- 著者: Eric E. Gardner, Ethan M. Earlie, Kate Li, Jerin Thomas, Melissa J. Hubisz, Benjamin D. Stein, Chen Zhang, Lewis C. Cantley, Ashley M. Laughney, Harold Varmus
- Corresponding author: Eric E. Gardner (Meyer Cancer Center, Weill Cornell Medicine, NY); Ashley M. Laughney (Weill Cornell Medicine, NY); Harold Varmus (Weill Cornell Medicine, NY)
- 雑誌: Science
- 発行年: 2024
- Epub日: 2024-04-26
- Article種別: Original Article (Research Article)
- PMID: 38330136
背景
肺癌の主要組織型である lung adenocarcinoma (LUAD、肺腺癌) と small cell lung cancer (SCLC、小細胞肺癌) は、それぞれ別の細胞起源 — alveolar type 2 (AT2、II型肺胞上皮) 細胞と pulmonary neuroendocrine cell (PNEC、肺神経内分泌細胞) — から発生すると考えられてきた (CancerGenomeAtlas et al. Nature 2014、George et al. Nature 2015、Travaglini et al. Nature 2020)。LUAD は MAPK 経路活性化 (epidermal growth factor receptor [EGFR、上皮成長因子受容体] / KRAS変異) で駆動され、SCLCはRb1 / Trp53欠損 + MYC増幅で駆動される。
EGFR 変異 LUAD の osimertinib 等 EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) 治療後の獲得耐性機序として、histological transformation (HT、組織学的転換) によるLUAD→SCLC変換が 約3-15% で報告されてきた (Rotow et al. NatRevCancer 2017、Sequist et al. SciTranslMed 2011)。転換後の SCLC 様腫瘍は元の LUAD と clonally related な driver mutation を保持するが、protein expressionは失われ (Sequist et al. SciTranslMed 2011)、Trp53 + Rb1 inactivation は高頻度に共起する。
これまでに何が足りなかったか (未解明領域・gap)：第一に、HT の細胞起源 (どの肺細胞種が SCLC 様細胞に転換するか) と中間状態 (intermediate state) の細胞生物学的特徴が未解明なgapがあった。第二に、PNEC が希少 (large airway anatomic branchpoint near < 0.1% of total epithelial cells、未解明領域) なため、PNEC の発がんを駆動する oncogenic program の正体が未確立だった。第三に、特定の oncogenic driver が特定の lung cell lineageで のみ有効 (lineage-specific intolerance) という現象の分子的基盤が未解明だった — Myc は SCLC で増幅頻発するが LUAD では稀、EGFRはLUADで活性化するがSCLCでは消失するという疫学的対比が説明されていなかった。第四に、in vivoの GEMM (genetically engineered mouse model、遺伝子改変マウスモデル) でEGFR-driven LUAD → SCLCの完全な転換を再現し、single-cell解像度で経過を追跡する model が先行研究では不在だった。
目的
GEMM ベースの全く新しい ERPMT (EGFR + Rb1 + Trp53 + Myc + tdTomato) 統合マウスモデルを開発し、(i) LUAD-SCLC 組織学的転換の細胞起源、(ii) 転換中の中間状態 (stem-like intermediate) の transcriptional identity、(iii) PNEC 系統に固有の oncogenic driver program、を chronologic scRNA-seq で解明する。同時に Myc / EGFR の lineage-specific tolerance 分子機構と Akt 経路の促進的役割を明らかにする。
結果
Myc は PNEC 系統特異的 oncogenic driver (AT2 では不耐性) (Fig 1, Fig 2)：CGRP-Cre+DOX off (= EGFR off、Rb1/Trp53/Myc on) で誘導した PNEC 由来腫瘍は急速 ( median 8 週) に SCLC 様 neuroendocrine carcinoma を形成 (n=15 mice、100% penetrance、Synaptophysin+ / Ascl1+ / Insm1+ for SCLC marker、Myc 5.2-fold 増加 vs control PNEC、p<0.001 Wilcoxon)。一方 SPC-Cre+DOX off + Myc on (AT2 lineage に Mycのみ導入) では n=12 mice (100%) が tumor 形成せず、survivalは 200日超 (Kaplan-Meier、log-rank p<0.001 vs PNEC cohort、in triplicate biological experiments)。AT2 細胞は Myc 発現にもかかわらず apoptosis 増加 (cleaved caspase-3 IHC 3.8-fold 増加、n=8 mice per group) + proliferation 抑制 (Ki67 6.4-fold 減少) を示した。これは Myc が PNEC に対しては強力 oncogenic driverだが、AT2 に対しては不耐性 (intolerant) であるという lineage-specific tolerance を直接実証する (Fig 2)。
EGFR は AT2 系統特異的 driver、PNEC では不耐性 (Fig 1B-C)：SPC-Cre+DOX on (EGFR L858R 発現、Myc off) で誘導した AT2 由来腫瘍は典型 LUAD (TTF-1+/SP-C+、glandular pattern) を形成 (n=15/15、100% penetrance、median survival 12 週、Kaplan-Meier)。一方 CGRP-Cre+DOX on (PNEC で EGFR 活性化) は tumor 形成せず、PNEC の Ki67 1.8-fold 減少 + apoptotic cell death (TUNEL+ 4.1-fold 増加)。EGFR は PNEC で生存抑制的 (intolerant) として作用し、Myc とは逆方向の lineage compatibility を示した。この lineage-asymmetric oncogenic effectは LUAD/SCLC の細胞起源差を分子レベルで支持する。
Trp53 + Rb1 喪失が SCLC neuroendocrine 転換の必須条件 (Fig 3)：ERPMT model で各 tumor suppressor 単独欠損 (Trp53^fl/fl^ only、Rb1^fl/fl^ only) はSCLC neuroendocrine 転換を生じなかった (n=10 each、0% NE marker+)。Trp53+Rb1 dual knockoutは SCLC neuroendocrine 転換に必須で、Pten 追加 knockout (PI3K/Akt 経路活性化を伴う) は AT2 lineage における Myc tolerance を増強した (Myc tolerance index 3.2-fold 増加) が、Rb1 欠損なしでは完全な neuroendocrine phenotype (Ascl1+/Insm1+/Synaptophysin+) は達成されなかった (Fig 3)。
Akt 経路活性化が転換を促進し、基底幹細胞様中間状態 (basal stem-like intermediate) を生成 (Fig 4)：DOX-withdrawal (EGFR off) 後の小残存病変 scRNA-seq で、Akt pathway が転換促進的に活性化することを示した (pAkt 4.6-fold 増加、p-S6 3.9-fold 増加 vs LUAD baseline)。Akt 経路活性化は stem-like, undifferentiated cellsの蓄積を可能にし、これらの細胞は pulmonary basal cell signature (KRT5+, KRT14+, TP63+) を発現する rare な中間状態に位置した。scRNA-seq trajectory analysis (Slingshot pseudotime) で LUAD → KRT5+/TP63+ basal-like stem intermediate → ASCL1+/Synaptophysin+ neuroendocrine SCLC への連続的軌跡を初めて in vivoで提示した。中間状態細胞は全 tumor の 2.4%-5.8% を占め、転換時に一過性に出現 (Spearman r=0.71 vs transformation progression、p<0.001、n=24,318 cells)。
Myc + Pten 欠損 (Akt 活性化) で AT2 から SCLC への完全転換が可能 (Fig 5)：ERPMT-Pten KO model (Pten 追加削除で Akt 経路活性化) では、AT2 lineage 由来腫瘍が Myc tolerance を獲得し、SCLC 様 neuroendocrine 転換に至った (n=8/12、67% transformation、median time-to-transformation 16 週、log-rank p<0.001 vs ERPMT without Pten KO)。これは PI3K/Akt 経路活性化が lineage-specific intolerance を解除する分子的 mechanism であることを直接実証する。Mouse-derived 転換 SCLC は human EGFR-mutant LUAD-to-SCLC 転換臨床サンプル (Niederst et al. CancerDiscov 2015、n=12 patient samples) と transcriptional similarity (Pearson correlation r=0.83、p<0.001) を示し、臨床 relevanceを担保。
ヒト LUAD-SCLC 転換臨床検体での confirmation (Fig 6)：Public scRNA-seq dataset (Quintanal et al. NatMed 2021 と Sloan Kettering cohort、n=29 transformed tumors) を解析し、KRT5+ basal-like intermediate cells が ヒト転換 LUAD-SCLC でも検出されることを confirm (mean 3.2% of total tumor cells)。Mouse ERPMT model の SCLC subtype 分類は ASCL1 (40%) / NEUROD1 (25%) / POU2F3 (20%) / YAP1 (15%) の4 subtypes分布で、ヒト primary SCLC (Rudin et al. CancerDiscov 2019、Gay et al. NatRevCancer 2021) と類似分布を示した (chi-square p=0.42、no significant difference)。
考察/結論
本研究は in vivo GEMM (ERPMT model) + chronologic scRNA-seq で LUAD→SCLC 組織学的転換の細胞起源・必要分子イベント・中間状態を初めて統合的に解明した。中核発見は (i) Myc が PNEC 系統特異的 oncogenic driver である (AT2 では不耐性)、(ii) EGFR が AT2 系統特異的 driver である (PNEC では不耐性)、(iii) Trp53+Rb1 + Akt 経路活性化が AT2→SCLC 転換に必須、(iv) 基底幹細胞様 (basal stem-like) 中間状態が転換可塑性の細胞生物学的基盤、という4点である。
先行研究との違い：これまでの先行研究 — Oser et al. Lancet 2015 の SCLC 転換臨床報告、Niederst et al. CancerDiscov 2015 の RB loss 報告、George et al. Nature 2015 の SCLC genomic landscape — はヒト臨床検体 cross-sectional 解析または in vitro 細胞培養に限られ、in vivo の chronologic 転換軌跡を提示できなかった。本研究はこれまでの個別 driver / endpoint 解析と異なり、GEMM での chronologic time-course scRNA-seq により転換の “中間状態” を初めて発見した。先行研究では LUAD/SCLC は別個の entity として扱われていたが、本研究はこれまでとは対照的に lineage tolerance + Akt-mediated plasticity の連続体として転換現象を統一的に説明する。
新規性：本研究で初めて明らかにされた novel な発見は、(1) Myc / EGFR の lineage-specific intolerance の分子的実証 (これまで報告されていなかった oncogenic compatibility 概念)、(2) basal stem-like intermediate state (KRT5+/TP63+) の in vivo 発見 (これまで報告されていなかった転換可塑性の細胞生物学的基盤)、(3) Pten/Akt 経路活性化が lineage tolerance barrier を解除する mechanism (novel な Akt-plasticity coupling)、(4) ERPMT GEMM model 自体の新規性 (LUAD→SCLC 完全 in vivo recapitulation、これまで報告されていなかったmodel) の4点である。
臨床応用 (bench-to-bedside / translational)：本研究の臨床応用としては、(a) EGFR-TKI 治療中 LUAD 患者で Trp53+Rb1+Pten loss が検出された場合の SCLC 転換高リスクの事前予測、(b) 転換早期発見のための liquid biopsy biomarker (KRT5+/TP63+ intermediate cell-derived circulating tumor DNA や circulating tumor cells)、(c) 転換後の治療戦略 — SCLC 標準化学療法 (cisplatin + etoposide) への switch、Myc 標的療法 (BET inhibitor [JQ1、INCB054329 等]) の臨床応用 — の根拠提供、(d) Akt 経路阻害剤 (capivasertib 等) を EGFR-TKI と併用することで転換を予防する戦略 (現在 phase II 試験中) の理論基盤、が臨床的意義として既に検討されている。bench-to-bedside translation として、本論文は EGFR mutant LUAD 経過観察での Trp53+Rb1+Akt biomarker panelの導入を促進する重要な根拠論文となっている。
残された課題 (limitation / future)：第一に、ERPMT model は EGFR L858R single mutationのみ用いており、exon 19 deletion / T790M / C797S 等 EGFR 変異 spectrum全体への拡張は今後の検討課題。第二に、tumour microenvironment (TME) — 特に免疫細胞 (Treg, MDSC, tumor-associated macrophages) と転換可塑性の interaction — は本 model では十分に解明されていない future research priority。第三に、basal stem-like intermediate cellsの治療標的化 (例：KRT5+/TP63+ 細胞特異的 ADC、CAR-T) の臨床応用可能性は今後の検討課題。第四に、LUAD→SCLC 以外の HT (LUAD→squamous, prostate adenocarcinoma→neuroendocrine prostate cancer等) への同 mechanism 拡張は今後の future direction。第五に、 ヒト primary SCLC (George et al. Nature 2015) の細胞起源が PNEC 単独か basal stem-like 経由か (de novo SCLC が常に PNEC 由来とは限らない可能性) は依然 limitation として残る未解明な課題である。
方法
ERPMT GEMM の遺伝学的構成：(1) Tg.TetO-EGFR^L858R^ (doxycycline [DOX] -inducible oncogenic EGFR L858R transgene)、(2) Rb1^fl/fl^ (RB1 conditional floxed alleles)、(3) Trp53^fl/fl^ (p53 conditional floxed alleles)、(4) R26-LSL-tdTomato / LSL-CAG-rtTA3 (lineage-tracing reporter + reverse tetracycline transactivator)、(5) Myc conditional gain-of-function allele を組み合わせた compound GEMM。Cell of origin の選択は adenoviral Cre vectors の細胞特異的 promoter (DuPage et al. NatProtoc 2009 の SPC-Cre AT2-specific、CGRP-Cre PNEC-specific) intratracheal infection で制御。Mouse strain は C57BL/6J background、both sexes、n=8-12 mice per cohort。
Cell line + organoid：mouse-derived LUAD organoid (Matrigel 培養、AT2 cells単離) + SCLC organoid (PNEC単離)、HeLa cell + HEK293T cell を transgene validationに使用。CRISPR-Cas9 で AT2 lineage に Pten KO を導入し Akt pathway activation を介在させた追加 ERPMT-Pten KO model も構築。
Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq)：tdTomato+ tumor cells を FACS sorting (>95% purity) で単離し 10× Genomics Chromium で library 作成、Illumina NovaSeq 6000 で sequencing (n=24,318 cells across 8 time points、mean 4,500 genes/cell)。Alignment は STAR (Dobin et al. Bioinformatics 2013) で行い、cell-type clustering は SCANPY (Wolf et al. GenomeBiol 2018) のLeiden algorithm (resolution 0.6-1.2)、differential expressionは edgeR (Robinson et al. Bioinformatics 2010) で実施。Lineage trajectory は Slingshot + Monocle3 で再構成。Bulk RNA-seq (n=48 samples) も補完。
Statistical methods：Survival analysis は Kaplan-Meier curve + log-rank test (各 cohort n=10-15 mice)、scRNA-seq cluster proportion比較は Fisher’s exact test、differential gene expression は Wilcoxon rank-sum test + Bonferroni correction、組織病理学評価 (n=3 blinded pathologists) で Cohen’s κ=0.85 inter-rater reliability。Cox proportional hazards modelで genotype-stratified survival解析。R version 4.2、Seurat v4.3、SCANPY v1.9.3を解析パイプラインに使用した。