- 著者: Takashi Nakaoku, Takashi Kohno, Mitsugu Araki, Seiji Niho, Rakhee Chauhan, Phillip P. Knowles, Katsuya Tsuchihara, Shingo Matsumoto, Yoko Shimada, Sachiyo Mimaki, Genichiro Ishii, Hitoshi Ichikawa, Satoru Nagatoishi, Kouhei Tsumoto, Yasushi Okuno, Kiyotaka Yoh, Neil Q. McDonald, Koichi Goto
- Corresponding author: Takashi Kohno (Division of Genome Biology, National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan; tkkohno@ncc.go.jp)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-02-02
- Article種別: Original Article (Translational research / case-based mechanistic study)
- PMID: 29434222
背景
RET (rearranged during transfection) は receptor tyrosine kinase であり、肺腺癌 (lung adenocarcinoma, LADC) の 1-2% で oncogenic fusion (KIF5B-RET、CCDC6-RET 等) が報告され、臨床的に targetable な driver として認識されている (Kohno et al. NatMed 2012)。Type I tyrosine kinase inhibitor (TKI) である vandetanib (RET / VEGFR2 / EGFR を阻害する multi-kinase TKI) と cabozantinib (RET / MET / VEGFR2) は RET fusion-positive NSCLC で臨床活性を示し、LURET trial (Yoh et al. LancetRespirMed 2017) では vandetanib が 19 例の RET fusion-positive 患者で response rate 53%、disease control rate 90%、median progression-free survival (PFS) 4.7 ヶ月という有望な activity を示していた。
他の oncogenic fusion、特に ALK や ROS1 の type I TKI 治療においては、必ず獲得耐性が発生し、kinase domain (KD) gatekeeper 変異 (ALK-L1196M、ROS1-G2032R 等) や solvent-front 変異 (ALK-G1202R 等) が主要原因として同定されている (Choi et al. NEnglJMed 2010、Shaw et al. NatRevCancer 2013、Camidge et al. NatRevClinOncol 2014)。とりわけ、EGFR-T790M gatekeeper 変異が ATP 親和性の増大を介して type I TKI 耐性を生むという機構は、type I inhibitor vs ATP competitive antagonism の枠組みとして広く受け入れられている (Yun et al. PNAS 2008)。
しかしながら、RET TKI 治療における acquired resistance の分子機構は本論文発表時点で完全に手薄 であり、どの kinase domain 変異が、どのような mechanism で RET-TKI 耐性を生むかの empirical evidence は存在しなかった。この knowledge gap は新世代 RET-TKI の rational design と precision medicine 戦略の構築を妨げており、臨床的に問題となっていた。本研究は LURET trial に登録され、vandetanib に一次効果を示した後に獲得耐性を発症した患者の生検検体を deep sequencing・生化学・結晶構造の 3 階層で解析することで、RET-TKI 耐性の初の molecular mechanism を解明した。
目的
LURET 臨床試験 (UMIN000010095) に登録された CCDC6-RET 融合陽性 NSCLC 患者で、vandetanib に一次効果を示しながら 38 週で disease progression を発症した症例の獲得耐性 biopsy 検体を解析し、(1) 耐性原因となる二次変異を deep sequencing で同定、(2) 同定変異の vandetanib resistance phenotype を複数の細胞・生化学アッセイ系で validate、(3) ATP 親和性・自動リン酸化・vandetanib 結合に与える影響を kinetic 解析と thermal shift assay で定量化、(4) X-ray crystallography による S904F mutant の構造解明、(5) molecular dynamics (MD) simulation で allosteric drug resistance 機構を atomistic レベルで解明すること。
結果
臨床経過と二次変異の同定 (Fig 1): 57 歳女性の CCDC6-RET 融合陽性 LADC 患者が LURET trial に登録後、vandetanib 投与で 12 週時に target lesion size が 20 mm から 7 mm に縮小し奏効 (LURET 試験全体で CCDC6-RET 陽性例は 5/6 = 83% response rate)。38 週で disease progression を来たし、右頸部リンパ節 biopsy (Biopsy #2) では pre-treatment 検体と同一の histological features および CCDC6-RET breakpoint identity (C1;R12) を確認し、resistant tumor が original tumor 由来であることが breakpoint junction の genomic DNA Sanger sequencing で検証された (Fig 1b-c、Suppl Fig 2)。Targeted deep sequencing で resistant tumor の RET allele に c.2902C>T mutation を検出、これは codon 904 において serine から phenylalanine への置換 (S904F) を引き起こす non-synonymous mutation である。Baseline tumor では同変異は検出されず、RT-PCR Sanger sequencing で fusion transcript 上での発現を確認 (Fig 1d)。WES では resistant tumor 特異的な 4 つの mutation を同定したが、RET-S904F のみが既知 oncogenic variant (familial thyroid cancer の germline mutation) であり、他 3 遺伝子の変異は drug resistance との連関なし (Suppl Fig 3)。S904 残基は RET activation loop (AL) 内、autophosphorylation tyrosines Y900 と Y905 の間に位置し、kinase superfamily 間では保存されていない (Suppl Fig 4)。
細胞レベルでの vandetanib 耐性 (Fig 2a-b): H1299 cells (内在 RET 発現なし) に WT vs S904F mutant CCDC6-RET cDNA を transient transfection し、vandetanib 6 時間処理後の Tyr905 リン酸化を Western blot で定量。WT CCDC6-RET IC50 = 0.57 μM に対し S904F IC50 = 2.6 μM (4.6 倍上昇)、n=3 独立実験で t-test による p<0.05 を確認 (Fig 2a)。Ba/F3 cells で CCDC6-RET stable expression による IL3-independent 増殖 rescue 系では、WT GI50 = 278.2 nM vs S904F GI50 = 1,070 nM (3.8 倍上昇) を認め (Fig 2b)、cellular drug response レベルで S904F の vandetanib resistance を二系統で検証した。GraphPad Prism v6.0 で concentration-response curve を算出、quadruplicate × 3 反復で再現性を確認。
In vitro kinase 解析と酵素動力学 (Fig 2c、Fig 3a-c): Sf9/baculovirus 由来 recombinant RET-KD の in vitro kinase assay で WT IC50 = 67.82 nM に対し S904F IC50 = 908.5 nM (13.4 倍)、inhibitory constant (Ki) は WT 11.57 ± 3.08 nM vs S904F 43.09 ± 11.7 nM (3.7 倍) に上昇した (Fig 2c、Fig 3a)。Michaelis-Menten kinetics では Km[ATP] が WT 46.25 ± 3.82 μM から S904F 30.49 ± 2.94 μM に低下 (S904F がより低 ATP 濃度で飽和 = 高 ATP 親和性)、Vmax は WT 535.6 ± 13.9 から S904F 746.5 ± 20.5 pmol PL⁻¹s⁻¹ に増大、catalytic efficiency (kcat/Km[ATP]) は** WT 5.15×10⁻⁴ vs S904F 11.03×10⁻⁴ μM⁻¹*s⁻¹ (2.1 倍) **と算出された (Fig 3a-b)。また、recombinant RET-KD (2.5 μM) + ATP 5 mM + MgCl2 10 mM での autophosphorylation time course (0-80 min) では、S904F が WT より accelerated かつ enhanced autophosphorylation kinetics を示し、Tyr1062 と Tyr905 で顕著な差を認めた (Fig 3c)。これらの結果は S904F が RET kinase を activating し、ATP-competitive type I inhibitor である vandetanib に対して relative competition 上の不利を生むことを示す。
Thermal shift assay と drug binding 親和性 (Fig 4a): Phosphorylated RET-KD への vandetanib (1 μM) 添加は WT KD で ΔTm = 6.11 ± 0.19 °C の上昇を引き起こしたのに対し、S904F KD では ΔTm = 3.76 ± 0.17 °C のみ に止まった (差 2.35 °C = 38% の thermal stabilization 低下)。Unphosphorylated 形態では両 KD とも ΔTm 増加は小さく差を認めなかった (Suppl Table 2)。このことは S904F mutation が drug-induced thermal stabilization を減弱すること、即ち vandetanib binding 親和性が S904F mutant で直接低下 していることを示す biophysical evidence である。S904 位は drug-binding site から空間的に離れており、直接的な立体障害ではなく allosteric 機構が関与することが示唆された。
結晶構造と MD simulation による allosteric 機構の解明 (Fig 3d、Fig 4b): S904F mutant RET-KD の crystal structure を 2.3 Å resolution、R-work 19.8% (R-free 23.7%)、PDB 6FEK で決定 (Fig 3d、Suppl Table 1)。WT (PDB 2IVT) との比較では、F904 side chain が V906、I927、E902 の aliphatic portion と Van der Waals contact を形成し、WT に存在しない small hydrophobic core を構築することを見出した。この hydrophobic core が activation loop を両形態 (non-phospho / phospho) で tether し、basal kinase activity を増強する分子基盤を提供する。MD simulation (GROMACS 4 + Amber ff99SB-ILDN、RET-vandetanib 系は 50 ns × 15 trajectories + 延長 950 ns、RET-ATP 系は 1 μs × 3) では、glycine-rich loop (GRL、F735 を含む) と activation loop の dynamic coupling pattern が WT と S904F で異なり、E734 (GRL) / D771 (αC helix) / R912 (AL) からなる triad の geometrical change により、S904F mutant では de novo intermediate conformer (higher energy state = vandetanib 低親和性) が出現する (Fig 4b、Suppl Fig 7)。Intermediate conformer では F735 (GRL) side chain が drug-binding site に protrusion し、vandetanib binding を steric に妨害する構造変化が atomistic 解像度で示された。
考察/結論
本研究は LURET 臨床試験 (UMIN000010095) に登録された CCDC6-RET 融合陽性 NSCLC 患者で初めて、vandetanib 獲得耐性の分子機構を clinical sample から structure まで一貫して解明した translational study である。Deep sequencing による RET S904F 二次変異の同定、細胞・生化学的アッセイでの resistance 検証 (IC50 4.6-13.4 倍上昇)、thermal shift assay での drug binding 親和性低下 (ΔTm 6.11→3.76 °C)、X-ray crystallography (PDB 6FEK、2.3 Å) での F904 周囲 hydrophobic core 形成 の構造解明、MD simulation での allosteric drug resistance mechanism の atomistic explanation までを統合的に提示した点で、field における paradigm-setting な研究である。
① 先行研究との違い: 既存の oncogenic TKI 耐性研究は主に gatekeeper 変異 (EGFR-T790M、ALK-L1196M) または solvent-front 変異 (ALK-G1202R) に焦点を当ててきた (Choi et al. NEnglJMed 2010) のと対照的に、本研究は activation loop 内変異 (S904F) が drug resistance を生むという、これまでに drug resistance との連関が報告されていなかった location の variant を初めて同定した。EGFR-T790M の「ATP 親和性増大による type I TKI 耐性」mechanism (Yun et al. PNAS 2008) と本研究の RET-S904F mechanism は ATP 競合上の不利という共通点を持つが、変異 location (gatekeeper vs activation loop) と effect path (direct vs allosteric) の相違が重要であり、既報とは異なる新規の耐性 paradigm を提示している。
② 新規性: (a) RET TKI 治療後の獲得耐性の分子機構を本研究で初めて報告した点、(b) activation loop 内変異が type I TKI 耐性を生む新規な耐性 paradigm の提示、(c) S904F mutant の crystal structure (PDB 6FEK、2.3 Å) という最初の構造データの提供、(d) MD simulation による allosteric coupling mechanism の atomistic explanation、(e) S904F が familial thyroid cancer の germline oncogenic mutation (Cosci 2011) でもあるという「oncogenic gain-of-function + acquired drug resistance dual phenotype」というこれまで報告されていない概念の提示。これらが本研究の 5 つの novel contribution である。
③ 臨床応用: 本研究の臨床的意義として、(a) RET 融合陽性 NSCLC で vandetanib 耐性発症時には liquid biopsy または tissue rebiopsy で activation loop variant (S904F を含む) をルーチンに sequencing すべきという臨床現場での rebiopsy strategy への示唆、(b) S904F mutant は ATP-competitive type I TKI に primarily resistant のため、次世代の selective RET TKI (selpercatinib/LOXO-292、pralsetinib/BLU-667) または type II RET TKI (kinase inactive conformation を標的) が next-line treatment として有望な臨床応用方向、(c) S904F が germline familial thyroid cancer の oncogenic mutation でもあり、cancer susceptibility screening との横断的考慮が必要となる bench-to-bedside 的な含意、(d) 本症例の breakpoint identity が resistant clone selection を dominant mechanism として確認し、precision oncology における post-progression rebiopsy の重要性を支持する臨床的証拠。
④ 残された課題: 主な limitation として、(i) single case の解析 であり、cohort 規模での S904F 発現頻度や他の activation loop variant の検出は今後の検討課題 (LURET trial 19 例の post-progression biopsy の体系的 sequencing が次ステップ)、(ii) S904F に対する次世代 RET TKI (selpercatinib、pralsetinib) の in vitro 効果 は本研究では未評価 (Plenker et al. SciTranslMed 2017 が type II TKI の RET-rearranged tumor への activity を示しているが S904F での検証は future research として残存)、(iii) cabozantinib などの他 RET-TKI に対する S904F の cross-resistance profile の検証、(iv) MD simulation で予測された intermediate conformer の cryo-EM / NMR による直接実験的検証、(v) S904F のような activation loop variant が druggable allosteric target になりうるかという新規 TKI design への翻訳、(vi) clinical liquid biopsy (ctDNA) での S904F 検出 sensitivity の最適化、が更なる検討を要する課題として残る。
総括として、本研究は single-case の獲得耐性検体から RET-S904F secondary mutation を同定し、その分子・構造・動態機構を多角的に解明することで、RET-TKI 耐性研究 field に最初の paradigm と structural scaffold を提供した。次世代 RET TKI 開発と precision oncology における rebiopsy strategy の双方に対して重要な基盤を確立した研究である。
方法
Study oversight と臨床試験: National Cancer Center Institutional Review Board 承認、患者の written informed consent 取得済み。LURET (Lung Cancer with RET Rearrangement Study) trial、Identifier UMIN000010095。LC-SCRUM-Japan (Lung Cancer Genomic Screening Project for Individualized Medicine in Japan) で 2,000+ NSCLC 患者を国内 190 施設以上でスクリーニング、RT-PCR + break-apart FISH (fluorescence in situ hybridization) double positivity で RET fusion positivity を判定、34 例の RET fusion-positive を同定後 19 例を LURET trial に enroll。対象患者は 57 歳日本人女性、CCDC6-RET fusion 陽性 LADC、6 lines 化学療法 (cisplatin/vinorelbine concurrent chemoradiotherapy、gefitinib、pemetrexed、docetaxel、gemcitabine、S-1) 後に登録。Vandetanib 投与で 12 週に target lesion 20→7 mm を確認、38 週に disease progression を来たした時点で右頸部リンパ節を Biopsy #2 として採取。RNA は TRIzol (Invitrogen)、DNA は QIAamp DNA mini kit (Qiagen) で抽出。
シークエンシング戦略: Targeted deep sequencing は NCC Oncopanel (Agilent SureSelect, Catalog 931196)、whole-exome sequencing (WES) は Human All Exon V5、Illumina HiSeq 1500 100 bp paired-end、UCSC hg19 reference、BWA + Picard + Firehose + MuTect (Bayesian classifier) で somatic SNV 同定、GATK Somatic IndelDetector で indel 検出。追加 validation は Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 + Ion Proton。Sanger sequencing (ABI 3130xl + BigDye Terminator) で genomic DNA および RT-PCR 産物を直接確認、CCDC6-RET breakpoint と RET S904F の検証に使用。
細胞アッセイ: (1) NCI-H1299 cells (内在 RET 発現なし) に CCDC6-RET cDNA (wild type / S904F mutant) を pLenti6/V5-DEST vector で transient transfection (Lipofectamine 3000)、vandetanib 0-1 μM 6 時間処理、Tyr905 / Tyr1015 リン酸化を Western blot で定量 (n=3 independent experiments、t-test)。(2) Ba/F3 cells (Dr. H Mano, University of Tokyo 提供) に lentivirus で CCDC6-RET cDNA を stable transduction し IL3-independent 増殖を rescue、2,000 cells/well in quadruplicate、72 時間後に CellTiter-Glo (Promega) + EnVision (PerkinElmer) で生存率計測 (n=3 反復)。GraphPad Prism v6.0 で GI50 算出。
In vitro kinase assay と kinetic 解析: Recombinant RET kinase domain (KD、amino acids 658-1072、gene accession NM_020630) を Sf9 insect cell + baculovirus + N-terminal GST tag で発現。Kinetic constants は triplicate × 25°C、incubation time 0-50 min、ATP 3.125-400 nM serial、vandetanib serial dilution、IGF1Rtide synthetic peptide substrate (KKKSPGEYVNIEFG、SignalChem)、³²P-ATP (PerkinElmer) で測定、TriLux scintillation counter で radioactivity 計測。Michaelis-Menten 式で Km[ATP]、Vmax、kcat、kcat/Km[ATP]、Ki を GraphPad Prism v6.0 で算出。Autophosphorylation time course: 2.5 μM recombinant RET-KD + 5 mM ATP + 10 mM MgCl2、0-80 min、SDS-PAGE + Western blot (anti-phospho-Tyr1062、anti-phospho-Tyr905)。
Thermal shift assay (TSA): WT / S904F mutant RET-KD を SF21 cells + GST tag で発現、CIP-phosphatase で脱リン酸化 (またはそのまま) + Mg-ATP で再リン酸化、1 μM vandetanib または DMSO と incubation、Sypro-Orange 蛍光 dye (Life Technologies)、Applied Biosystems 7500 Fast RT-PCR で 25-90°C の melting temperature (Tm) を計測、Protein Thermal Shift Software v1.2 で解析。
X-ray crystallography: RET-KD (residues 705-1013、kinase insert 827-840 削除) を Sf9 baculovirus で発現、affinity chromatography 精製、4.5 mg/mL (20 mM Tris pH 8、100 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM EDTA)。Sitting drop 16°C、3.4 M sodium formate + 0.1 M sodium acetate pH 4.4 で結晶化、Swiss Light Source でデータ収集、Phenix.refine で精密化、Coot で rebuilding。Resolution 2.3 Å、R-work 19.8%、R-free 23.7%、PDB 6FEK に登録。
Molecular dynamics (MD) simulation: Initial structure は PDB 2IVU (vandetanib-bound RET) および 2IVT (ATP-bound RET)。Disordered loop は MOE (Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, v2013.08) で modeling。GROMACS 4 + Amber ff99SB-ILDN force field + TIP3P water + GAFF for vandetanib/ATP、GAMESS で HF/6-31G* 電子状態最適化、PME (particle mesh Ewald) electrostatics、P-LINCS bond constraint、Parrinello-Rahman pressure coupling、298 K / 1 bar、time step 2 fs。RET-ATP system は 1 μs × 3 trajectory、RET-vandetanib system は 50 ns × 15 trajectory + selected 3 で 950 ns 延長。Conformational state は GRL (glycine-rich loop、residues 731-737) intermolecular energy (30 compound atoms × 7 residues × 2 = 420 energy terms) で hierarchical clustering (furthest-neighbor + Euclidean distance、cutoff 0.5 kcal/mol)。MP-CAFEE method で protein-compound binding free energy を 32 λ parameter set × 6 independent simulations = 384 simulations で算出 (K computer、RIKEN)。