- 著者: The Cancer Genome Atlas Research Network
- Corresponding author: Adam J. Bass (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-09-11
- Article種別: Original Article
- PMID: 25079317
背景
胃癌は世界的に見て主要な癌死亡原因の一つであり、2012年には年間723,000人の死亡を引き起こし、癌関連死亡の第3位を占めたと報告されている (Ferlay et al. 2013 GLOBOCAN)。その分子および臨床的特徴の解析は、組織学的・病因学的異質性により複雑化している。Lauren分類 (Lauren, 1965) は胃癌を腸型とびまん型に大別し、WHO分類は乳頭状、管状、粘液性、低凝集性癌に細分化しているが、これらの分類システムは分子レベルの異質性を十分に捉えきれておらず、分子標的治療の開発や患者の予後予測において限界があった。胃癌の発症リスクは、細菌であるHelicobacter pylori感染 (Uemura et al. 2001) やEpstein-Barr virus (EBV) 感染、E-cadherin (CDH1) 胚細胞系列変異による遺伝性びまん性胃癌 (HDGC)、Lynch症候群に関連するミスマッチ修復遺伝子変異など、複数の要因に起因することが知られている。
これまでの胃癌の分子プロファイリング研究は、遺伝子発現パターンに基づくクラスタリング (Tan et al. 2011 Gastroenterology; Lei et al. 2013 Gastroenterology) や、ARID1A遺伝子の高頻度変異の同定 (Wang et al. 2011 Nat Genet) などが実施されてきた。しかし、これらの研究は限定的なサンプルサイズや単一の分子プラットフォームに依存しており、複数のオミクスデータを統合した包括的な解析に基づく、生物学的かつ治療標的指向性の高いロバストな分類体系は未確立であった。このような背景から、The Cancer Genome Atlas (TCGA) プロジェクトは、大腸癌 (Network et al. Nature 2012) や子宮内膜癌 (Cancer Genome Atlas Research Network, Nature 2013) において既にマルチオミクス解析による分子分類体系を確立しており、本研究はそのアプローチを胃癌に応用することを目指した。Lauren分類やWHO分類が臨床的有用性に乏しい現状を打破し、サブタイプ特異的な治療標的を持つ分子分類を確立することは、患者層別化と個別化治療の実現に向けた重要なステップである。本研究は、295例の原発性胃腺癌の新鮮凍結検体に対して6種類の分子プラットフォームを統合した解析を実施し、胃癌の分子分類と治療標的のロードマップを提供することを目的とした。これまでの研究では、胃癌の分子異質性を包括的に捉え、臨床的意義のあるサブタイプ分類を導出するための十分なデータ統合が不足しており、個別化治療戦略の策定における大きなギャップが残されていた。
目的
本研究の目的は、TCGAコホートに登録された295例の原発性胃腺癌を対象に、全エクソーム配列解析 (WES)、SNPアレイによる体細胞コピー数異常 (SCNA) 解析、RNAシーケンス (mRNAおよびmiRNA)、DNAメチル化アレイ、および逆相プロテインアレイ (RPPA) を統合的に解析することであった。具体的には、以下の3つの主要な目的を設定した。(1) 胃癌のロバストな分子サブタイプを同定すること。(2) 各サブタイプに特徴的なゲノム異常、エピゲノム変化、および経路活性化パターンを明らかにすること。(3) 各サブタイプに特異的な治療標的候補（例えば、PI3K阻害剤、抗HER2療法、抗PD-1/PD-L1免疫療法、CLDN18.2標的療法など）を提示し、患者層別化と個別化治療戦略の設計に資するロードマップを提供することを目指した。本研究は、胃癌の分子分類を確立し、それぞれのサブタイプに最適な個別化治療戦略の基盤を築くことを最終的な目的とした。
結果
4分子サブタイプの同定とdecision tree分類: unsupervised clusteringとiCluster統合解析の結果は一貫して4つの分子サブタイプを支持した。これに基づき、臨床応用可能なdecision treeが構築された (Fig 1a, b)。この分類は、まずEBV陽性度、次にMSI-high状態、そして体細胞コピー数異常 (SCNA) の程度（高低）によってゲノム安定型 (GS) と染色体不安定型 (CIN) に分けるものであった。同定されたサブタイプの頻度は、EBV陽性型が9% (n=28)、MSI型が22% (n=65)、GS型が20% (n=59)、CIN型が50% (n=143) であった。臨床病理学的特徴を見ると、びまん型組織像はGS群に高度に富集しており、40/55例 (73%) で認められ、p=7.5×10^-17 であった。CIN型は胃食道接合部/噴門部由来の腫瘍に多く (65%、p=0.012)、EBV陽性型は胃底部/胃体部に富集していた (62%、p=0.03)。患者年齢中央値はGS型で59歳 (p=4×10^-7) と若く、MSI型で72歳 (p=5×10^-5) と高齢であった。性別ではMSI型が女性に優位 (56%、p=0.001)、EBV陽性型が男性に優位 (81%、p=0.037) であった。東アジアと欧米の患者間でサブタイプ分布に系統的な差は認められず、初期の予後データでは4サブタイプ間の生存差は確認されなかった。
EBV陽性サブタイプ: 極端なDNA高メチル化とPIK3CA変異、免疫関連遺伝子増幅: EBV陽性腫瘍 (9%) は、TCGAで報告された全癌種の中で最も高いDNA高メチル化の頻度を示した。全例でCDKN2A (p16^INK4A) プロモーターの高メチル化を呈したが、MSI型に特徴的なMLH1プロモーターの高メチル化は欠如しており、独自のEBV-CIMP (CpG island methylator phenotype) を形成していた (Fig 2a)。PIK3CA変異はEBV陽性腫瘍の80% (p=9×10^-12) に達し、他のサブタイプ (3-42%) を大きく上回った。EBV陽性腫瘍ではPIK3CA変異がキナーゼドメイン (exon 20) 外に分散する傾向が見られたのに対し、EBV陰性腫瘍ではexon 20に局在していた (Fig 2b)。また、9p24.1の局所増幅が15% のEBV陽性腫瘍で認められ、JAK2、CD274 (PD-L1)、PDCD1LG2 (PD-L2) の3遺伝子を同時に増幅していた。これらの増幅例ではmRNA発現も上昇しており (Supplementary Fig 2.10)、これはPD-L1高発現EBV陽性リンパ腫 (Chen et al. 2013) と同様の所見である。この結果は、抗PD-1/PD-L1療法およびJAK2阻害剤の臨床評価の根拠となる。ARID1A変異が55%、BCOR変異が23%と高頻度であった一方、TP53変異は稀であったこともEBV陽性サブタイプの特徴である。
MSIサブタイプ: 超変異と標的可能な癌遺伝子変異、免疫逃避メカニズム: MSIサブタイプ (22%) はMLH1プロモーターの高メチル化を伴う超変異 (11.4 mutations/Mb超) を示し、11例では67.7 mutations/Mbを超える極めて高い変異負荷が認められた。このサブタイプは女性に多く、高齢で発症する傾向があった。MutSigCV解析により、63例の超変異腫瘍において、PIK3CA、ERBB3、ERBB2、EGFRなどの標的可能な癌遺伝子変異が高頻度に同定された。特にERBB3変異は16/63例で認められ、そのうち13例はCOSMICデータベースに登録されているホットスポット変異であった。大腸癌のMSI型で高頻度に見られるBRAF V600E変異は胃癌MSI型では欠如していた。HotNet解析では、MHCクラスI遺伝子 (B2M, HLA-B) の変異が頻発しており、これは抗原提示障害による免疫逃避メカニズムを示唆する (Bernal et al. 2012)。CDKN2Aの欠失やVEGFAの増幅もMSIサブタイプの特徴であった。
ゲノム安定型 (GS) サブタイプ: RHOA変異とCLDN18-ARHGAP融合、びまん型富集: GSサブタイプ (20%) はLaurenのびまん型組織像に高度に富集しており (73%)、若年発症 (中央値59歳) でSCNAは少ないが、構造異常が豊富であった。CDH1体細胞変異が37%の症例で富集しており、これは遺伝性びまん性胃癌 (HDGC) の体細胞変異版と解釈できる。ARID1A変異も高頻度であった。RHOA変異はGSサブタイプに固有で15% (p=0.0039) の症例で認められ、Y42CやD59などのアミノ末端領域に集中していた (Fig 4a, b)。これらの変異はRASファミリー癌遺伝子変異やT細胞リンパ腫で報告されたG17V変異 (Sakata-Yanagimoto et al. 2014) とは異なる位置にあり、RHOAの下流シグナル伝達を調節する可能性が示唆された。特にRHOA Y42C変異はProtein Kinase Nの活性化を選択的に減弱させ、mDiaやROCK1の活性化は維持することが生化学的に示されている (Doherty et al. 2011)。さらに、CLDN18-ARHGAP26/6融合遺伝子が13例 で同定され、そのうち62%がGSサブタイプに富集していた (p=10^-3)。これらの融合はCLDN18の膜貫通ドメインを保持しつつ、ARHGAP26またはARHGAP6のGAPドメインをCLDN18の細胞質側カルボキシ末端に融合するキメラタンパク質を生成すると予測された (Fig 4c)。このキメラタンパク質はRHOAの調節と細胞接着の両方を破綻させ、びまん型胃癌の浸潤性表現型に寄与する可能性が考えられる。RHOA変異とCLDN18-ARHGAP融合は相互排他的であり (Fig 4e)、GSサブタイプの約30%がいずれかの異常を有していた。
CINサブタイプ: 異数性とTP53変異、RTK局所増幅: CINサブタイプ (50%) は顕著な異数性を示し、TP53変異が71% と最も高頻度であった。GISTIC解析により、ERBB2 (HER2、CIN内7-38%)、EGFR、VEGFA、FGFR2、MET、CCNE1、CCND1、CDK6、MYC、KRAS、GATA4/6、ZNF217、CD44などの癌遺伝子の局所増幅が同定された。MET遺伝子では、エクソン2スキッピングが30% (82/272例) で、エクソン18/19スキッピングが17% (47/272例) で認められ、これらはキナーゼドメインの領域をコードするエクソンであった。RPPA解析では、EGFRのpY1068リン酸化亢進とp53発現亢進がCIN群に特徴的であった。VEGFA増幅は、VEGFR2標的抗体であるラムシルマブ (ramucirumab) の有効性 (Fuchs et al. 2014 Lancet) と合致する。ERBB2増幅は既存のトラスツズマブ適応と一致し、CDK4/6阻害剤やFGFR阻害剤の臨床評価の根拠となる。細胞周期関連遺伝子 (CCNE1, CCND1, CDK6) の局所増幅は、CDK4/6阻害剤の標的候補となる。
統合経路解析と治療標的の全体像: RTK-RAS-PI(3)-kinase経路の統合解析 (Fig 5a, b) は、各サブタイプに特異的な治療標的の地図を提示した。EBV陽性型ではPIK3CA変異とJAK2/ERBB2増幅が特徴であり、PI(3)-kinase阻害剤やJAK2阻害剤、PD-1/PD-L1阻害剤が候補となる。MSI型ではPIK3CA、ERBB3、ERBB2、EGFRのホットスポット変異が高頻度であったが、標的可能な増幅は少なかった。GS型ではRHOA変異とCLDN18-ARHGAP融合が特徴であったが、その他の明確な治療標的は少なかった。CIN型ではRTKの増幅が多発しており、既存の抗HER2療法や抗VEGFR2療法、CDK4/6阻害剤が適用可能である。Pathway-level expression解析 (Fig 5c) では、有糸分裂ネットワーク (AURKA/B, E2F)、MYC標的、FOXM1、PLK1シグナル伝達、DNA損傷応答経路が全サブタイプで亢進していたが、GS型ではその程度が弱かった。GS型ではβ1/β3インテグリン、シンデカン-1、血管新生関連経路の発現亢進が認められた。EBV陽性型ではIL-12を介した免疫シグネチャーの亢進が確認され、オーロラキナーゼやPolo様キナーゼファミリー阻害剤、免疫療法の候補根拠となる。
考察/結論
本TCGA Stomach Working Groupによる295例の胃腺癌マルチオミクス解析は、Lauren (1965) の腸型とびまん型という二分類やWHO形態分類の臨床的有用性の乏しさとは対照的に、4つの分子サブタイプ (EBV陽性、MSI、ゲノム安定型、染色体不安定型) からなる分子分類体系を、これまで報告されていない大規模な統合解析によって確立した点に新規性がある。先行する小規模な発現ベースのクラスタリング研究 (Tan et al. 2011; Lei et al. 2013) やARID1A変異の同定 (Wang et al. 2011) とは異なり、本研究は6つの分子プラットフォームを統合し、iClusterとdecision treeを用いた臨床実装可能なアルゴリズムを開発した。さらに、各サブタイプに対して具体的な治療標的候補 (EBV陽性型にはPI3K阻害剤、JAK2阻害剤、抗PD-1/PD-L1抗体。MSI型には抗PD-1抗体、PI3K経路阻害剤。GS型にはCLDN18.2標的薬、RHO/ROCK阻害剤。CIN型には既存の抗HER2療法、抗VEGFR2療法、CDK4/6阻害剤) を提示したことが、本研究の独自の貢献である。
臨床応用: 本研究で同定されたEBVサブタイプの9p24.1におけるPD-L1/PD-L2増幅は、その後の抗PD-1/PD-L1療法 (例えば、CheckMate-649やKEYNOTE-859試験におけるペムブロリズマブやニボルマブ) の生物学的根拠となった。MSIサブタイプの超変異は、MSI-high腫瘍に対する免疫チェックポイント阻害剤の高い奏効率 (KEYNOTE-059、KEYNOTE-062など) の機序的説明を提供した。CINサブタイプのHER2増幅 (約15-20%) は、トラスツズマブ (ToGA試験、Bang et al. 2010) の適応と一致し、その後トラスツズマブ デルクステカン (DESTINY-Gastric01/02) の開発へと繋がった。VEGFR2を標的とするラムシルマブ (REGARD試験、Fuchs et al. 2014 Lancet) の有効性は、CINサブタイプにおけるVEGFA増幅と整合する。特に、CLDN18-ARHGAP26/6融合遺伝子とCLDN18.2発現の同定は、抗CLDN18.2モノクローナル抗体であるゾルベツキシマブ (zolbetuximab) の臨床開発 (SPOTLIGHT/GLOW Phase III試験) と2024年のFDA承認に直接結びついた歴史的なtranslational impact を持つ。臨床現場では、既存のMSI/EBV検査に加えて、ターゲットNGS (ERBB2、PIK3CA、CDH1、RHOA、CLDN18融合) を組み合わせることで、本分類を適用することが可能である。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) GSサブタイプにおけるCLDN18.2以外の有効な治療標的のさらなる同定、(2) RHOA Y42C/D59変異の機能的下流経路とROCK阻害剤・mDia阻害剤の特異性の詳細な解明、(3) EBVサブタイプに対する抗PD-1療法の前向き検証、(4) MSI状態の予後予測因子としてのさらなる臨床実装、(5) 本研究の初期アウトカムデータで4サブタイプ間の生存差が認められなかった理由 (短い追跡期間や治療の異質性など)、(6) 同時期に公表されたACRG分類 (Cristescu et al. 2015 Nat Med) との統合可能性が挙げられる。本研究のlimitationとしては、(a) Helicobacter pyloriの検出が技術的な制約により散発的にしか確認できなかったこと (検体処理時の腔内細菌の喪失が原因の可能性)、(b) RPPAでカバーされたタンパク質が約200種類に限定されていたこと、(c) シングルセルレベルでの異質性や空間的異質性が未解析であること、(d) 295例の解析が単一時点のスナップショットであり、腫瘍の進化動態は不明であること、が指摘できる。関連文献として、Network et al. Nature 2012 は同じTCGAアプローチを用いた大腸癌の分子分類研究であり、Brixi et al. Nature 2026 のevo2ゲノムモデリングは将来のサブタイプ内サブタイプ解析プラットフォームとして相補的な役割を果たす可能性がある。
方法
患者および検体: 本研究では、先行する化学療法や放射線療法を受けていない295例の原発性胃腺癌患者から外科的に切除された新鮮凍結腫瘍組織検体を用いた。全ての患者からインフォームドコンセントを取得し、地域の治験審査委員会 (IRB) の承認を得て検体を収集した。体細胞異常の検出リファレンスとして、血液または非悪性胃粘膜由来の生殖細胞系列DNAを使用した。非悪性胃組織検体もDNAメチル化解析用にn=27例、遺伝子発現解析用にn=29例別途収集された。本研究はレトロスペクティブコホート研究として実施された。
マルチオミクス解析プラットフォーム: 各検体は、以下の6種類の分子プラットフォームを用いて包括的に解析された。全腫瘍の77%がこれら全てのプラットフォームで解析された。(1) アレイベースの体細胞コピー数解析 (SNPアレイ)。(2) 全エクソームシーケンス (WES)。(3) アレイベースのDNAメチル化プロファイリング。(4) メッセンジャーRNAシーケンス (mRNA-seq)。(5) マイクロRNAシーケンス (miRNA-seq)。(6) 逆相プロテインアレイ (RPPA)。さらに、全症例でマイクロサテライト不安定性 (MSI) の評価を実施した。107例の腫瘍/生殖細胞系列ペアでは、低深度 (約6倍未満) の全ゲノムシーケンス (WGS) を実施し、構造変異 (5,696件の再編成、74件のin-frame融合遺伝子予測) の解析を行った。
統計解析および統合解析: 分子サブタイプを定義するため、まず各分子プラットフォームデータに対してunsupervised clusteringを実施した。次に、iCluster (Shen et al. 2009 Bioinformatics) を用いて複数のデータタイプを統合的にクラスタリングし、4つのサブタイプを同定した。この結果に基づき、臨床応用が容易なdecision treeを構築した。この決定木は、まずEBV陽性度、次にMSI-high状態、最後に異数性の程度に基づいて、ゲノム安定型 (GS) と染色体不安定型 (CIN) に分類するものであった。有意に変異した遺伝子 (significantly mutated gene) の同定にはMutSigCV (Lawrence et al. Nature 2013) を使用し、215例の非超変異腫瘍と63例の超変異腫瘍を別々に解析した。GISTICツールを用いて、30箇所の局所増幅、45箇所の局所欠失、および染色体腕レベルの異常を同定した。HotNetを用いて経路レベルでの変異の収束を解析し、Paradigm-Shiftを用いて経路活性を評価した。Pathway Interaction Database (PID, Schaefer et al. 2009) に基づく経路スコアも算出した。統計解析にはFisher’s exact test、t-test、および多重比較補正が用いられた。全ての一次データはTCGAデータポータル (https://tcga-data.nci.nih.gov/) に公開されている。本研究には特定の臨床試験登録番号 (NCT番号) は付与されていないが、TCGAプロジェクトの一環として厳格なプロトコルに基づき実施された。