA放出との区別ができず、顕微鏡による検証との併用が必須である。本レビューでは、標準化のため、in vitro (培養条件)、in situ (固定組織)、ex vivo (最小操作の単離細胞/生検)、in vivo (生体全体)、intravital (生体内ライブイメージング) の5カテゴリーに分類するフレームワークを提唱した (Table 2)。各カテゴリーで適用可能な手法と必要な検証ステップを明文化し、in vivo研究の重要性を強調している (Table 3)。in vivo研究では、Kessenbrock et al. NatMed 2009が自己免疫性血管炎患者の腎生検組織でNETsを免疫蛍光法で検出し、Cools-Lartigue et al. JClinInvest 2013はマウスモデルにおいて循環腫瘍細胞のNETsによる捕捉と転移促進をin vivoで示した (n=12 mice)。これらの研究は、NETsが疾患病態に深く関与していることを裏付けている。
in vivoおよびin situでのNETs検出の進展: in vitroでのNETs可視化が成功している一方で、in vivoデータが限られているため、NETsの生理学的関連性には疑問が呈されてきた。しかし、近年、多くの研究グループが固定組織切片や血液サンプル中のNETsを正常に染色している。これには、in vitroでのNETs可視化と同様の免疫蛍光顕微鏡技術が用いられ、DNAインターカレート色素とNETs成分に対する抗体を組み合わせてin vivoでのNETsの存在が示されている (Table 3)。例えば、ヒトの自然発生性虫垂炎では、好中球エラスターゼ、ヒストン、DNAの共染色により細胞外線維状物質中のNETs成分が検出された。また、子癇前症の研究では、正常胎盤と比較して子癇前症胎盤でNETs形成の増加が検出されている (n=54)。感染症の例として、マウス皮膚生検では、化膿性レンサ球菌M1のsda1欠損変異株感染後にNETsの染色が行われた。肺炎球菌感染モデルでは、マウス肺炎におけるNETs検出が成功し、黄色ブドウ球菌感染肺の解析では、放出されたNETsが抗菌ペプチドで装飾されていることが明らかになった。これらのin vivoおよびin situ実験は、in vitro実験と比較してNETs線維の検出量が少ない傾向にあるが、宿主内でのNETs誘導と排除の複雑な時間依存的制御プロセスに影響される可能性がある。しかし、これらの研究はNETs機能と様々な疾患の病態におけるNETsの役割の理解に貢献している。
ライブセルイメージングによるNETs形成動態の解明: NETosis中のNETs放出と進行中のプロセスを理解するための最適な方法は、ライブセルイメージングによる解析である。2006年には、Buchanan et al.が細菌DNase (デオキシリボヌクレアーゼ) 産生、NETs分解、病原性の間の相関関係を、組織病理学的顕微鏡検査とDNAインターカレート色素を用いたライブセルイメージングを比較することで示した (n=3 replicates)。その後、2007年には、PMA活性化好中球が位相差、Calcein Blue (生細胞色素)、Annexin V (細胞死マーカー)、およびヒストンマーカーの組み合わせを用いて経時的にライブセルイメージングでモニタリングされた。このライブイメージング研究により、好中球がNETsを放出する際に能動的な細胞死を遂げることが結論付けられた。さらに、生存好中球からのミトコンドリアDNA放出も、異なるDNAインターカレート色素の混合物を用いたライブセルイメージングでモニタリングされた。他のいくつかの例では、宿主-病原体相互作用、生化学的プロセス、およびNETosis中の経路ステップに焦点を当てたライブセル蛍光顕微鏡による好中球刺激後のNETs放出が調査されている。動物の安楽死直後に選択された臓器を固定せずに実施されるライブセルイメージングは、in situ NETs検出の特殊なケースである。アスペルギルス・フミガータス感染肺における二光子顕微鏡法を用いて、NETsがリアルタイムでin situで検出された。このため、感染マウスの肺葉を調製、解剖し、SYTOX色素で直接可視化した。ライブイメージング中、肺は37℃のPBSに浸漬された。別の興味深い例は、患者材料から採取直後の体液の解析であり、NETsのex vivo解析を可能にする。このアプローチを用いて、痛風患者の滑液からNETsが検出された (n=12 patients)。
Intravital顕微鏡法によるin vivo NETs形成のリアルタイム観察: in vivoで生存するNETs形成細胞のリアルタイム記録は、NETs形成の研究における大きな進歩であった。2007年には、Clark et al.が肝臓類洞のintravital顕微鏡法を用いて、血小板活性化に応答して好中球がNETsを放出することを示した (n=3 mice)。さらなるintravital研究では、二光子顕微鏡法を用いた頸動脈分岐部 (n=5 mice)、スピニングディスク共焦点顕微鏡法を用いた肝臓類洞 (n=3 mice)、および二光子エピ蛍光顕微鏡法を用いた静脈内でのNETs形成が示された (n=8 mice)。前述のように、intravital技術に基づいて、Yipp et al.は生存好中球が小胞プロセスによってNETsを放出するという仮説を立てた。この仮説を検証するために、彼らはin vivo実験とSD-IVM (スピニングディスク共焦点intravital顕微鏡法) を組み合わせた。外側化されたマウス皮膚に黄色ブドウ球菌を感染させ、2時間にわたってNETs形成をモニタリングした。NETs検出はSYTOX色素を用いて行われた。この研究から、NETs形成好中球は直ちに死滅するわけではないと結論付けられ、著者らは前述のsuicidal NETosisとvital NETosisという2つの異なるNETs形成メカニズムの存在を主張した。最近では、敗血症マウスの血流中のNETsの血管内検出が成功裏に確認された (n=8 mice)。免疫蛍光標識された大腸菌が、SD-IVMを用いてNETs内部で検出された。さらに、Tanaka et al.は、レーザースキャン顕微鏡を用いたintravital顕微鏡法により、様々な臓器の血管内のNETsを特徴付けた。したがって、異なるライブセルイメージング法とin vivoまたはin situ実験の組み合わせは、感染症や自己免疫疾患の場合のNETs放出をモニタリングするための優れた方法として広く用いられている。
考察/結論
本レビューは、NETs可視化研究のmethodological standardizationに向けたfoundational frameworkを提供したHannover獣医大グループのinfluential paperである。抗体ベース手法の優位性、DNA色素のカチオン性抗菌ペプチド干渉限界、SEMのフィブリン模倣ピットフォール、PicoGreenの感度限界、イメージングフローサイトメトリーのvital/suicidal区別能力を整理し、実験カテゴリー分類体系を提案したことで、2016年以降のNETs論文は本レビューのrecommendationをreferenceする標準となった。
先行研究との違い: 本研究は、これまでの個別の手法に関する報告とは異なり、NETs可視化・定量化の主要な手法を網羅的に比較し、その利点と欠点を体系的に整理した点で新規性がある。特に、DNA染色色素がカチオン性抗菌ペプチドによってブロックされる可能性を強調し、抗体ベースの手法を推奨した点は、これまでの研究における潜在的なバイアスを明確にした。また、in vivoデータが限られていたという先行研究の課題に対し、in vivoおよびin situでのNETs検出に関する具体的な出版物の概要を提示し、その重要性を強調した。
新規性: 本研究で初めて、NETs形成の3つのメカニズム（suicidal NETosis、vital NETosis、ミトコンドリアDNA放出型）を区別し、各メカニズムに応じた適切な手法選択の重要性を強調した。また、in vitro、in situ、ex vivo、in vivo、intravitalという実験カテゴリーに基づいた分類体系を提案したことは、今後のNETs研究の標準化に大きく貢献する新規な枠組みである。イメージングフローサイトメトリーがvital NETosisとsuicidal NETosisを区別できる唯一の手法であるという知見も、本レビューの重要な新規性の一つである。
臨床応用: 本知見は、COVID-19重症感染、敗血症、癌転移など、NETs関連疾患の臨床サンプル解析における手法選択の指針を形成し、translational NETs研究を加速する上で重要な臨床的意義を持つ。特に、フローサイトメトリーベースの手法が、前臨床および臨床研究におけるNETosisのバイオマーカーとしての可能性を導入したことは、将来的な臨床応用への道を開く。例えば、血液サンプル中のNETsを迅速かつ定量的に評価する能力は、疾患の診断、予後予測、治療効果モニタリングに貢献する可能性がある。
残された課題: 今後の検討課題として、vital NETosisの分子機構（5分放出のROS非依存性）とミトコンドリアDNA放出のH3cit非依存経路のさらなる解明が残されている。また、単一細胞解析やレーザーマイクロダイセクションなどの新技術を組み合わせることで、不均一な好中球集団における個別のNETsイベントの特性評価を進めることが今後の研究方向性である。Limitationとして、本レビューは2015年末までの文献を対象としているため、それ以降に開発された新しい技術や知見は含まれていない点が挙げられる。例えば、最近開発されたDNAse耐性NETsの検出法や、NETsの分解産物のバイオマーカーとしての利用に関する研究は含まれていない。
方法
本研究はレビュー論文であるため、特定の実験やデータ収集は実施していない。代わりに、2015年12月までのPubMed、Embase、Web of Scienceデータベースを用いて、NETsの可視化および定量化に関する主要な手法を系統的に調査した。検索には「neutrophil extracellular traps」「NETs」「visualization」「quantification」「microscopy」「flow cytometry」などのキーワードを組み合わせた。選択された文献に基づき、その原理、利点、欠点、および適用範囲を比較検討した。特に、DNA染色色素の使用、抗体ベースの免疫蛍光法、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、イメージングフローサイトメトリー、および蛍光分光法（PicoGreen）に焦点を当て、それぞれの技術的特性と、NETs形成の異なるメカニズム（suicidal NETosis、vital NETosis、ミトコンドリアDNA放出型）を区別する能力について詳細な分析を行った。蛍光顕微鏡法では、DAPI、プロピジウムヨウジド、SYTOX Orange、SYTOX GreenなどのDNAインターカレート色素が広く用いられているが、ヒストンやMPO (ミエロペルオキシダーゼ)、エラスターゼなどの顆粒成分もNETsに高濃度で存在するため、これらの酵素に対する抗体を用いた追加の免疫染色がNETsの可視化に役立つことが示された。また、LL-37などのカチオン性抗菌ペプチドがDNAインターカレート色素の結合を阻害し、可視化を妨げる可能性があるため、抗体ベースの手法が推奨される。フローサイトメトリーベースの技術では、Gavillet et al. AmJHematol 2015が開発したシトルリン化ヒストン (H3cit) とMPOに対する抗体を用いたアッセイや、Zhao et al.が開発した高速マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーが評価された。後者は、透過光、側方散乱光、および細胞成分（DNAとMPO）の複数の蛍光画像を用いて、核の形態（サイズ、テクスチャ、細胞内相対位置）を検証し、vital NETosisとsuicidal NETosisの区別を可能にする。電子顕微鏡法（TEMおよびSEM）は、NETsの形態学的詳細と三次元構造の可視化に優れるが、フィブリンがNETsを模倣する可能性があり、蛍光顕微鏡による検証が必要である。蛍光分光法であるPicoGreenアッセイは、細胞外DNAの定量化に用いられる高スループットスクリーニングに適するが、壊死性DNA放出との区別ができず、顕微鏡による確認が必須である。さらに、in vitro、in situ、ex vivo、in vivo、intravitalといった実験カテゴリーに応じた手法の選択と、結果の解釈における留意点を整理し、NETs研究の標準化に向けた包括的な枠組みを提案した。本レビューは、既存の文献を統合し、NETs研究におけるエビデンスレベルの評価と手法選択の最適化を目的とした。