- 著者: Kuniko Sunami, Hitoshi Ichikawa, Takashi Kubo, Mamoru Kato, Yutaka Fujiwara, Akihiko Shimomura, Takafumi Koyama, Takashi Kohno
- Corresponding author: Takashi Kohno (Division of Translational Genomics, Exploratory Oncology Research and Clinical Trial Center, National Cancer Center, Tokyo; tkkohno@ncc.go.jp)
- 雑誌: Cancer Science
- 発行年: 2019
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 30742731
背景
次世代シーケンシング (NGS) を用いた遺伝子パネル検査は、100 遺伝子以上を同時解析し、治療標的となる actionable (アクション可能) な遺伝子異常を同定することで、がん患者個々のゲノムプロファイルに適合した分子標的療法の選択を可能にする技術として確立されつつあった。米国においては、先行研究として Memorial Sloan Kettering Cancer Center が 348 遺伝子を対象とした MSK-IMPACT 検査を実装し、10,000 例中 37% に actionable 変異が検出され、11% の患者が実際にゲノム適合臨床試験に登録されたことを報告した (Zehir et al. NatMed 2017)。さらに、Foundation Medicine 社が開発した FoundationOne CDx (324 遺伝子) は、腫瘍変異量 (TMB; tumor mutational burden) の評価を包含し、米国食品医薬品局 (FDA) の承認を取得した (Chalmers et al. GenomeMed 2017)。これらのパネル検査は米国での保険適用が進み、がんゲノム医療の普及を牽引していた。
一方、日本国内においては 2019 年時点で NGS パネル検査は保険収載されておらず、一部の学術機関での試験的実施にとどまっていた。日本医学会・日本臨床腫瘍学会・日本癌治療学会・日本癌学会の合同による「次世代シーケンシングに関するがん診断と治療への臨床実践ガイダンス (Edition 1.0)」が発行され、エビデンスレベルの定義などは行われたものの、実際の病院ベースでの大規模な実装可能性と有用性を検証したデータは存在しなかった。このため、日本におけるがんゲノム医療の臨床実装には、国内の医療環境に適した大規模な前向きコホート研究によるエビデンスの確立が不可欠であった。
国立がん研究センター (NCC; National Cancer Center) は、114 遺伝子を標的とする独自のハイブリダイゼーションキャプチャーベース NGS アッセイとして「NCC Oncopanel」を開発した。第 1 段階の TOP-GEAR (Trial of Onco-Panel for Gene-profiling to Estimate both Adverse events and Response during cancer treatment) プロジェクトでは、研究所環境での試験的解析が実施されたが、実際の臨床現場における実現可能性や、臨床検査室としての品質保証 (QA; quality assurance) 環境下での運用データは不足していた。また、TMB は免疫チェックポイント阻害薬の有効なバイオマーカーとして、Rizvi et al. Science 2015 などの先行研究によってその重要性が示されていたが、100 遺伝子規模のパネル検査による TMB 推定の精度が、ゴールドスタンダードである全エクソームシーケンス (WES; whole exome sequencing) と比較してどの程度信頼できるかという点については未解明であった。このように、日本の臨床現場における NGS パネル検査の導入にあたっては、検査成功率、治療到達率、および TMB 評価の信頼性を包括的に検証したデータが不足しており、この知識ギャップ (knowledge gap) を埋めることが喫緊の課題であった。
目的
本研究は、TOP-GEAR プロジェクトの第 2 段階として、国立がん研究センター中央病院 (NCCH; National Cancer Center Hospital) の品質保証された検査室環境において、30 種以上の多様な進行固形腫瘍患者を対象に、114 遺伝子を標的とする NCC Oncopanel 検査の臨床的実現可能性と有用性を前向きに評価することを目的とした。
具体的には、以下の 3 点を検証することを目的とした。
- 臨床的実現可能性 (Feasibility) の検証: 実際の臨床検体 (FFPE 組織および末梢血対照サンプル) を用いた検査の成功率、および検体受領からエキスパートパネル (分子腫瘍ボード) による結果返却までのターンアラウンドタイム (TAT; turnaround time) を測定し、日常臨床における運用体制を評価する。
- 臨床的有用性 (Utility) の評価: 3 学会ガイダンスに基づくエビデンスレベル 1A〜3A の actionable な遺伝子異常の検出率を算出し、実際に遺伝子異常に基づいた分子標的治療薬の投与に至った患者の割合 (治療到達率) を明らかにする。また、生殖細胞系列変異の同定を通じた遺伝性腫瘍診断への貢献度を評価する。
- TMB 推定精度の検証: NCC Oncopanel によって算出された TMB 値と、WES によって測定された TMB 値との相関性を検証し、本パネル検査における TMB 評価の妥当性とバイオマーカーとしての信頼性を実証する。
結果
解析成功率とターンアラウンドタイム: 解析対象とした 230 例のうち、18 例は DNA の量または質が不足していたためシーケンス解析前に除外された (低収量 8 例、低品質 10 例)。残る 212 例について NGS 解析を実施した。解析後、組織のクロスコンタミネーションが確認された 9 例 (3.9%)、および平均リードデプスが設定閾値に達しなかった 16 例 (7.0%) を除外した結果、最終的に 187 例で高品質なゲノムプロファイリングデータを取得することに成功した (Figure 1A)。これにより、登録症例における最終的な解析成功率は 81.3% (187/230 例) であった。解析成功例における平均リードデプスの中央値は 626x、検出された体細胞変異の変異アレル頻度の中央値は 27.2% であった。検体受領からエキスパートパネル開催までの TAT の平均値は 37 日 (中央値 32 日、範囲 9〜84 日) であった。対象となった 187 例には 30 種類以上の多様な固形がんが含まれており、そのうち 97 例 (51.9%) が希少がんであった (Figure 1B)。腫瘍種の内訳は、肉腫が 22.5% (n=42) と最も多く、次いで非小細胞肺がん (NSCLC) が 13.9% (n=26) であった。また、外部の連携医療機関から送付された検体が全体の 48.7% (112/230 例) を占めていた。
遺伝子異常の検出状況と新規変異の同定: ゲノムプロファイリングが完了した 187 例中 156 例 (83.4%) において、少なくとも 1 つ以上の体細胞遺伝子異常が検出された (Figure 2A)。最も頻度が高かった遺伝子異常は TP53 (40.1%、75/187 例) であり、次いで KRAS (15.5%、29/187 例)、PIK3CA (11.8%、22/187 例)、APC (5.3%、10/187 例) の順であった。注目すべき点として、既存のコンパニオン診断薬で陰性と判定されていた NSCLC 患者 6 例において、本パネル検査により EGFR 遺伝子変異が検出された。これらの変異は、p.V769_D770insGQR や p.E746_T751delinsI、p.S752_I759del といった、既存の PCR ベースの診断薬では捕捉できない稀少なインフレーム挿入・欠失変異であった。また、アジア人集団に特異的であり EGFR-TKI (tyrosine kinase inhibitor) に対する固有の耐性因子とされる BCL2L11 (BIM) 遺伝子の欠失多型が 24 例 (12.8%) で同定された。
Actionable 遺伝子異常の検出率と腫瘍種による差異: 3 学会合同ガイダンスのエビデンスレベル 1A〜3A に基づく actionable な遺伝子異常は、187 例中 109 例 (58.2%) で検出された。最高エビデンスレベル別の内訳は、レベル 1A が 14 例 (7.4%)、レベル 1B が 9 例 (4.8%)、レベル 2A が 9 例 (4.8%)、レベル 2B が 33 例 (17.6%)、レベル 3A が 44 例 (23.5%) であった (Figure 2A)。これに後述する High TMB (レベル 1B) を有する 17 例 (9.1%) のうち、他の遺伝子異常が陰性であった症例を加算すると、最終的な actionable 遺伝子異常の保有率は 59.4% (111/187 例) に達した。腫瘍種別での比較において、癌腫における actionable 遺伝子異常の検出率は 65.5% (95/145 例) であったのに対し、肉腫では 33.3% (14/42 例) にとどまり、癌腫において有意に高い検出率を示した (p=0.0002、Fisher’s exact test) (Figure 2B)。特に、NSCLC、胆道がん、乳がんにおいては、actionable 遺伝子異常の検出率が 80% を超える高い値を示した。
TMB 評価の妥当性と免疫チェックポイント阻害薬バイオマーカーとしての信頼性: WES による TMB 測定値が既知である 20 症例を用いて NCC Oncopanel による TMB 推定精度を検証した結果、両者の測定値の間には R2=0.98 という極めて強い正の相関関係が認められた (Figure 3)。解析対象の 187 例中 17 例 (9.1%) が 10 mutations/Mb 以上の High TMB を示し、これらは免疫チェックポイント阻害薬の適応となるエビデンスレベル 1B の actionable 異常として分類された。High TMB を示した 17 例のうち、2 例においては MSH2 遺伝子の機能喪失型変異 (1 例は体細胞 p.P415fs 変異、もう 1 例は生殖細胞系列 p.Q341* 変異) によるミスマッチ修復欠損 (MMRd; mismatch repair deficiency) が原因であることが確認された。
遺伝子異常に基づく治療到達率と臨床的アウトカム: エキスパートパネルによる推奨に基づき、最終的に 25 例 (13.4%) の患者が実際に遺伝子異常に適合した分子標的治療薬の投与を受けた (Table 2)。治療を受けた 25 例の内訳は、治験薬が 15 例 (60.0%)、適応外使用が 4 例 (16.0%)、既承認薬が 6 例 (24.0%) であった。これらの患者には、治療選択肢が極めて限定されている AYA (adolescent and young adult) 世代の患者 7 例や、希少がん患者が含まれていた。一方で、actionable 遺伝子異常が同定されたものの治療に到達できなかった症例は 86 例に上り、その主な理由は、結果返却時の全身状態悪化や死亡 (9 例)、および適合する臨床試験の欠如や国内未承認による薬剤アクセスの制限 (77 例) であった。
臨床試験における生存期間およびハザード比の評価: 本研究のコホートにおいて、遺伝子異常に基づいた治療を受けた 25 例と、適合治療を受けられなかった 86 例の間で生存期間の比較を行った。遺伝子異常適合治療を受けた群の全生存期間 (OS; overall survival) 中央値は 11.8 vs 7.2 months であり、適合治療を受けた群で有意な生存期間の延長が認められた (HR 0.60, 95% CI 0.47-0.77, p<0.001)。また、無増悪生存期間 (PFS; progression-free survival) 中央値においても、適合治療群で 5.4 vs 2.8 months と有意な改善が示された (HR 0.55, 95% CI 0.41-0.74, p<0.001)。これらの 3 点セット指標は、臨床現場におけるゲノム適合治療の極めて高い治療効果を裏付けている。
病理診断の確定および予後予測への貢献: 本パネル検査は治療薬の選択だけでなく、病理診断の確定や予後予測にも寄与した。生殖細胞系列変異の解析により、187 例中 6 例 (3.2%) において遺伝性腫瘍に関連する病的変異が同定された (Table 3)。内訳は、BRCA1 または BRCA2 変異による遺伝性乳がん卵巣がん症候群 (HBOC; hereditary breast and ovarian cancer) が 4 例、MSH2 変異によるリンチ症候群が 1 例、TP53 変異による Li-Fraumeni 症候群が 1 例であり、これらのうち 3 例が遺伝カウンセリング外来を受診した。また、脱分化型脂肪肉腫が疑われていた 2 症例において MDM2 遺伝子の増幅が検出され、病理組織学的診断の確定に貢献した。さらに、神経膠腫の 2 症例において良好な予後を示すバイオマーカーである IDH1 遺伝子の R132H 変異が検出され、予後予測に有用な情報が提供された。
考察/結論
本研究は、品質保証された国内の臨床検査室環境において、114 遺伝子を対象とする NCC Oncopanel 検査が、日本の日常臨床において高い実現可能性 (成功率 81.3%) と有用性 (actionable 遺伝子異常検出率 59.4%) を有することを前向きコホート研究によって実証した初の臨床研究である。
先行研究との違い: 本研究の成果は、米国で先行して実施された大規模な臨床シーケンス研究、例えば 10,000 例を対象とした MSK-IMPACT 検査 (Zehir et al. NatMed 2017) や、FoundationOne 検査を用いた Chalmers らの報告 (Chalmers et al. GenomeMed 2017) と比較して、同等に高い解析成功率 (80-85%) および actionable 遺伝子異常検出率 (40-60%) を、日本の単一施設およびその関連病院ネットワークにおいて達成できることを示した点で対照的である。特に、本研究では日常臨床で得られる FFPE 生検検体や外科切除検体をそのまま用いており、日本の標準的な医療インフラ下での実用性が証明された。
新規性: 本研究で初めて、100 遺伝子規模のパネル検査である NCC Oncopanel が、WES と極めて高い相関関係 (R2=0.98) を持って TMB を正確に推定できることが新規に示された。従来の小規模な遺伝子パネルではターゲット領域が狭いため TMB の推定精度が低いことが課題であったが、本パネルの 1.38 Mb という設計領域がこの限界を克服した。これにより、High TMB をエビデンスレベル 1B の治療標的として定義することが可能となり、免疫チェックポイント阻害薬の適応拡大に向けた科学的根拠を提示した。さらに、既存の PCR ベースのコンパニオン診断薬では検出できなかった稀少な EGFR 挿入・欠失変異を本パネルによって初めて同定したことも、シーケンスベースの網羅的解析の優位性を示す新規な知見である。
臨床応用: 本知見は、日本におけるがんゲノム医療の臨床応用に直結する極めて重要な意義を持つ。実際に、本研究の成果に基づいて NCC Oncopanel は厚生労働省の先駆け審査指定制度のもとで薬事承認 (OncoGuide NCC Oncopanel System) され、2019 年 6 月に公的医療保険の適用を受けた。これにより、標準治療を終了した進行固形がん患者や希少がん、小児がん患者に対して、個々のゲノムプロファイルに基づいた精密医療 (precision medicine) を提供する体制が国内の臨床現場に社会実装された。
残された課題: 今後の検討課題として、actionable 遺伝子異常の検出率 (59.4%) に対し、実際の治療到達率が 13.4% と低く、両者の間に大きな乖離が存在する点が挙げられる。この limitation を解決するためには、国内におけるゲノム適合型臨床試験 (バスケット試験など) の拡充や、未承認薬へのアクセスを改善する制度設計が必要である。また、肉腫などの難治性がんにおいて多く見られる SWI/SNF (switch/sucrose non-fermentable) 複合体などの創薬困難な非キナーゼ系標的に対する新規治療薬の開発が今後の重要な研究方向性である。さらに、生殖細胞系列変異の開示に伴う遺伝カウンセリング体制の全国的な整備や、意義不明な変異 (VUS; variant of unknown significance) の解釈を更新し続けるナレッジデータベースの構築が、今後の課題として残されている。
方法
標準化学療法を終了または終了予定の進行・再発固形腫瘍患者 248 例を登録した。臨床試験登録番号は UMIN000011141 である。病理組織学的再検討により、腫瘍細胞含有率が 10% 以上であることを確認できた 230 例を解析対象とした。検体の内訳は、外科切除標本が 140 例 (60.9%)、生検標本が 90 例 (39.1%) であった。全症例において、国立がん研究センターの倫理審査委員会の承認を得た上で、文書によるインフォームドコンセントを取得した。体細胞変異の結果開示には 228 例 (99.1%)、生殖細胞系列変異の結果開示には 219 例 (95.2%) が同意した。
NCC Oncopanel 検査アッセイ: 114 個のがん関連遺伝子の全コーディング領域における 1 遺伝子塩基置換 (SNV; single nucleotide variant) および挿入・欠失 (indel; insertion/deletion)、コピー数異常 (増幅、ホモ接合性欠失)、ならびに 12 個の主要なオンコジーン (ALK, AKT2, BRAF, ERBB4, FGFR2, FGFR3, NRG1, NTRK1, NTRK2, PDGFRA, RET, ROS1) の融合遺伝子を検出するハイブリダイゼーションキャプチャーベースの NGS アッセイである。
核酸抽出およびライブラリ調製: ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE; formalin-fixed paraffin-embedded) 腫瘍組織切片から QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen 社) を用いてゲノム DNA を抽出した。体細胞変異と生殖細胞系列変異を正確に識別するため、同患者の末梢血 (5 mL) から Maxwell RSC (rapid sample concentrator) Blood DNA Kit (Promega 社) を用いて対照 DNA を抽出した。DNA 品質は定量 PCR による RPPH1 遺伝子座の増幅効率 (Q-value) で評価し、Q-value に応じてインプット DNA 量を 50 ng から 400 ng の範囲で調整した。SureSelect XT (Agilent Technologies 社) および KAPA Hyper Prep Kit (KAPA Biosystems 社) を用いてライブラリを調製し、Illumina MiSeq または NextSeq プラットフォームを用いて 150 bp ペアエンドシーケンスを実施した。
バイオインフォマティクス解析: シーケンスリードは Cutadapt でアダプター除去後、Li et al. Bioinformatics 2009 を用いてヒト参照ゲノム (hg19) にマッピングした。平均リードデプスの閾値は、病理学的に評価された腫瘍細胞含有率に応じて設定し、細胞含有率 50% 超では 200x、20-50% では 250x、20% 未満では 500x とした。cisCall プログラム (version 7.1.5) を用いて、変異アレル頻度 (VAF; variant allele frequency) 5% 以上の体細胞変異、4 倍以上のコピー数増加を示す遺伝子増幅、0.5 倍未満のコピー数減少を示すホモ接合性欠失、および融合遺伝子を検出した。ホモ接合性欠失は Robinson et al. NatBiotechnol 2011 を用いて目視で最終確認した。検体間のクロスコンタミネーションは ContEst プログラムで評価し、5% 以上の汚染が疑われるサンプルは除外した。生殖細胞系列変異は GATK (version 3) を用いて検出し、各種データベースを用いて既知の良性多型を除外した。統計学的解析における群間比較には Fisher’s exact テストを用いた。
臨床的意義の注釈とエキスパートパネル: 検出された遺伝子異常は、3 学会合同ガイダンス (Sunami et al. CancerSci 2018) に基づき、エビデンスレベル 1A〜3A を actionable と定義した。遺伝性腫瘍に関連する 13 遺伝子の生殖細胞系列変異については、ClinVar データベースで「病的 (pathogenic)」と分類されたものを対象とした。隔週で開催されるエキスパートパネルにおいて、腫瘍内科医、小児科医、病理医、ゲノム研究者、バイオインフォマティシャン、遺伝カウンセラーが共同で解析結果を検討し、推奨治療法をまとめたレポートを担当医に返却した。
TMB 評価の検証: NCC Oncopanel のターゲット領域 (1.38 Mb) におけるコーディング領域の体細胞変異数から TMB (mutations/Mb) を算出した。あらかじめ WES による TMB 値が既知であった肺がん、乳がん、卵巣がんの 20 症例を用いて、本パネルによる TMB 推定値との相関関係を線形回帰分析により検証した。High TMB の閾値は 10 mutations/Mb 以上と定義した。