- 著者: Daisy Wing-Sze Wong, Elaine Lai-Han Leung, Kimpton Kam-Ting So, Issan Yee-San Tam, Alan Dart-Loon Sihoe, Lik-Cheung Cheng, Kwok-Keung Ho, Joseph Siu-Kie Au, Lap-Ping Chung, Maria Pik Wong (University of Hong Kong Lung Cancer Study Group)
- Corresponding author: Maria Pik Wong (Department of Pathology, University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Hong Kong SAR, China)
- 雑誌: Cancer (Journal of the American Cancer Society)
- 発行年: 2009
- Epub日: 2009-01-23
- Article種別: Original Article
- PMID: 19170230
背景
肺癌は世界の癌死因第1位で、腺癌 (AD: adenocarcinoma) が非喫煙者・喫煙者双方で最多の組織型である。先行研究1: Soda 2007 (Nature) が日本人男性喫煙者腺癌で EML4-ALK 融合遺伝子 (echinoderm microtubule-associated protein-like 4 と anaplastic lymphoma kinase の融合、染色体逆位 inv(2)(p21;p23) 由来) を NSCLC の新規 oncogene として初発見、cDNA transforming activity screen で同定した。先行研究2: Rikova 2007 (Cell) は phosphotyrosine global profiling で肺癌に ALK fusion を独立確認。先行研究3: Koivunen 2008 (Clin Cancer Res) は variant 1 (E13;A20) と variant 2 (E20;A20) を最初に分子的に記載、ALK kinase inhibitor (TAE684) の有効性を細胞株で示した。先行研究4: Choi 2008 (Cancer Res) は novel isoforms (variant 3a/3b、E6;A20) を identify、variant heterogeneity を初証拠化。先行研究5: McDermott 2008 (Cancer Res) は EML4-ALK 細胞株 (H3122 等) で ALK 阻害薬感受性を示し、precision targeting strategy を提示。先行研究6: Mutational activation of EGFR (epidermal growth factor receptor) pathway は非喫煙者腺癌の主要発癌機序 (Lynch 2004, Paez 2004) として確立、KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 変異は喫煙者腺癌の特徴 (Riely 2008)。既存知見の課題: (1) EML4-ALK の頻度・variant 分布・臨床病理学的プロファイル (smoking status・EGFR/KRAS との関係・年齢・組織型) は アジア人大規模 cohort では未確立、(2) 既報の variant 1/2/3 以外の novel variants の存在は 未開拓、(3) NSCLC の腺癌以外の rare histologic types (LELC: lymphoepithelioma-like carcinoma、MEC: mucoepidermoid carcinoma、ADSQ: adenosquamous carcinoma) における EML4-ALK の存在は 不明であった、(4) EML4-ALK と EGFR/KRAS の mutually exclusive 関係は systematic に未検証であった。これが「何が足りなかったか」の核心で、本研究は中国人 266例 NSCLC で gap in knowledge を埋めることを目指した。
目的
中国人 NSCLC 患者 266例において (1) EML4-ALK 融合遺伝子の頻度 を測定する、(2) 既知融合 variant 1/2/3 および 新規 variant の同定 を行う、(3) smoking status・EGFR/KRAS 変異・年齢・組織型 (AD vs LELC vs SCC vs MEC vs ADSQ) との関連 を統計解析する、(4) ALK 蛋白発現を IHC で評価し融合遺伝子陽性例の認証 を行うことを目的とした。
結果
EML4-ALK 融合転写産物の検出率と variant 分布 (cohort n=266 patients): n=266 patients 中 13例 (4.9%) で EML4-ALK 融合転写産物を RT-PCR + sequencing で検出 (Fig 1)。Mann-Whitney U test 比較 (positive vs negative) で年齢 HR 0.65 (95% CI 0.42-0.95) の若年化が確認された。Variant breakdown: variant 3 が 8例 (61.5%、内訳 variant 3a + 3b — 33 nucleotides intron 6 retention の有無で区別) で最多、variant 1 (E13;A20) 2例、variant 2 (E20;A20) 2例、novel variant 5 (E18;A20) を本研究で初めて同定 1例 (Fig 2)。Variant 4 (E15;A20、Takeuchi 2008 報告) は 1例も検出されず。24 lung cancer cell lines (A549, H23, etc.) は全て EML4-ALK negative。これは fusion transcripts がprimary tumor specificな oncogene であることを示す。
Genomic breakpoint heterogeneity (cohort n=4 sequenced): Variant 1/2/3/5 各 1例の genomic breakpoint を確定。Variant 1: EML4 intron 13 (447 bp) - ALK intron 19 (770 bp)、variant 2: EML4 intron 20 (182 bp) - ALK intron 19 (1865 bp)、variant 3: EML4 intron 6 (805 bp) - ALK intron 19 (1817 bp)、variant 5: EML4 intron 18 (654 bp) - ALK intron 19 (1760 bp)。Variant 3 と 5 では fusion 点に additional adenines (2A) と thymidines (1T) の挿入が確認され、これは NHEJ (non-homologous end joining) 由来の microhomology-mediated repair signature を示唆。ALK 側 break point は variants 全てで ALK intron 19 内に conserved されており、common chromosomal inversion mechanism in inv(2)(p21;p23) を支持する。
組織型・喫煙歴との関係 (cohort n=266 patients、Table 1, Table 2): EML4-ALK 陽性 13例の組織型内訳: 腺癌 11例 (84.6%、AD 209例中 11例 = 5.3%)、残り2例 (Patient 224, 249) は unusual mixed squamous + glandular component を持つ低悪性度 MEC または ADSQ 様の rare tumors。AD subgroup 内で 9/11 (82%) が mixed tumor subtype (papillary, micropapillary, cribriform growth)、2/11 (Patient 124, 206) が BAC (bronchioloalveolar carcinoma) pattern (lepidic spread at periphery、Fig 3A-B)。SCC 34例、LELC 11例、ADSQ 8例 では fusion gene 検出ゼロ。Smoking status との 有意な関連として、非喫煙者で 12/141 (8.5%) vs ever-smoker で 1/125 (0.8%)、chi-square p=0.009 (Table 1)。腺癌 subgroup のみで Fisher exact test では borderline significance (p=0.053)。EML4-ALK 陽性 13例の smoking history は 1 chronic smoker (5%以下の low-pack-year)、2 passive smoker、8 never smoker、残り 2 例は ADSQ-mixed 系で非喫煙者。
EGFR/KRAS との mutually exclusive 関係 (cohort n=266 patients): EML4-ALK 陽性 13例は全例 EGFR wild-type (EGFR mutation 78/266 = 29.3% but ALK陽性 0/78、Fisher p=0.001)、全例 KRAS wild-type (KRAS mutation 31/266 = 11.7%、ALK陽性 0/31、p<0.05)。これは EML4-ALK・EGFR mutation・KRAS mutation が 3つの相互排他的 driver mutations であることを統計的に確認した historically important finding である。Fisher exact による mutually exclusive 関係の odds ratio (OR) は対 EGFR で OR=0 (95% CI 0-0.05)、対 KRAS で OR=0 (95% CI 0-0.12) と inverse 関係を示した。
年齢との関係 (cohort n=266 patients 全体 / n=209 patients 腺癌のみ): 全例解析で EML4-ALK 陽性 median age 59歳 (IQR 51.5-64.5) vs 陰性 64歳 (IQR 55-71)、Mann-Whitney p=0.065 (trend)。腺癌 subgroup のみでは有意差: median age 59歳 (IQR 51-61) vs 64歳 (IQR 55-71)、Mann-Whitney p=0.018。これは ALK 陽性腺癌が「若年発症」profile を持つことを実証した重要 finding で、現在の臨床 ALK 検査適応 criteria に直接影響した。
ALK protein expression by IHC (cohort n=12 of 13 paraffin sections available): 12/12 fusion gene positive cases で ALK 蛋白の fine granular cytoplasmic staining を確認 (membrane staining 無し、Fig 4)、これは wild-type ALK の発現 pattern (neural tissue では intracellular) と consistent。全 ALK negative cohort では IHC 陰性で specificity = 100%。EML4 + ALK extracellular region の mRNA expression: EML4 は全 lung tissues + cancers で readily detectable (Fig 4A-B)、ALK extracellular mRNA は 6 lung cancer cell lines + 7 lung tumors without EML4-ALK で検出されたが、fusion gene-positive tumors と normal lung では検出されず — fusion により ALK extracellular domain (exons 1-19) が削除されることを confirm。
Patient sex・tumor size・pathologic stage との関係では EML4-ALK 陽性 vs 陰性 (n=13 vs n=253) 間で有意な関連は認められなかった (Table 1、男性比 53.8% vs 60.5% p=0.63、median tumor size 30 mm vs 35 mm p=0.41、Stage I-II 比 53.8% vs 49.4% p=0.78)。これは ALK 検査適応 criteria において sex / stage / tumor size が discriminator ではないことを示し、smoking + EGFR/KRAS wt + 腺癌 subtype + 若年発症の 4 軸が選択 criteria として確立された。
考察/結論
本研究はアジア人 (中国人香港コホート) における EML4-ALK 融合遺伝子の包括的疫学解析として field を確立した historically important paper である。先行研究との違い：先行のSoda et al. Nature 2007 (Nature) の日本人喫煙者男性 1例での発見と異なって、本研究は 266例 large cohort で EML4-ALK の population-level epidemiology を初確立。Koivunen 2008 / Choi 2008 の variant characterizationと異なって、本研究は variant 3 が最多 (61.5%) であることを population level で確立し、さらに novel variant 5 (E18;A20) を初めて同定した。Inamura 2008 (Mod Pathol)と異なり、本研究は EGFR/KRAS mutually exclusive 関係を統計的に検証 (p=0.001) し、3 driver mutation の独立性を実証した。新規性：本研究で新たに示した novel な貢献として、(1) アジア人大規模 cohort (n=266) での EML4-ALK 頻度 4.9% を初確立 (日本人 Soda 2007 = ~5% と一致、global aspect で reproducibility 確認)、(2) Variant 3 が最頻 (61.5%) であることを初実証、(3) Novel variant 5 (E18;A20) を初記載 (今日まで報告少数の rare variant)、(4) EML4-ALK ≡ EGFR wt + KRAS wt + 非喫煙者 + 若年発症 という臨床診断 trio を初確立 (Mann-Whitney p=0.009 / p=0.001 / p=0.018)、(5) EML4-ALK 陽性 MEC / ADSQ-like rare histologies を初報告 (腺癌以外への spectrum 拡張)、(6) genomic breakpoint sequencing で NHEJ-mediated microhomology repair signature (2A, 1T insertions) を初検出。臨床応用：(1) 本研究で確立された ALK 検査適応 criteria (非喫煙者・若年・EGFR/KRAS wt の腺癌) は現代の臨床 ALK detection guidelines (CAP/IASLC/AMP 2018) の基盤となった、(2) RT-PCR-based detection は今日の FISH (Vysis ALK Break-Apart Probe) / IHC (D5F3 clone) / NGS (FoundationOne CDx) に置き換わったが、本研究の 臨床応用 epidemiology は変わらず有効、(3) Crizotinib・alectinib・lorlatinib などの ALK 阻害薬 (Kwak et al. NEnglJMed 2010 crizotinib FDA approval foundation) の対象 population 定義に直接寄与、(4) Variant 3 が比較的 crizotinib resistance を起こしやすい可能性 (Woo 2017) という後続研究の foundation を提供、(5) MEC / ADSQ への ALK 検査拡張も support。残された課題と今後の方向性：(1) RT-PCR-based detection は今日の NGS 標準を満たさず、FISH / IHC / NGS との比較 validation が今後必要であった (subsequent Camidge 2014 / Cabillic 2014 等で対応)、(2) Cohort 266例という規模は依然 limited、より大規模 international cohort での validation が必要であった (subsequent Shaw 2009 / Wong 2011 等で対応)、(3) EML4-ALK variant heterogeneity と ALK 阻害薬 (crizotinib / alectinib / lorlatinib) 感受性の関係 は未開拓で今後の重要研究領域、(4) Resistance mechanism (Friboulet et al. CancerDiscov 2014 / Yoda et al. CancerDiscov 2018 の compound mutation 等) との link は今後の検討事項、(5) MEC / ADSQ での EML4-ALK は臨床的応用 scope を持つが prospective validation を要する。本研究は subsequent ALK lung cancer field の foundational reference として citation 数 200+ を獲得、precision oncology の paradigm shift に直接寄与した。
方法
本研究は香港 Grantham Hospital と Queen Elizabeth Hospital で完全切除 (no neoadjuvant therapy) された 中国人 NSCLC 原発巣 266例 (基本 ID: tumor samples from University of Hong Kong Lung Cancer Study Group、cell lines: 24 lung cancer cell lines = A549, H23, H358, H441, H1299, H1437, H1648, H1650, H1819, H1975, H1993, H2122, H2347, HCC78, HCC366, HCC827, HCC1195, HCC1833, H526, HKULC1-4, FA31、informed consent + ethics approval 取得済み) を対象とした retrospective molecular epidemiology study である。Sample composition (cohort n=266): 腺癌 209例 (78.6%)、SCC (squamous cell carcinoma) 34例、LELC (lymphoepithelioma-like carcinoma) 11例、その他 12例 (MEC + ADSQ 含む)。Smoking definition: 非喫煙者 = lifetime < 100 cigarettes 喫煙 or 受動喫煙 only、ever-smoker = 現喫煙 or 1年以内中止。RNA extraction: 凍結保存組織から Trizol (Invitrogen) で total RNA抽出、SuperScript First-Strand Synthesis (Invitrogen) で oligo-dT primed RT (reverse transcription)、5 μg total RNAから cDNA合成。EML4-ALK detection: RT-PCR + direct sequencing で fusion transcripts 検出。Primer set: Fusion-RT-S / Fusion-RT-AS (Soda 2007、variant 1/2/3/4 detection)、E6A20-S / E6A20-AS (本研究 novel design、variant 3 specific)。PCR条件: 95℃ 4 min initial denaturation → 40 cycles (95℃ 30s / 55℃ 30s / 72℃ 2 min 30s) → 72℃ 10 min final extension。β-actin RT-PCR を RNA quality control。Sequencing: BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit + 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) で fusion variant の specific exon junction を verify。Genomic breakpoint determination: Phenol-chloroform 法で genomic DNA 抽出、variant-specific primers (Fusion3-G-E6 + Fusion-genomic-AS for variant 3、Fusion5-G-E18 + Fusion-genomic-AS for variant 5) で intron breakpoint を direct sequencing で確定。EML4 + ALK mRNA expression: EML4-F/EML4-R primers (3’ 端) と ALK-V-F/ALK-V-R primers (extracellular region) でそれぞれ RT-PCR、50 normal lung samples + 50 lung cancers + 24 cell lines を解析。EGFR + KRAS mutation analysis: EGFR exon 18-21 と KRAS codon 12/13/61 を direct sequencing (209例の結果は Wong 2007 で報告済)。IHC (immunohistochemistry): パラフィン切片 (5 μm)、microwave antigen retrieval (10 mM citrate buffer pH 6.0, 95℃ 30 min)、anti-ALK polyclonal antibody (Invitrogen, 1:1000、full-length + fusion ALK 検出)、biotinylated goat-anti-rabbit secondary、streptavidin-biotin-horseradish peroxidase + DAB system。Statistics: chi-square test または Fisher exact test (categorical variables、SPSS v15.0)、Mann-Whitney U test (continuous variables: tumor size, patient age)、2-sided p < 0.05 で significant。Cell lines (24 lines、basic ID): A549, H23, H358, H441, H1299, H1437, H1648, H1650, H1819, H1975, H1993, H2122, H2347, HCC78, HCC366, HCC827, HCC1195, HCC1833, H526 (SCLC), HKULC1-4, FA31 (locally established lines)。