- 著者: Tanaka Y, Chiwaki F, Kojima S, Kawazu M, Komatsu M, Ueno T, Inoue S, Sekine S, Matsusaki K, Matsushita H, Boku N, Kanai Y, Yatabe Y, Sasaki H, Mano H
- Corresponding author: Tanaka Y, Sasaki H, Mano H (National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan)
- 雑誌: Nature Cancer
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-07-22
- Article種別: Original Article
- PMID: 35121863
背景
胃癌 (gastric cancer、GC) は世界における癌関連死因の第3位を占め、特に東アジアでの罹患率が高いことが報告されている Bray et al. CACancerJClin 2018。腹膜転移 (peritoneal metastasis) とそれに伴う悪性腹水 (malignant ascites) は、進行胃癌、特に diffuse type gastric cancer (DGC) において最も致死的な病態であり、現在のところ根治的治療法が存在しない極めて予後不良な臨床状態である。DGCは全胃癌の約半数を占め、その中でも腹膜転移は治療抵抗性が高く、患者の平均生存期間は3〜6ヶ月と極めて短いことが知られている。
先行研究として、TCGA stomach adenocarcinoma project Cancer et al. Nature 2014 は原発性胃癌を4つの分子サブタイプ (EBV-positive、microsatellite instability MSI-high、genomically stable GS、chromosomal instability CIN) に分類し、それぞれに特徴的なドライバー遺伝子変異を明らかにした。DGCは主にGSサブタイプに該当し、RHOA変異、CDH1変異、CLDN18-ARHGAP融合が特徴として挙げられる。また、Asian Cancer Research Group (ACRG) は別の4サブタイプ (MSI、MSS/EMT、MSS/TP53+、MSS/TP53-) を提唱し、MSS/EMTサブタイプが腹膜再発と最悪の予後と相関することを示した Cristescu et al. NatMed 2015。これらの研究は原発性胃癌の分子特性を明らかにする上で重要な貢献をしてきたが、腹膜転移という特定の病態に焦点を当てた包括的な解析は不足していた。
ゲノム解析の標準的な手法として、MutSigCV Lawrence et al. Nature 2013、GISTIC2 Mermel et al. GenomeBiol 2011、および変異シグネチャフレームワーク Alexandrov et al. Nature 2020 が確立されている。さらに、スーパーエンハンサー (SE) の概念は、系統決定転写因子のシス制御エレメントプライミングを示すものとして確立されている Heinz et al. MolCell 2010。これらの技術は、癌の分子メカニズムを深く理解するための強力なツールである。
しかし、これらの先行研究にはいくつかの主要な未解決問題が残されていた。(1) 腹膜転移GCの包括的なゲノム特性解析が十分に行われていなかった。原発腫瘍は間質成分が高く、正確なゲノムプロファイルの推定が困難であるという技術的な課題があった。(2) 悪性腹水由来の腫瘍細胞という高純度サンプルを活用した統合的なマルチオミクス解析 (全ゲノムシーケンス (WGS)、RNAシーケンス (RNA-seq)、H3K27ac クロマチン免疫沈降シーケンス (ChIP-seq)、DNAメチル化解析) が大規模に実施されていなかった。(3) 腹膜転移GCの分子サブタイプと治療標的となる脆弱性 (therapeutic vulnerability) が未同定であった。(4) DGC細胞株の利用可能性が限られており、薬剤感受性研究が不足していた。(5) スーパーエンハンサーランドスケープの腹膜転移GCへの寄与が未解明であった。「何が足りなかったか」を一言で言えば、腹膜転移GCの治療標的となりうる分子サブタイプフレームワークを、高純度腫瘍細胞とマルチオミクス統合解析によって構築する研究が不在であった。本研究はこの知識のギャップを埋めるべく実施された。
目的
本研究の目的は、(1) 進行胃癌患者の悪性腹水由来腫瘍細胞 (purified tumor cells) と対応する細胞株 (corresponding cell lines) を用いて、98例から得た233サンプルに対するWGS、RNA-seq、H3K27ac ChIP-seq、DNAメチル化の統合的マルチオミクス解析を実施することである。(2) 主要なドライバー遺伝子 (変異、コピー数、融合、構造変異) および変異シグネチャ、腫瘍変異負荷 (TMB) を同定すること。(3) トランスクリプトームベースの分子サブタイプ (上皮間葉転換 (EMT) vs non-EMT) を確立すること。(4) スーパーエンハンサーランドスケープを用いて各サブタイプのコア転写因子ネットワークを同定すること。(5) EMTサブタイプの治療抵抗性メカニズムを解明し、TEAドメイン転写因子 (TEAD) 経路阻害による治療脆弱性を実験的に証明することである。本研究は、腹膜転移胃癌の分子基盤を包括的に理解し、新たな治療戦略を開発するための基盤を築くことを目指した。
結果
Mutational landscape: 主要ドライバー遺伝子とPIGRの新規同定: 3つのアルゴリズム (MutSigCV2、dNdScv、MutPanning) 全てで有意と判定されたドライバー遺伝子として、CDH1、TP53、ARID1A、RHOA、KRAS、PIGRが同定された。SMAD4とKRT8は2つのアルゴリズムで支持され、ADGRG1、BRINP3、MYH9、SOX9、CDKN2A、KMT2D、KMT2Bは1つのアルゴリズムで支持された。特にPIGR (polymeric immunoglobulin receptor、IgA粘膜輸送受容体) は、本研究で初めて胃癌の新規ドライバー遺伝子候補として同定された。PIGR変異は9例中5例がフレームシフト変異、3例がナンセンス変異、1例がスプライス部位変異であり、主に切断型変異であった。TCGAコホートで再計算するとPIGR変異は3.4% (15/440)、Hong Kongコホートでは5% (5/100) で認められ、切断型変異の比率はそれぞれ67% (TCGA) および80% (Hong Kong) であった。PIGR変異はDGCにおいてCDH1変異やRHOA変異と有意な共起を示し、腫瘍抑制遺伝子としてポジティブセレクションを受けていると推定された (Fig. 2b,c)。
Mutational signaturesとTMB解析: 6つのユニークなSBSシグネチャが同定され、そのうち5つはCOSMIC参照シグネチャと一致した。これらはSBS1 (加齢)、SBS17b、SBS18、SBS35 (プラチナ化学療法)、SBS37であった。SBS17bとSBS35はそれぞれフルオロウラシルおよびプラチナ化学療法に関連しており、本コホートにおいて5-FU治療歴のある48例中36例 (75%)、プラチナ治療歴のある39例中23例 (59%) で対応するシグネチャが検出され、過去の標準化学療法の影響を反映していると考えられた。腫瘍変異負荷 (TMB) は、TCGA GCコホートと比較してMSI-highサブタイプよりも有意に低く、GSサブタイプよりも有意に高かった (Extended Data Fig. 1e)。これは腹膜転移GCのユニークなゲノムプロファイルを支持するものであった。
RTK-MAPK経路異常と高度増幅: RTK (receptor tyrosine kinase) / MAPK経路の異常は65%の症例で観察され、高度増幅 (>5× ploidy) は45%で認められた。これにはKRAS 19.4%、FGFR2 11.2%、MET 7.1%、ERBB2 5.1%、EGFR 4.1%が含まれた。TCGAの原発GC研究では、RTK遺伝子増幅の総頻度は37.2% (DGCで32.4%、GSサブタイプで17.5%) であり、腹膜転移GCでは原発GCよりもRTK増幅頻度が著しく高いことが示された (Extended Data Fig. 3b)。他の転移部位 (肝臓、リンパ節) とのコピー数異常プロファイルの比較では、腹膜癌細胞はKRASとFGFR2増幅頻度の増加、ERBB2増幅頻度の減少というユニークなパターンを示し、腹膜特異的な選択圧を示唆した (Fig. 2g)。遺伝子融合では、ARHGAP融合が5例 (CLDN18-ARHGAP26/6、CTNND1-ARHGAP26、新規RP2-ARHGAP6)、EML4-ALK融合が2例、AGK-BRAF融合が1例同定された。TP53経路の異常は61%で認められ、他の転移性GC (90%) と比べて若干低いがDGCの生物学的特徴を反映していると考えられた。
EMT vs non-EMTサブタイプの同定 (トランスクリプトーム分析): 59のGC細胞株の階層的クラスタリングにより2つの明確なクラスターに分割され、GSEAにより最も差次的に発現する遺伝子セットがEMT hallmarkであることが示された (Fig. 3a,b)。EMT 200遺伝子セットによる再クラスタリングにより、EMT群 (26細胞株) とnon-EMT群 (33細胞株) が確立された (Extended Data Fig. 4a,b)。EMT群はACRGのMSS/EMTサブタイプと整合し、予後不良な集団であった。EMT群はSMAD3 (TGFβ経路の下流エフェクター)、TGFβ1リガンド、TEAD1 (TEA domain transcription factor 1)、WWTR1 (TAZ) の高発現、TGFβ1の自己分泌促進、mTOR経路活性の低下、および抗腫瘍薬感受性の全体的な低下 (治療抵抗性) を特徴とした。一方、non-EMT群はFGFR2増幅が高頻度で、ELF3とKLF5転写因子の高発現、上皮分化マーカーの維持を特徴とした。TGFβ1の投与実験では、non-EMT群の細胞株でのみ増殖抑制が認められ、EMT群では影響がなかった (Fig. 3d)。
Hippo経路の活性化とTEAD1/TAZ/YAP1の高発現: EMT群とnon-EMT群間のGSEAにより、YAP_CONSERVED_SIGNATUREおよびGO_HIPPO_SIGNALINGの遺伝子セットがEMT群で濃縮されていることが明らかになった (Fig. 4a,b)。Hippo経路は細胞増殖と器官サイズを調節し、その下流エフェクターであるYAP (YAP1)、TAZ (WWTR1)、およびTEAD1/2/3/4はEMTプログラムと機能的に相互作用することが知られている。TEAD1、TEAD2、TEAD4、およびWWTR1はEMT細胞株で有意に過剰発現しており、精製腫瘍細胞でも同様のプロファイルが観察された (Fig. 4c)。SMAD3、TEAD1、およびリン酸化SMAD3 (pSMAD3) のタンパク質レベルも、EMT群の細胞株および精製腫瘍細胞の両方で増加していた (Fig. 4d, Extended Data Fig. 5c)。さらに、TCGAコホートの原発GCにおいても、Hippo経路遺伝子の発現レベルはEMT遺伝子高発現クラスターで有意に増加していた (Extended Data Fig. 5d)。
Super enhancer (SE) landscapeとcore transcription factor network: 44の細胞株のH3K27ac ChIP-seqとROSEアルゴリズムによりSEが同定された。EMT特異的SEはSMAD3とTEAD1遺伝子座に存在し、non-EMT特異的SEはELF3、KLF5、EHF遺伝子座に活性化が認められた (Fig. 5a,b)。EMT群のコア転写因子ネットワークは、SMAD3、RUNX1、BHLHE40、TEAD1が中心的なハブとして相互調節 (自己調節とクロスカップリングループ) を行っていた。non-EMT群のコア転写因子ネットワークは、ELF3、KLF5、EHFが上皮分化プログラムを維持していた (Fig. 5c)。SMAD3のノックダウンは、EMTの代表的な遺伝子であるFN1の発現を減少させ、SMAD3活性化がEMT表現型に因果的役割を持つことを示唆した (Extended Data Fig. 6c)。
TEAD経路阻害による治療脆弱性検証: EMT群の細胞株にTEAD経路阻害剤K-975を投与すると、non-EMT群よりも有意に低いIC50値を示し、EMT選択的な細胞毒性が確認された。EMT群はMET/FGFR2/KRAS増幅に由来する分子標的薬への抵抗性が高い一方で、TEAD阻害剤がEMT特異的な治療脆弱性として機能的に検証された。in vivoゼノグラフトモデルでも、TEAD阻害剤K-975はEMT由来腫瘍の増殖を有意に抑制し、全生存期間 (OS) を56日から109日へ有意に改善した (P = 0.03) (Fig. 8c)。MEK1/2阻害剤とK-975の併用療法は、EMT群の細胞株において相乗的な増殖抑制効果を示した (Fig. 8d)。
考察/結論
本研究は、胃癌腹膜転移という極めて予後不良かつ生物学的理解が限定的であった臨床状態に対する初の包括的マルチオミクスランドスケープ (98患者、233サンプル、WGS + RNA-seq + ChIP-seq + メチル化の統合解析) を確立し、EMT/non-EMTの2つの分子サブタイプを同定した。さらに、EMTサブタイプにおけるSMAD3-TEAD1-TGFβ軸を治療抵抗性の中核機序として位置づけ、TEAD経路阻害を新規治療脆弱性として実験的に検証したランドマーク研究である。これまでのTCGA stomach project Cancer et al. Nature 2014 やACRG Cristescu et al. NatMed 2015 が原発GCを主対象とした分子分類を提供してきたのと異なり、本研究は腹膜転移というユニークな臨床表現型を、高純度腹水由来腫瘍細胞を用いて体系的に特徴付けた点が、先行研究との根本的相違である。
本研究で初めて体系的に示された視点として、(1) PIGR (polymeric immunoglobulin receptor) を新規GCドライバー遺伝子候補として同定したことである。これは切断型変異が主体であり、CDH1およびRHOAとの有意な共起がTCGAおよびHong Kongコホートで再検証された。(2) 腹膜転移GCにおけるRTK経路異常が65%、高度増幅が45%という原発GCを上回る頻度で認められたことである。特にKRAS 19.4%、FGFR2 11.2%、MET 7.1%の増幅は治療標的となりうる。(3) EMTサブタイプにおけるSMAD3-TEAD1スーパーエンハンサー駆動型コア転写因子ネットワークが、H3K27ac ChIP-seqにより初めて体系的に解明されたこと。(4) TEAD経路阻害によるEMTサブタイプ選択的な治療脆弱性が示され、Hippo経路が標的治療として位置づけられたこと。(5) 悪性腹水由来の精製腫瘍細胞と対応する細胞株という研究プラットフォームが、原発GC腫瘍の間質成分の問題を回避し、高純度マルチオミクス解析と機能的検証を可能にする新規リソースとして確立されたこと、の5点が挙げられる。これまで報告されていない統合的視点として、原発GCと異なるエピジェネティック・トランスクリプトーム・ゲノム的特徴を持つ腹膜転移GCを一つの明確な疾患エンティティとして捉え、サブタイプ特異的な治療戦略 (EMTサブタイプはTEAD阻害、non-EMTサブタイプはFGFR2/MET等のRTK標的治療) を提唱した点が、novelな貢献である。
臨床応用の観点では、本研究の最も重要な臨床的意義は、(1) 腹膜転移GC患者に対するRTK-MAPK経路異常 (KRAS/FGFR2/MET/ERBB2/EGFR増幅) をスクリーニングする分子診断戦略の根拠を提供すること、(2) 臨床現場 (clinical practice) でEMT vs non-EMTサブタイプに基づく治療方針の分化という概念を導入すること、(3) TEAD経路阻害剤の早期臨床試験 (現在複数のTEAD阻害剤が第I/II相開発中、例IK-930、ION537) の対象集団選定における重要エビデンスとなること、(4) FGFR2増幅およびMET増幅 (高レベル >5× ploidy) を持つ腹膜転移GCへの選択的ターゲティング (bemarituzumab抗FGFR2b ADC、capmatinib抗MET等) 戦略の根拠となること、(5) Kojima et al. JClinOncol 2020 のPD-1阻害剤胃食道癌試験の患者選択バイオマーカー (TMB、MSIステータス) を補完する分子サブタイプベース層別化の基盤となること、の5点である。
残された課題として、TEAD阻害剤と他の分子標的薬や化学療法との併用療法の最適化、およびEMTサブタイプにおける治療抵抗性メカニズムのさらなる詳細な解明が残されている。Limitationとしては、本研究のコホートが単一施設由来であるため、結果の一般化にはさらなる大規模な多施設共同研究が必要である。
方法
Sample collection and processing: 本研究は、国立がん研究センター (東京) および金町病院 (東京) で治療を受けた進行胃癌患者106例から悪性腹水サンプルを収集した。このうち、76例で末梢血単核球 (PBMC) が入手可能であった症例において腫瘍細胞を精製した。精製された腫瘍細胞の純度は平均76.8 ± 18.5% (平均 ± 標準偏差) であった。また、59個体から対応する癌細胞株を樹立し、そのうち37例では精製細胞と細胞株のペアワイズ比較が可能であった。合計233サンプル (精製腫瘍細胞76、対応PBMC98、細胞株59) を解析対象とした。本研究は、国立がん研究センターの施設内倫理審査委員会 (承認番号 2015-108) の承認を得ており、患者からは書面によるインフォームドコンセントを取得した。
Multi-omic profiling: (a) WGS (whole-genome sequencing) はIllumina HiSeqプラットフォームでペアエンドリードを取得し、BWA Li et al. Bioinformatics 2009 を用いてヒト参照ゲノムhg19/GRCh38にアラインした。(b) RNA-seqにより遺伝子発現プロファイリングを76の精製腫瘍細胞と59の細胞株で実施した。(c) ChIP-seqはH3K27ac抗体を用いて44の細胞株で実施し、リードのアラインメントとピークコールはMACS Zhang et al. GenomeBiol 2008 を用いて行い、スーパーエンハンサーはROSEアルゴリズムで同定した。(d) DNAメチル化解析は全ゲノムバイサルファイトシーケンスにより実施した。
Variant calling and driver identification: 一塩基変異 (SNV) はGATK HaplotypeCallerとStrelkaを用いて検出した。コピー数異常 (CNA) はGISTIC2.0 Mermel et al. GenomeBiol 2011 を用いて有意な増幅/欠失ピークを同定した。構造変異 (SV) と融合遺伝子はMantaとカスタムパイプラインを用いて検出した。ドライバー遺伝子の同定には3つの相補的なアルゴリズムを用いた: (a) MutSigCV2 Lawrence et al. Nature 2013 は背景変異率モデルに基づく統計的有意性を評価し、(b) dNdScvは非同義/同義変異率の比較により、(c) MutPanning Dietlein et al. NatGenet 2020 はヌクレオチドコンテキストに基づくドライバー変異とパッセンジャー変異の識別を行った。これら3つのアルゴリズム全てで支持された変異を有意なドライバー変異と定義した。変異シグネチャはCOSMIC v3参照 Alexandrov et al. Nature 2020 に対する非負値行列因子分解により6種類のSBS (single-base substitution) シグネチャを同定した。
Transcriptome clustering and pathway analysis: 59のGC細胞株のRNA-seq発現プロファイルを階層的クラスタリングにより2つのクラスターに分割した。GSEA Subramanian et al. ProcNatlAcadSciUSA 2005 を用いて、hallmark gene sets (MSigDB) に対して差次的に発現する遺伝子セットを評価し、EMT hallmark gene setの200遺伝子を用いて再クラスタリングを行い、EMT群とnon-EMT群を確立した。
Functional validation of TEAD inhibition: EMTサブグループの細胞株にTEAD経路阻害剤を投与し、細胞生存率/増殖アッセイ (CTG、CellTiter-Glo) によりIC50を算出した。in vivoゼノグラフトマウスモデル (免疫不全マウス、皮下注射) で腫瘍増殖を評価した。統計解析にはMann-Whitney U検定、Fisher’s exact test、Spearman相関を用いた。データはJGA (Japanese Genotype-phenotype Archive、アクセッションJGAS00000000xxx) に寄託された。