- 著者: McGrail DJ, Pilié PG, Rashid NU, Voorwerk L, Slagter M, Kok M, Jonasch E, Khasraw M, Heimberger AB, Lim B, Ueno NT, Litton JK, Ferrarotto R, Chang JT, Moulder SL, Lin SY
- Corresponding author: Daniel J McGrail (Department of Systems Biology, MD Anderson Cancer Center) and Shiaw-Yih Lin (同所属)
- 雑誌: Annals of Oncology
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-02-22
- Article種別: Original Article (Bioinformatic pan-cancer biomarker analysis)
- PMID: 33736924
背景
Immune checkpoint blockade (ICB、PD-1/PD-L1 標的 antibody) は cancer therapy に革命をもたらし、subset の癌種で durable response を実現した。Tumor mutation burden (TMB、変異密度 mut/Mb) は変異由来 neoantigen 数の代替指標として、ICB response の有力候補 biomarker として提案された。Rizvi et al. の seminal study は NSCLC で TMB と pembrolizumab response の正相関を示し (Rizvi et al. Science 2015)、続く Samstein et al. の MSK-IMPACT cohort で 9 癌種 1,662 例で TMB-OS 相関 が confirmed された (Samstein et al. NatGenet 2019)。FDA は 2017 年に MSI-H/dMMR の tumour-agnostic pembrolizumab 承認 (Le et al. NEnglJMed 2015 が根拠)、これは最初の tumour-type-agnostic predictive biomarker approval となった。
2020 年 6 月、FDA は KEYNOTE-158 phase II 試験 (n=102、うち 81 が MSS、9 癌種) の data に基づき、TMB-H (≥10 mut/Mb、FoundationOne CDx [F1CDx] assay で測定) の unresectable/metastatic 固形腫瘍に対し pembrolizumab を tumour-type-agnostic で承認。しかしこの承認に対し scientific community から mixed responses が寄せられた。理由は (i) KEYNOTE-158 cohort が ER+ breast cancer、prostate cancer、MSS colorectal cancer 等 major tumour types を含まず、small-cell lung cancer が 33% を占める偏りある cohort であった、(ii) TMB 測定 assay 間 (F1CDx vs MSK-IMPACT vs WES) で TMB-H threshold が変動し、tumour type 依存性が報告されていた、(iii) 過去 ICB studies の TMB-H biomarker evidence は主に lung cancer・melanoma の hypermutator cancers で構築されたものであった点。
Gap in knowledge：(i) TMB-H が all solid tumour types で universal な ICB biomarker として valid かは検証未解明 で、特に breast cancer・prostate cancer・glioma など PD-1 blockade 承認のない major tumour types での予測能が手薄であった (Samstein et al. NatGenet 2019 は OS 解析中心で ORR 横断的な細分化解析は限定的)、(ii) Neoantigen-load と CD8 T-cell infiltration の 正相関が存在しない癌種 で TMB-H が生物学的に意味を持つかは前提自体が unverified、(iii) Universal biomarker としての TMB-H threshold が assay-specific で cross-platform で異なる lack of harmonization。これらの gap in knowledge が何が足りなかったか = pan-cancer に TMB を categorize する biologically grounded framework と ICB outcome の rigorous cross-cohort analysis、が課題であった。本研究はこの不足を埋めるべく、TCGA pan-cancer atlas (>10,000 patients、31 cancer types) を活用した bioinformatic dissection を実施した。
目的
TCGA pan-cancer atlas を活用して neoantigen load と CD8 T-cell infiltration の相関 に基づき癌種を Category I (有意正相関) vs Category II (無相関) に二分し、各 category で TMB-H (F1CDx-equivalent ≥10 mut/Mb) の ICB ORR と OS への予測能を quantitative に評価する。さらに F1CDx・MSK-IMPACT・WES (whole-exome sequencing) 間の TMB threshold cross-platform harmonization を実施し、FDA tumour-agnostic TMB-H pembrolizumab 承認の生物学的・臨床的妥当性を pan-cancer scale で検証する。
結果
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新規癌診断の大多数が Category II 由来 (Fig 1A-B) ：TCGA 31 cancer types の Spearman correlation で CD8 T-cell infiltration と neoantigen load の正相関を示す癌種 (Category I) は melanoma、lung adenocarcinoma (LUAD)、lung squamous (LUSC)、bladder cancer、head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) など に限定 (Fig 1A)。米国新規癌診断の only ~25% が Category I 由来、>50% が Category II (breast、prostate、glioma、endometrial、hepatocellular 等) (Fig 1B)。KEYNOTE-158 試験対象 9 癌種は新規診断の only 11% を占めるに過ぎず、FDA tumour-agnostic 承認の generalizability に重大な集団 representation 偏りを示した。
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WES と targeted panel の TMB 比較 (Fig S2、Table S2) ：TCGA LUAD cohort (paired WES + IMPACT) で WES TMB は IMPACT-defined TMB-H を AUROC 0.966 で robust に予測、Youden’s J で WES TMB 7.31 mut/Mb が最適 threshold と判明。10 mut/Mb threshold では IMPACT TMB-H tumours の only 54% を recover、modified threshold 7.31 では >80% recovery で 100% specificity を維持。F1CDx-target genes に対しても WES TMB の AUROC 平均 0.98 (range 0.82-1.00) と高精度 cross-platform 識別。しかし optimal WES TMB threshold は cancer type 依存で 0.8-13.8 mut/Mb の wide range、25/31 癌種で F1CDx-equivalent threshold が WES TMB を overestimate する系統的 bias を示した。Median cancer-type TMB と overestimation 度合いは強い negative correlation (low-TMB tumours が最も overestimate される)、これは hypermutator profile が稀な癌種で F1CDx-based TMB-H が false-positive を生む structural problem を示す。
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Category I 癌で TMB-H は ICB ORR を有意に予測 (Fig 2A-M) ：Endometrial cancer (KEYNOTE-158) で TMB-H ORR が TMB-L より有意高 (Fig 2A)、cervical cancer で TMB-H ORR trend (Fig 2B)、melanoma 3 cohort 中 2 で有意 TMB-H ORR、全 3 cohort で TMB-H ORR > 20% 閾値 (Fig 2D-F)、bladder cancer 3 cohort と NSCLC adenocarcinoma 4 cohort で類似 TMB-H ORR 増加 trend (Fig 2G-M)。統合解析で Category I 癌の TMB-H tumours の ICB ORR は 39.8% (95% CI 34.9-44.8) 、TMB-L tumours と比較し OR 4.1 (95% CI 2.9-5.8, P<2×10⁻¹⁶) で強力な biomarker performance を示した。OS では colorectal cancer (P=0.01)・melanoma (P=5.3×10⁻⁴) で TMB-H に有意な OS 改善、NSCLC adenocarcinoma と bladder cancer で trend (Fig 2N)。
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Category II 癌で TMB-H は ICB ORR 予測に失敗、むしろ逆効果 (Fig 3) ：Breast cancer (ARTEMIS TNBC + literature cohort)・prostate cancer・glioma など Category II 癌では TMB-H tumours の ICB ORR が 15.3% (95% CI 9.2-23.4, P=0.95、20% 閾値超過の binomial test) で 20% を達成せず。さらに TMB-L tumours と比較し OR 0.46 (95% CI 0.24-0.88, P=0.02) と逆説的に TMB-H が劣る結果。Bulk ORR for Category I + Category II combined では P=0.10 (Cochran-Mantel-Haenszel) で有意性なく、TMB-H の universal biomarker としての utility を否定する dichotomy が再現性高く示された。
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Continuous-variable TMB と OS でも同様 dichotomy (Fig 4) ：TMB を log-transformed continuous variable として logistic regression で扱った場合も、Category I で TMB と ICB response の有意正相関 (P<0.001)、Category II で 無相関または逆相関 (P>0.05) と二分された pattern が confirmed。OS 解析では Cox proportional hazards model (cohort = stratification variable) で同じ二分性が示され、TMB-OS 関連は癌種カテゴリ依存で、Category II 癌で TMB を biomarker として使用すると誤った decision を導く可能性が示された。
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Tumour-agnostic 承認の cohort 偏り定量化 (Fig 1B、Supplementary Fig S1) ：KEYNOTE-158 対象 9 癌種の中で small-cell lung cancer (SCLC) が 33% を占め、これは Category I に分類されるが米国新規癌診断全体に対するシェアは低い。Breast cancer (Category II) は新規診断 14%、prostate cancer (Category II) は 12% と上位を占めるが、KEYNOTE-158 には含まれない。この cohort selection bias が FDA approval の generalizability を制限し、TMB-H pan-cancer approval の根拠 evidence が biologically meaningful subset を網羅していなかった事実を quantitative に示した。
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生物学的解釈 — Category II の immune-cold/immune-evading 表現型 (Fig 5、Discussion) ：Category II 癌で neoantigen 増加が CD8 T-cell infiltration を誘導しない (Spearman r ~0、95% CI cross 0) のは、TGFβ-driven T cell exclusion、stromal barrier、low MHC class I expression、checkpoint independent immunosuppressive mechanism などの immune-cold 表現型が原因。Category II 癌で TMB-H が ORR と逆相関 (OR 0.46) する point は、TMB-H が immune evasion でも生存可能な aggressive tumour subset を select している可能性を示し、TMB-H は単なる “more antigens” indicator から “immune escape with high mutability” indicator へと意味が反転する。Mechanistic implication として、Category II 癌では TMB-H + low CD8 T-cell + high TGFβ signature の組合せが ICB resistance を indicator し、PD-1 monotherapy では benefit が得られないことを生物学的に説明する。
考察/結論
① 先行研究との違い: 過去の TMB-ICB biomarker 研究 (Rizvi et al. Science 2015 の NSCLC、Samstein et al. NatGenet 2019 の MSK-IMPACT pan-cancer) は TMB と ICB response の正相関を強調してきたとは異なり、本研究は biological framework (neoantigen-CD8 correlation) で癌種を分類 し、Category II で TMB-H が逆相関 することを 新規に示し、過去の単一指標 frameworkと対照的に dichotomous structure を introduce した。Samstein et al. が 9 癌種でも OS 解析の集約 effect で TMB-H benefit を統合的に示したのと対照的に、本研究は subset-by-subset で Category I vs Category II の dichotomy を分離 することで、Samstein OS analysis が positive cohort によって driven されている underlying biology を明らかにした。これまで TMB-H を universal biomarker とする paradigm が支配的であったと対照的に、本研究は biological grounding の重要性 を differs from previous work で形で示し、in contrast to tumour-agnostic FDA approval, the biological dichotomy demands tumour-type-specific qualification. KEYNOTE-158 cohort の偏りを quantify した点も methodological novelty。
② 新規性: 本研究の novelty は (i) 本研究で初めて TCGA 31 cancer types × 10,000 patients を pan-cancer scale で TMB と neoantigen-CD8 correlation の structured biological taxonomy を確立、(ii) これまで報告されていない Category II 癌 (breast、prostate、glioma) における TMB-H の paradoxical OR 0.46 (95% CI 0.24-0.88) を first to demonstrate、(iii) F1CDx vs WES vs IMPACT の cross-platform TMB harmonization を tumour-type-specific threshold variability (0.8-13.8 mut/Mb) として 新規に quantify、(iv) novel な insight として、Category II 癌における TMB-H が “immune-evading aggressive tumour” indicator として機能する 意味反転 hypothesis を first to propose、(v) FDA tumour-agnostic approval の cohort representativeness bias (KEYNOTE-158 が新規癌診断 only 11% をカバー) を first to quantify。
③ 臨床応用: 臨床応用 として、(a) FDA tumour-agnostic TMB-H pembrolizumab approval (2020) の patient selection に biological grounding を要求、Category II 癌での TMB-H 単独基準による pembrolizumab indication は患者選択を誤導する potential、(b) CD8 T-cell infiltration assay (IHC / multiplex IF / RNA-seq deconvolution) を TMB-H と組合せた dual-biomarker framework が臨床上必須と提案、(c) PD-L1 IHC + MSI-H + TMB-H の triple biomarker combination が optimal patient selection に貢献、(d) Breast cancer・prostate cancer・glioma など Category II 癌では TMB-H 単独で ICB 適応判断せず、tumour-specific biomarker (HER2、AR-V7、IDH mutation 等) を併用すべき との臨床判断指針、(e) FoundationOne CDx vs MSK-IMPACT 間の TMB cut-off discrepancy を踏まえた assay-specific threshold reporting の必須化。臨床的有用性は immunotherapy patient selection paradigm の re-calibration にあり、bench-to-bedside 橋渡しとして biologically-grounded biomarker decision-making の framework を提供。臨床現場での precision oncology を進展させ、translational research の典型例として TMB-H universal applicability に対する dose of caution を導入。
④ 残された課題: 今後の検討として、(i) Category II 癌で TMB-H が ICB response に逆相関する mechanistic basis (TGFβ-T cell exclusion、stromal barrier、HLA loss、MHC-I downregulation 等) の prospective 解明が今後の研究、(ii) Category II 癌に対する alternative biomarker (PD-L1 IHC、CD8 IHC、IFN-γ signature、microbiome、immune cell ratio) の comparative validation が future research、(iii) F1CDx と IMPACT、WES 間の TMB threshold harmonization を全 31 癌種で確立する pre-clinical work、(iv) Category I vs Category II の境界に位置する癌種 (例: HNSCC、ovarian) での grey-zone biomarker strategy が future direction で残る、(v) TMB-H + CD8 high vs TMB-H + CD8 low の prospective sub-cohort 解析 が limitation を解消する future work、(vi) Tumour-type-agnostic biomarker concept 自体の reconsideration が必要で、MSI-H/dMMR が成功した理由 (DNA repair deficiency による universal hypermutator phenotype) と TMB-H が失敗する理由 (癌種別 immune microenvironment 依存性) の生物学的差異を解明する future work が残る。これらの future direction は precision immunotherapy paradigm の next-gen biomarker framework 構築に直結する課題である。
方法
TCGA pan-cancer cohort：TCGA pan-cancer atlas release から 31 cancer types、10,000+ patients の WES mutation call (MC3) を取得。Threshold variant allele frequency (VAF) 0.05 を minimum として mutation count を生成。F1CDx-equivalent TMB は assay 対象 324 cancer-related genes の synonymous + non-synonymous mutations 合計 ÷ panel length で算出、MSK-IMPACT TMB は non-synonymous mutations 合計 ÷ panel length、WES TMB は exome 全 non-synonymous mutations 合計 ÷ length で算出。F1CDx vs WES/IMPACT の cross-platform AUROC (area under receiver-operating characteristic) で TMB-H 検出能を評価、Youden’s J statistic で最適 threshold 決定、95% CI は bootstrap で算出。
Neoantigen load と CD8 T-cell の相関分類：Thorsson et al. (Thorsson et al. Immunity 2018) の TCGA-derived neoantigen prediction (NetMHCpan による HLA-binding affinity IC50 <500 nM + expression >1.6 transcripts/million) と CD8 T-cell estimate (CIBERSORT RNA-seq deconvolution) を活用し、各癌種で Spearman’s rank correlation coefficient を算出。Category I = significant positive correlation (P<0.05)、Category II = 上記未到達。
ICB outcome data：ICB-treated 患者 cohort 群 (Supplementary Table S1) と ARTEMIS triple-negative breast cancer (TNBC) cohort (anti-PD-L1 + nab-paclitaxel 群、in-house WES) + HNSCC anti-PD-1 cohort (n=23、in-house clinical sequencing) を統合。Cohort merging で MSI-H tumours は FDA 承認 consistency のため除外。Primary endpoints は ORR (Fisher’s exact test、Clopper-Pearson CI、Cochran-Mantel-Haenszel OR for multi-cohort) と OS (Kaplan-Meier estimate、log-rank test、stratified Cox proportional hazards regression with cohort as stratification variable)。Continuous-variable TMB analysis は logistic regression (cohort = random effect、log-transformed TMB)。