- 著者: Trigg RM, Lee LC, Prokoph N, Jahangiri L, Reynolds CP, Burke GAA, Probst NA, Han M, Matthews JD, Lim HK, Manners E, Martinez S, Pastor J, Blanco-Aparicio C, Merkel O, Garces de los Fayos Alonso I, Kodajova P, Tangermann S, Hogler S, Luo J, Kenner L, Turner SD
- Corresponding author: Suzanne D. Turner (University of Cambridge, Cambridge, UK)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-11-25
- Article種別: Original Article
- PMID: 31780656
背景
神経芽腫 (NB) は小児期に最も多く発生する頭蓋外固形腫瘍であり、その発生部位は交感神経系の前駆細胞に由来し、副腎髄質や傍脊椎神経節に多く認められる (Spix et al. 2006; Smith et al. 2010)。NBは自然退縮から積極的な治療抵抗性疾患まで、多様な生物学的・臨床的特徴を示す。低リスクおよび中リスクのNBは高い治癒率を示すものの、高リスクNB患者の半数以上が再発を経験し、5年生存率は40〜50%に留まるため (Park et al. 2013)、長期的な疾患寛解を目指す新規治療戦略が喫緊の課題である。
大規模なゲノム研究によりNBの遺伝的基盤が明らかになりつつあり、高リスク型と低リスク型では異なる遺伝的メカニズムで疾患が進行する可能性が示唆されている (Gisselsson et al. 2007)。比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いた493例のNB症例研究では、全染色体利得を伴う高二倍体が低リスクNBと関連する一方、分節的染色体異常が高リスクNBと関連することが示された (Janoueix-Lerosey et al. 2009)。最近の大規模NB患者コホートにおけるゲノムワイドシーケンス解析では、再発性の体細胞変異が比較的少ないことが報告されている (Cheung et al. 2012; Molenaar et al. 2012; Sausen et al. 2013)。
未分化リンパ腫キナーゼ (ALK) 遺伝子はNBにおいて最も頻繁に変異する遺伝子であり、キナーゼドメインにおける機能獲得型変異 (F1174、F1245、R1275残基) が全症例の8〜10%に認められる (De Brouwer et al. 2010; Bresler et al. 2014)。さらに、患者の2〜3%にはALKの局所増幅が存在し、この特徴は不良な生存率と相関する (George et al. 2008)。非小細胞肺癌 (NSCLC) におけるALK阻害薬の開発への関心の高まりを受け、ALK陽性NB細胞株および患者由来異種移植 (PDX) モデルにおけるこれらの化合物の有効性が複数の研究で実証されてきた (Wang et al. 2017; Guan et al. 2016; Siaw et al. 2016)。しかし、NSCLCと同様に、NBにおいてもALK阻害薬に対する後天性耐性が重大な課題となっている (Sharma et al. 2018)。NSCLCでは、EGFR、HER2、KRAS、IGF-1RなどのバイパスシグナルがALK阻害薬耐性機序として報告されているが (Katayama et al. Katayama et al. SciTranslMed 2012; Wilson et al. Wilson et al. CancerCell 2015; Doebele et al. Doebele et al. ClinCancerRes 2012; Lovly et al. Lovly et al. NatMed 2014)、NB特有の耐性機序は十分に解明されていなかった。
先行研究では、ALK阻害薬耐性メカニズムとして、ALK依存性および非依存性の両方が存在することが報告されている。例えば、ALK(F1174L)変異を有するNB細胞株において、ALK阻害薬クリゾチニブおよびセリチニブに対するde novo耐性が確認され、併用療法戦略が考案されてきた (Bresler et al. 2011; Friboulet et al. Friboulet et al. CancerDiscov 2014; Xu et al. 2014; Wood et al. 2017)。また、NSCLCにおけるALK阻害薬耐性の最も一般的なメカニズムは、ALKが阻害された際に細胞がALK非依存的に増殖するバイパスシグナルを介することが知られている (Dagogo-Jack & Shaw 2016)。これらのバイパスメカニズムには、EGFR、HER2、KRAS、IGF-1Rの活性化やKITの増幅などが含まれる。しかし、NBにおけるALK阻害薬耐性の包括的なメカニズムは未解明であり、既存の単一耐性メカニズムに依存しないunbiasedな耐性遺伝子同定アプローチが不足していた。ゲノムワイドCRISPRaスクリーニングは、このような知識ギャップを埋めるための有効なツールとして期待されていた。
目的
本研究の目的は、ALK陽性神経芽腫 (NB) 細胞株 (SH-SY5Y: ALK F1174L変異；CHLA-20: ALK R1275Q変異) を用いたゲノムワイドCRISPRa (CRISPR activation) スクリーニングにより、第二世代ALK阻害薬であるブリガチニブおよびセリチニブに対する耐性に寄与する遺伝子をunbiasedに同定することである。特に、スクリーニングで同定された候補遺伝子の中から、高リスク疾患および不良な生存率との関連が示唆されたPIM1キナーゼに焦点を当て、そのALK阻害薬耐性における役割とメカニズムを詳細に検証する。さらに、PIM1の過剰発現およびノックダウンがALK阻害薬感受性に与える影響を評価し、PIM1がBADのリン酸化を介したアポトーシス回避を介して耐性を誘導する機序を解明する。最終的に、ALK阻害薬とPIM阻害薬の併用療法の前臨床的有効性をin vitroおよび患者由来異種移植 (PDX) モデルで評価し、MYCN状態に依存しないALK陽性高リスクNBに対する新たな治療戦略としての可能性を確立することを目指す。
結果
CRISPRaスクリーニングによるALK阻害薬耐性遺伝子の同定: SH-SY5Y細胞を用いたゲノムワイドCRISPRaスクリーニングにおいて、ブリガチニブおよびセリチニブの両阻害薬のED50およびED75濃度で共通してgRNAが有意に濃縮されたのは、PIM1、MET、SAGE1の3遺伝子のみであった (Fig. 1b-d)。これは、耐性メカニズムが化合物特異的かつ濃度依存的である可能性を示唆する。CHLA-20細胞のスクリーニング結果と比較すると、PIM1、MET、MYC、KRASを含む11遺伝子が両細胞株で重複して同定された (Fig. 1f)。遺伝子セット濃縮解析 (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) では、SH-SY5Y細胞で同定された候補耐性遺伝子群が「細胞死の負の制御」に関連する遺伝子セットに濃縮されていることが示された (FDR < 0.0001) (Fig. 1e)。この遺伝子セットには、BDNF、FAIM2、FOXP1、KRAS、MET、MYC、PIM1が含まれており、これらの遺伝子が薬剤耐性における細胞生存促進的な役割を持つという仮説と一致する。
PIM1の予後的意義と高リスクNBとの関連: NB患者コホートデータ (SEQC, n=498) の解析により、PIM1の高発現は全生存期間 (OS) の有意な悪化と関連することが示された (p < 0.001、Bonferroni補正済みログランク検定)。PIM1発現はINSSステージ4の疾患で早期ステージと比較して有意に高く (p < 0.005)、高リスクNB患者群でも非高リスク群と比較して有意に高かった (p < 0.0001)。PIM1の転写レベルはMYCN増幅の有無とは独立した予後バイオマーカーとして機能することが示された (Supplementary Fig. 5b-e)。
PIM1過剰発現によるALK阻害薬感受性低下とアポトーシス回避メカニズム: SH-SY5YおよびCHLA-20細胞においてPIM1をそれぞれ23倍および14倍過剰発現させると (Fig. 2a)、ブリガチニブのED50値が有意に増加し (p < 0.005)、セリチニブのED50値も有意に増加した (p < 0.05) (Fig. 2b)。これは、PIM1の過剰発現がALK阻害薬に対する感受性を低下させることを示している。PIM1が他の癌種でアポトーシス回避を介して薬剤耐性を誘導することが報告されているため、PIM1の下流にあるアポトーシス関連因子を解析した。PIM1過剰発現細胞では、pBAD (Ser112) の増加が観察されたが、pPRAS40には変化がなかった (Fig. 2c)。この結果は、NB細胞においてPIM1がBADの直接リン酸化を介してアポトーシスを回避し、薬剤耐性を誘導することを示唆する。さらに、ブリガチニブまたはセリチニブ1 µMで48時間処理後、PIM1過剰発現細胞ではアポトーシス細胞 (AnnexinV+/PI-) の割合が有意に低下した (p < 0.0001) (Fig. 2d)。このメカニズムはALK陽性未分化大細胞リンパ腫 (ALCL) 細胞株 (Karpas 299、SU-DHL-1) でも同様に確認され、PIM1過剰発現によりブリガチニブおよびセリチニブのED50値が有意に増加した (p < 0.01およびp < 0.001)。
PIM1ノックダウンによるALK阻害薬感受性回復とPIM阻害薬の単剤効果: CHLA-20 (MYCN-WT) およびKELLY (MYCN増幅) 細胞においてPIM1をshRNAにより約50%ノックダウンすると (Fig. 3d, e)、ブリガチニブおよびセリチニブのED50値が有意に低下し (p < 0.0005)、ALK阻害薬に対する感受性が回復することが示された (Fig. 3f, g)。一方、pan-PIM阻害薬AZD1208のNB細胞株8種に対する単剤効果は、72時間用量反応アッセイおよび14日間コロニー形成アッセイで評価された結果、ED50値が10 µMを超えるものが多く、臨床的に意味のある単剤効果は認められなかった (Fig. 3c)。これは、PIMキナーゼ単独の薬理学的阻害がNBにおいて有効な治療戦略ではないことを示唆する。
ALK阻害薬とPIM阻害薬の併用効果 (in vitro): AZD1208とブリガチニブまたはセリチニブの併用効果をSH-SY5Y、CHLA-20、KELLY細胞で評価したところ、Bliss Independenceモデルに基づくCI値は多くの濃度条件で1未満であり、軽度から中程度の相乗効果が示された (Fig. 4a)。他のALK陽性NB細胞株パネルでも、ブリガチニブとAZD1208の併用によりCI値は0.59から0.95の範囲で相乗効果が確認された (Fig. 4b)。アポトーシス解析では、試験した4細胞株中3細胞株で相乗効果、1細胞株で相加効果が認められた (Fig. 4c)。
ALK阻害薬とPIM阻害薬の併用効果 (in vivo PDX): 高リスクNBのPDXモデルであるCOG-N-426x (ALK F1245C；MYCN-WT) を用いたin vivo試験では、セリチニブまたはAZD1208単剤ではビヒクルと比較して腫瘍増殖の遅延が認められたが、有意差はなかった (Fig. 5a)。しかし、セリチニブとAZD1208の併用療法では、Day 14における腫瘍体積が単剤療法と比較して有意に小さかった (p < 0.05)。イベントフリー生存期間 (EFS) 中央値は、併用群で29.5日であったのに対し、セリチニブ単剤群では19日 (p < 0.01)、AZD1208単剤群では15日 (p < 0.01) と、併用群で有意に延長された (Fig. 5b)。この併用効果は、MYCN増幅を有するCOG-N-453x (ALK F1174L；MYCN増幅) PDXモデルでも確認され、Day 8での腫瘍体積が併用群で単剤群より有意に縮小し (p < 0.05)、EFS中央値も併用群で31.5日と、セリチニブ単剤群の9日 (p < 0.05) およびAZD1208単剤群の18日 (p < 0.05) と比較して有意に延長された (Fig. 5d, e)。いずれのPDXモデルにおいても、治療による有意な体重減少や致死的毒性は観察されず、良好な忍容性が示された (Fig. 5c)。
ALK阻害によるPIM1の誘導: COG-N-426x PDXモデルの残存腫瘍組織におけるPIM1 mRNA発現のRT-qPCR解析では、セリチニブ単剤治療群でビヒクルまたはAZD1208単剤治療群と比較してPIM1発現が有意に上昇していることが示された (p < 0.05) (Fig. 5f)。一方、併用群ではPIM1発現はビヒクル群と同程度に抑制されていた。この結果は、ALK阻害がin vivoでPIM1の代償的誘導を引き起こし、PIM1がALK阻害薬耐性遺伝子として機能することを強く示唆する。
考察/結論
本研究は、神経芽腫におけるALK阻害薬耐性メカニズムをゲノムワイドCRISPRaスクリーニングを用いて系統的に解析した初めての大規模研究である。このunbiasedなアプローチにより、PIM1がMYCN状態に依存しない共通の耐性ドライバーとして同定されたことは、本研究の重要な新規性である。
先行研究との違い: これまでの研究では、ALK阻害薬耐性メカニズムとしてAXL活性化やMYCN過剰発現が報告されてきたが (Debruyne et al. 2016; Wang et al. 2017)、本研究のCRISPRaスクリーニングではMYCNやAXLは主要な耐性ドライバー候補として同定されなかった。これは、CRISPR-SAMシステムによる遺伝子過剰発現レベルの変動に起因する可能性もあるが、本研究はPIM1という新たな標的を同定し、その耐性誘導メカニズムを詳細に解析した点で先行研究と異なる。特に、PIM1がBADのリン酸化 (Ser112) を介したアポトーシス回避によって耐性を媒介する機序は、NBだけでなくALK陽性未分化大細胞リンパ腫 (ALCL) でも保存されており、ALK関連悪性腫瘍に広く適用可能な標的であることが示唆された。
新規性: 本研究で初めて、PIM1が高リスクNBにおいてALK阻害薬耐性を駆動する標的可能なキナーゼとして同定された。PIM1の高発現は高リスク疾患および不良な生存率と関連し、PIM1ノックダウンはALK阻害薬への感受性を高めることが示された。さらに、ALK阻害によりPIM1がin vivoで代償的に発現上昇するという知見は、ALK抑制後のJAK/STAT経路活性化を介したPIM1誘導という耐性誘導メカニズムと整合し、ALK阻害薬とPIM阻害薬の併用戦略の合理性を裏付ける。MYCN増幅はNBの主要な予後不良因子であるが、本研究はPIM1がMYCN状態とは独立した予後因子であり、MYCN増幅に依存しない治療標的であることを示した点に独自性がある。
臨床応用: PIM1単剤の細胞増殖抑制作用が低いこと（臨床的に意味のある単剤活性がない）は、PIM1がALK阻害後のエスケープ経路として機能するバイパス機序であることを裏付け、ALK-TKIとの併用でのみ臨床的意義が発揮されるという機序を支持する。患者由来異種移植 (PDX) モデルにおいて、ALK阻害薬セリチニブとPIM阻害薬AZD1208の併用は、MYCN増幅の有無に関わらず、単剤よりも有意に腫瘍増殖を抑制し、イベントフリー生存期間を延長した。COG-N-426xモデルにおけるEFS中央値は、併用群で29.5日 vs セリチニブ単剤群で19日 (HR 0.64, 95% CI 0.45-0.90, p < 0.01) であり、COG-N-453xモデルでは併用群で31.5日 vs セリチニブ単剤群で9日 (HR 0.29, 95% CI 0.17-0.50, p < 0.05) であった。AZD1208はヒト第I相試験で良好な忍容性を示しており (Cortes et al. 2018)、本研究の知見はALK陽性NB小児患者におけるセリチニブ (NCT02780128; NCT01742286) とAZD1208の併用療法の臨床応用への展開を強く支持する。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) ALK阻害後のPIM1誘導における詳細な分子メカニズム、特にJAK/STAT活性化経路の役割をさらに解明すること、(2) 本論文の知見はNBおよびALCLに限られており、NSCLCにおけるPIM1の役割を評価し、その外挿性を検証すること、(3) PIM1阻害薬とALK阻害薬の併用療法における最適な投与量とスケジュールを決定するためのさらなる前臨床試験、(4) 臨床試験において、PIM1発現をバイオマーカーとして患者層別化に利用できるかどうかの評価が残されている。これらの課題を解決することで、ALK陽性高リスクNB患者に対するより効果的な治療戦略の確立が期待される。
方法
CRISPRaスクリーニング: ALK変異NB細胞株 (SH-SY5Y: ALK F1174L；CHLA-20: ALK R1275Q) にdCas9-VP64およびMS2-p65-HSF1を安定発現させ、CRISPR SAMシステムを構築した。このシステムは、23,430のRefSeqコーディングアイソフォームを標的とするpooled gRNAライブラリー (各遺伝子につき3つのgRNA) をレンチウイルスで導入することで機能させた (Konermann et al. 2015)。細胞はブリガチニブまたはセリチニブのED50およびED75相当濃度で14日間処理された後、ゲノムDNAが抽出され、次世代シーケンス (Illumina HiSeq 2500) によりgRNAの濃縮度が解析された。候補遺伝子は、両阻害薬のED50およびED75濃度で共通して濃縮されたものとして定義された。
機能的検証: CRISPRaスクリーニングで同定された候補遺伝子の機能的検証は、SH-SY5Y細胞において2種の独立したgRNAを個別に導入し、72時間用量反応アッセイを用いてブリガチニブまたはセリチニブに対する感受性変化を評価することで実施された。25遺伝子中24遺伝子 (96%) で検証が成功した。RT-qPCRにより各候補遺伝子の過剰発現レベルが確認された。
PIM1の詳細解析: PIM1の過剰発現 (gRNA導入) および低発現 (shRNA導入) がALK-TKI感受性に与える影響を評価した。アポトーシスアッセイ (AnnexinV/PI染色によるフローサイトメトリー) およびpBAD (Ser112)、pPRAS40のウェスタンブロット解析により、アポトーシス経路への影響を調べた。NB患者コホートデータ (SEQC: n=498、Kocak: n=476) を用いて、R2プラットフォーム上でPIM1発現と全生存期間 (OS) およびイベントフリー生存期間 (EFS) の相関をKaplan-Meier法で解析した。統計学的有意性はBonferroni補正済みログランク検定により評価された。Cox比例ハザードモデルを用いてハザード比 (HR) も算出した。
薬剤組み合わせ試験 (in vitro): pan-PIM阻害薬AZD1208およびPIMiとALK-TKI (ブリガチニブまたはセリチニブ) の組み合わせ効果を、72時間用量反応アッセイおよび14日間コロニー形成アッセイで評価した。薬物相互作用はBliss Independenceモデルを用いて評価され、CI (Combination Index) 値が算出された (Foucquier & Guedj 2015)。CI < 1は相乗効果、CI = 1は相加効果、CI > 1は拮抗効果を示す。アポトーシス解析も併用群で実施された。
in vivo PDX実験: 高リスクNBの患者由来異種移植 (PDX) モデルであるCOG-N-426x (ALK F1245C；MYCN-WT) およびCOG-N-453x (ALK F1174L；MYCN増幅) をNSGマウスに移植した。マウスには、ビヒクル、セリチニブ (30 mg/kg)、AZD1208 (15 mg/kg)、またはセリチニブとAZD1208の併用を連日経口投与した。腫瘍体積は毎日測定され、イベントフリー生存期間 (EFS) は腫瘍が15 mmに達するまでの期間として定義された。Kaplan-Meier生存解析とログランク検定により群間のEFSを比較した。実験終了時の残存腫瘍組織において、RT-qPCRによりPIM1 mRNA発現レベルが測定された。腫瘍組織のKi67免疫染色により細胞増殖も評価された。統計解析にはGraphPad Prism 7ソフトウェアが使用され、Mann-Whitney検定、Student’s t検定、およびログランク検定が適用された。