- 著者: Emma Pailler, Vincent Faugeroux, Marianne Oulhen, Laura Mezquita, Mélanie Laporte, Aurélie Honoré, Yann Lecluse, Pauline Queffelec, Maud NgoCamus, Claudio Nicotra, Jordi Remon, Ludovic Lacroix, David Planchard, Luc Friboulet, Benjamin Besse, Françoise Farace
- Corresponding author: Françoise Farace (Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, Rare Circulating Cells Translational Platform, Villejuif, France)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-08-22
- Article種別: Original Article
- PMID: 31439588
背景
ALK 遺伝子再構成 (主に EML4-ALK) 非小細胞肺癌 (NSCLC) は約 3-5% に検出され、第 1 世代 crizotinib (ORR ~60%、PFS 9-11 か月) (Shaw et al. NEnglJMed 2013) で標準治療化されたが、ほぼ全例で 1 年以内に耐性を獲得する。第 2 世代 ceritinib・alectinib・brigatinib も crizotinib 耐性後 second-line で承認され、近年 alectinib・brigatinib は first-line でも有用性が示された (Shaw et al. NEnglJMed 2014、Camidge et al. ALEX 2017)。第 3 世代 lorlatinib は ALK 多変異および CNS 浸透に optimized され、第 2 世代耐性後にも有効である (Solomon et al. LancetOncol 2018)。
ALK-TKI 耐性機序は heterogeneous であり、後ろ向き組織生検解析では (1) on-target (ALK キナーゼドメイン二次変異・遺伝子増幅) が約 1/3、(2) off-target (EGFR、KRAS、c-KIT 等のバイパスシグナル活性化、lineage transdifferentiation) が大多数とされる (Katayama et al. SciTranslMed 2012、Gainor et al. CancerDiscov 2016)。第 2 世代以降では G1202R (solvent-front 置換) が約半数で出現する。Lorlatinib 耐性では compound mutations (同一 allele 上の複数変異) が in vivo mutagenesis screen と patient analysis で報告されている (Shaw et al. CancerCell 2017、Yoda et al. CancerDiscov 2018)。
しかし臨床診断において これまで 重大な gap が残されていた。第一に、組織生検は 侵襲的 で繰り返し実施が困難であり、tumor heterogeneity (空間的・時間的) の全貌を捉えられない点が 未解明 であった。第二に、ctDNA は便利だが apoptotic / necrotic 細胞由来であり viable tumorigenic clone の情報を保持しないため、metastatic progression に関与する clone を直接的に反映するか 未解明 であった (Jamal-Hanjani et al. NEnglJMed 2017 が ctDNA の限界を指摘)。第三に、circulating tumor cells (CTC) は viable clone を含み、空間的に異なる metastatic site から release されるため heterogeneity を捉える理論的 advantage があるが、ALK 領域での single-CTC sequencing による耐性機序解析は これまで ほとんど未実施で 臨床的に不足 していた。
目的
本研究は (1) 17 例の ALK-TKI 耐性 NSCLC (crizotinib 14 例 + lorlatinib 3 例) において、3 種類の CTC 分離技術 (ISET filtration + laser microdissection、FACS、DEPArray) で 126 CTC pools + 56 single CTCs を取得し、(2) 48 cancer-related gene + 14 ALK 耐性変異を網羅する 2 種類の targeted NGS panel で variant calling を実施し、(3) matched tumor biopsy と比較して single-CTC sequencing が “on-target” + “off-target” 耐性機序の両方を非侵襲的に検出可能かを検証し、(4) lorlatinib 耐性での compound mutation を single-cell レベルで同定可能かを評価することを目的とした。本研究は frontier exploratory study として CTC liquid biopsy paradigm の clinical utility を validate する初期段階の研究である。
結果
CTC 分離効率とシークエンス品質の確認: 3 戦略合計で 126 CTC pools (3-5 cells each) + 56 single CTCs を 17 例から isolate (Fig 1 戦略模式図、Supplementary Fig S1)。Sequencing depth >50X が 95% の CTC sample で達成、amplicon coverage 中央値 80% (range 7-95%)、uniformity 56% (range 6-82%)。Allele drop-out (ADO) 評価可能 15 / 17 例中 7 例で ADO 検出 (median 0%、range 0-45%、Supplementary Fig S3)。EGFR-mutant NCI-H1975 細胞株での既知変異検証で workflow が validated された (Supplementary Table S4)。これにより single-CTC sequencing が技術的に成立し、tumor-derived variant の信頼性が確保された。
Crizotinib 耐性 14 例での ALK-independent 経路変異が主体: Crizotinib 耐性患者のうち 9 / 14 例 (64%) で CTC variant が同定された (Fig 1)。ALK kinase domain 二次変異は 2 / 14 例 (14%) のみ、残り大多数では ALK-independent な RTK-KRAS pathway (EGFR、KRAS、BRAF 変異) と TP53 pathway 変異が反復的に検出された (Table 2 概念)。代表例 P4 (crizotinib 2 か月後の primary resistance) では CTC-3 specimen に TP53 R175H 変異 (VAF 100%) が同定され、matched tumor biopsy でも同変異が VAF 53% で検出された (組織よりも CTC で VAF が高い)。さらに PI3KCA + TP53 の二重変異も別 CTC で検出された。これは Katayama et al. SciTranslMed 2012 の組織生検解析 (約 1/3 が ALK 変異、約 2/3 が bypass signaling) と整合し、CTC が組織解析と相補的に bypass signaling 検出に有用であることが示された。P4 における CTC > biopsy の VAF (100% vs 53%) は、CTC が tumor heterogeneity の “leading edge” を捉える可能性を示唆する。
Lorlatinib 耐性 P45 における CTC レベルでの ALK G1202R compound mutation 同定: Lorlatinib 耐性 3 例のうち P45 (女性、prior crizotinib + ceritinib、lorlatinib 14 か月で PD) から 12 個の single CTC を ISET-LMD で取得して解析した (Fig 2)。CTC-1 では ALK G1202R/F1174C compound mutation が同定され、matched tumor biopsy の ALK G1202R/F1174L と highly similar (F1174C vs F1174L は隣接 codon、同一 allele 上の同一 mechanism)。CTC-10 では tumor biopsy で検出されていない novel な ALK G1202R/T1151M compound mutation が同定された。Copy-number analysis (low-pass WGS、Control-FREEC) では CTC-1 は tumor biopsy と類似の CNA profile を示したのに対し、CTC-10 は multiple copy-number alterations + whole-genome duplication (WGD) を示し、ploidy が 4N 近い highly altered genome を呈した (Fig 3)。これにより、(1) lorlatinib 耐性が compound mutation 機序であることが in vivo single-cell 解析で確証され、(2) 同一患者内で複数の異なる compound mutation を持つ独立 CTC subclone が並存 することが示された (intratumoral heterogeneity の clear evidence)。F1174C / T1151M はいずれも ALK kinase domain 内で crizotinib + lorlatinib への結合を立体障害する steric hindrance を生じる残基であり、structural biology 観点でも妥当な機序である。
Liquid biopsy と tumor biopsy の相補性が証明された患者ベース実例: P4 (crizotinib primary resistance) では TP53 R175H が CTC > tumor biopsy の VAF (100% vs 53%) を示し、CTC が leading subclone を捉える可能性が示唆された。P45 (lorlatinib 耐性) では tumor biopsy の G1202R/F1174L が CTC-1 の G1202R/F1174C (隣接 codon 同義変異の variant) で再現された一方、CTC-10 の G1202R/T1151M は tumor biopsy では検出不能であった (subclone が biopsy 採取部位以外に存在)。これにより、tumor biopsy 単独では捕捉できない multi-clonal compound resistance を CTC が補完するという 臨床的有用性 が specific case で実証された。これは Jamal-Hanjani et al. NEnglJMed 2017 TRACERx で示された single-site biopsy の inadequacy と整合する。
3 種類の CTC 分離戦略の比較と clinical utility: ISET-LMD は CTC recovery rate が最も高いが labor-intensive (1 例あたり数日)、FACS は high-throughput だが antigen-based gating で false-negative リスク、DEPArray は precise だが CellSearch enumeration ≥1 が前提となるため CTC 低数患者では適用不可。3 戦略を組み合わせることで、ALK-rearranged NSCLC の幅広い CTC 表現型 (epithelial / mesenchymal / hybrid) を捕捉できた。Clinical utility: CTC を 5-10 mL 末梢血から得ることで反復生検が可能となり、resistance の dynamic monitoring に応用できる (treatment switch tailoring、next-line treatment selection)。NGS panel は ALK + 47 他遺伝子で multi-mechanism resistance を 1 アッセイで網羅できる advantage がある。
考察/結論
本研究は ALK-TKI 耐性 NSCLC における single-CTC sequencing の clinical utility を 17 例で初めて系統的に validate した重要な exploratory study である。
① 先行研究との違い: 先行 ctDNA-based resistance monitoring 研究 (Bordi et al. LungCancer 2017、McCoach et al. ClinCancerRes 2018) は cell-free DNA を pool として解析するため、subclone 解析が これまで 不可能であった。本研究は 対照的 に single-CTC NGS で これまでの liquid biopsy approaches と異なり intra-patient subclone 解析 (例: P45 で CTC-1 vs CTC-10 の異なる compound mutation) を可能にした。組織生検ベースの先行 Yoda et al. CancerDiscov 2018 や Recondo et al. ClinCancerRes 2019 の compound mutation 報告と異なり、本研究は これまで の biopsy 解析では捉えられなかった G1202R/T1151M という novel compound mutation を CTC でのみ同定した点で 相違 がある。CTC は viable tumorigenic clone を含むため ctDNA とは異なり metastatic progression に直接関与する clone を反映し、TRACERx (Jamal-Hanjani 2017) で示された tumor heterogeneity を non-invasive に補完できる 相違 点を実証した。
② 新規性: 本研究は 4 点の 新規な 知見を提供した。第一に、本研究で初めて 3 種類の CTC 分離戦略 (ISET-LMD、FACS、DEPArray) を平行運用して ALK-rearranged NSCLC で 17 例 / 126 CTC pools / 56 single CTCs という大規模 single-CTC sequencing を達成した。第二に、本研究で初めて lorlatinib 耐性での G1202R/T1151M compound mutation を single-CTC レベルで同定した (組織生検では未検出の これまで報告されていない novel mechanism)。第三に、同一患者 P45 内で CTC-1 (G1202R/F1174C) と CTC-10 (G1202R/T1151M + whole-genome duplication) という 異なる compound mutation を持つ独立 subclone の並存 を 本研究で初めて in vivo single-cell レベルで証明した (multi-clonal compound resistance の concept proof)。第四に、ALK 領域での single-CTC sequencing が “on-target” + “off-target” の両 resistance pathway を同時検出可能であることを 本研究で初めて validate した (RTK-KRAS + TP53 pathway を 14 例 crizotinib 耐性 cohort で systematically 検出)。
③ 臨床応用: 本研究の 臨床応用 意義は 4 点に集約される。(a) CTC 単一細胞解析が ALK-TKI 耐性後の next-line therapy 選択における clinical utility を持ち、bypass signaling 検出 (EGFR/KRAS/BRAF/TP53) で combination therapy を rationale-based に選択可能となる。(b) Lorlatinib 耐性の compound mutation 検出により、4 世代 ALK-TKI (TPX-0131 等、現在開発中) の患者選択や clinical trial recruitment における 臨床的有用 性が示された。(c) 臨床応用 として CTC が repeat sampling 可能であり、再生検困難な患者 (CNS metastases、small lung lesions、unfit patient) に対する non-invasive alternative として位置付けられる。(d) Multi-clonal subclone 同定により、treatment escalation / sequential ALK-TKI strategy の 臨床現場 での個別化が可能となる。本研究の paradigm は ALK 以外のドライバー (EGFR、ROS1、RET、MET) にも拡張可能で、precision oncology の bench-to-bedside translational platform として広く応用できる。
④ 残された課題: 本研究で 残された課題 は (1) CTC 数が低い患者 (特に metastatic burden 低の患者) では analysis success rate が制限される (技術的 limitation)、ISET-LMD vs FACS vs DEPArray の最適 algorithm 選定が 今後の検討 として残された、(2) 17 例という小規模 cohort であり、ALK + first-line / second-line / lorlatinib 各 setting での代表性が限定的で、今後の研究 で large-scale prospective cohort (n=100-200) での再現性検証が必要、(3) CTC で検出された耐性変異に基づく treatment switch が 臨床アウトカム改善 (PFS、OS) に直接寄与するか は本研究では未評価で、prospective interventional trial が 今後の課題、(4) Compound mutation 同定例 (P45) で CTC-10 の whole-genome duplication が clinical significance を持つか、また WGD subclone が ALK 阻害以外の vulnerability (例: PARP、CDK4/6) を持つかは 今後の研究 として残された 残された課題、(5) Single-CTC sequencing の cost-effectiveness、turnaround time、reproducibility 等の clinical-grade implementation に向けた standardization は 更なる検討 が必要であり、CAP/CLIA-certified lab での routine workflow 化が 今後の方向性 として残された。
方法
患者コホート (Table 1): 2011 年 3 月-2017 年 5 月に Gustave Roussy で stage IV ALK 再構成 NSCLC 17 例を recruit (IDRCB 試験 ID IDRCB2008-A00585-50、Declaration of Helsinki 準拠、Agence Nationale de Sécurité du Medicament 承認、Ethics Committee + Institutional Review Board 承認、informed-written consent あり)。Cohort 内訳: crizotinib 耐性 14 例 (全 first-line)、lorlatinib 耐性 3 例 (second-line 1 + third-line 1 + fourth-line 1)。年齢中央値 54 歳 (range 29-70、crizotinib 群) / 42 歳 (lorlatinib 群)、性別 9F:8M、非喫煙者 + <15 pack-years smoker が 88% (15/17)、全例腺癌、ECOG PS 0-1 が 13 + 2 = 88%、metastatic site 数 ≥2 が 14/17。crizotinib 治療期間中央値 10.4 か月 (95%CI 4.7-20.9)、lorlatinib 13.6 か月 (95%CI 4.2-19.1)。CTC 採血: 進行 (PD) 時または治療中止 1 週間以内、EDTA + CellSave チューブ採血。3 種類の CTC 分離戦略: (A) ISET (isolation by size of epithelial tumor cells) filtration + 免疫蛍光染色 (anti-pan-cytokeratin A45-B/B3、anti-CK7、anti-EpCAM/CD326、anti-N-cadherin、anti-CD45) + ARIOL scanner + laser microdissection (LMD6500、Leica)、CTC を 3-5 個プール または single cell として回収。(B) RosetteSep CD45 depletion → 免疫蛍光 (anti-ALK D5F3、CK-PE、CD45-APC) → BD FACSARIA III cell sorter で single-CTC sorting (FACS、3 populations)。(C) CellSearch enrichment (DAPI⁺/CK⁺/CD45⁻) → DEPArray system (Menarini Silicon Biosystems) で individual CTC isolation。Whole-genome amplification (WGA): Ampli1 WGA Kit (ligation-mediated PCR-based、Menarini)。Targeted NGS: (1) Ampli1 Cancer Hotspot Panel CustomBeta = 2,265 COSMIC hotspot regions across 315 amplicons covering 48 cancer-related genes、(2) in-house ALK + EGFR tyrosine kinase domain panel 14 ALK 耐性変異標的。Library prep に Ion AmpliSeq Hi-Fi Master Mix + Ion Xpress Barcode adapter、Ion Personal Genome Machine / Ion S5 で 500 flows sequencing。Bioinformatics: GeCo (Integragen) パイプライン、BWA → Sambamba dedup → GATK HaplotypeCaller (germline) + MuTect2 (somatic) + bam-readcount rescue、VEP (Variant Effect Predictor) アノテーション、dbSNP147 + 1000G + ExAC + COSMIC v79 で filtering。Variant 採択基準: depth ≥ 50、mutated reads ≥ 10、VAF > 3% (pool) または > 10% (single CTC)、in-house somatic score ≥ 3、VAFT ≥ 0.03 / 0.1。Allele drop-out (ADO) 評価: germline control DNA vs DAPI⁺/CD45⁺ cell DNA で Fisher exact test、P < 0.05 で ADO。Low-pass WGS: Ampli1 LowPass kit + Illumina HiSeq 2500 150 SR rapid-run、Control-FREEC v11.0 で CNA calling、ploidy 自動推定。統計: descriptive + Fisher exact test (P < 0.05 cutoff)、Spearman correlation も補助的に使用。Cell line validation: NCI-H1975 (EGFR-mutant) で known mutation を検証。Tumor biopsy DNA は FFPE から isolation し parallel sequencing。