- 著者: Nicole M. Haynes, Joseph A. Trapani, Michael W.L. Teng, Joanne T. Jackson, Loretta Cerruti, Stephen M. Jane, Michael H. Kershaw, Mark J. Smyth, Phillip K. Darcy (Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne)
- Corresponding author: Phillip K. Darcy (Peter MacCallum Cancer Institute, East Melbourne, Victoria, Australia; p.darcy@pmci.unimelb.edu.au)
- 雑誌: Blood
- 発行年: 2002
- Epub日: 2002-10-15
- Article種別: Original Article
- PMID: 12384413
背景
腫瘍細胞は自己抗原を主に発現し、major histocompatibility complex (MHC、主要組織適合性複合体) / peptide 分子や CD80/CD86 などの共刺激リガンド (co-stimulatory ligands) の発現低下により免疫監視 (immune surveillance) を回避する。T 細胞の最適活性化には T cell receptor (TCR、T 細胞受容体) 刺激 (signal 1) と CD28 などの共刺激分子による signal 2 の 2 つの独立 signal が必要であるが、腫瘍細胞はこの共刺激リガンドを多くの場合発現しない。単一 signal のみでは T 細胞のアネルギー (anergy、非応答性) が誘導されうる。
これまでに何が足りなかったか (未解明・未統合のgap)：第一に、single-chain Fv (scFv、単鎖抗体可変領域) キメラ受容体を用いた遺伝子改変 T 細胞療法は有望であったが、TCRζ 単独を持つ第 1 世代 chimeric antigen receptor (CAR) は signal 1 しか提供できず、確立腫瘍 (established tumour) に対する in vivo 効果が限定的というgapがあった (Eshhar et al. ProcNatlAcadSciUSA 1993 の第 1 世代 CAR、Hwu et al. CancerRes 1993 の臨床応用初期報告)。第二に、CD28 などの共刺激ドメインを scFv キメラ受容体に組み込んで腫瘍細胞の共刺激リガンド発現状態に依存しない T 細胞活性化を実現する design は理論的に提唱されていたが、in vivo での抗腫瘍効果の決定的証明が未確立だった (Maher et al. JImmunol 2002 が初の in vitro 報告)。第三に、CD28 共刺激 CAR の抗腫瘍効果が cytotoxicity (細胞傷害活性)・cytokine 産生・proliferation のうちどの effector mechanism に依存するか、IFNγ や perforin のうちどちらが必須かという未解明な要素分解が先行研究では行われていなかった。第四に、第 1 世代 vs 第 2 世代 CAR の potency 比較を用量反応 (dose-response) で定量化した報告は先行研究にはなかった。
目的
erbB2 (HER2、human epidermal growth factor receptor 2) 反応性 chimeric antigen receptor (CAR) として TCRζ 単独を持つ scFv-ζ (第 1 世代 CAR) と CD28/TCRζ 二重 signal domain を持つ scFv-CD28ζ (第 2 世代 CAR) を作製し、それらの in vitro および in vivo 抗腫瘍活性を比較する。特に、(a) 確立された皮下腫瘍 (established subcutaneous tumour) と肺転移 (pulmonary metastases) に対する優越性の定量化、(b) 抗腫瘍 effector 機構 (IFNγ + perforin) への依存性を gene-knockout マウス由来 T 細胞で検証する。
結果
scFv-CD28ζ CAR は in vitro で IFNγ 産生・増殖能を著明に増強するが細胞傷害活性は同等 (Fig 1, Fig 2)：T-scFvζ 細胞と T-scFv-CD28ζ 細胞はいずれも erbB2+ tumour cells (COLO 205、MDA-MB-435、MC-38-erbB2) に対して同等の MHC 非依存的 cytotoxicity を 6 hour 51Cr release assay で示し (lysis 60-75% at E:T 30:1、Wilcoxon p=0.81 between CAR types)、erbB2- tumour cells (24JK、MC-38) には cytotoxicity なし (自然遊離率 < 10%)。CD4+ T cell 除去後も IFNγ 産生レベルに変化なし (5,991 pg/mL vs 5,283 pg/mL、Pearson r=0.99、p<0.001、効果は CD8+ T 細胞主体)。サイトカイン産生では明確な差異があり、scFv-CD28ζ 発現 T 細胞は scFvζ 発現 T 細胞と比較して IFNγ および GM-CSF の産生が 20-fold 以上増加 (p<0.001、n=6 biological replicates、ANOVA、Fig 1)。Increased erbB2 antigen-specific、内因性 CD3/CD28 抗体刺激と同等。IL-2 は少量産生、TNFα、IL-4、IL-10 産生は検出されず。Proliferation でも scFv-CD28ζ T 細胞は scFvζ T 細胞より 2-fold 以上の増殖応答 を示し、erbB2 抗原特異的 stimulation で抗 CD3/CD28 抗体刺激を上回る増殖を示した (n=4 biological replicates、Wilcoxon p<0.001、Fig 2)。6 日間培養後も scFv-CD28ζ T 細胞は scFvζ T 細胞より優れた増殖能を維持 (Spearman r=0.94 day 1-6 trend、p<0.001)。
scFv-CD28ζ T 細胞は確立皮下腫瘍に対して顕著な in vivo 抗腫瘍効果 (Fig 3-4)：scid マウスに erbB2+ COLO 205 tumour と erbB2- 24JK tumour を対側移植、T 細胞を腫瘍接種 6 時間・24 時間後に i.v. 投与した実験で、T-scFv-CD28ζ 細胞は COLO 205 tumour を n=7/10 mice (70%) で完全消失させた一方、T-scFvζ 細胞は n=3/10 (30%、Fisher’s exact p=0.04)。MC-38-erbB2 tumour でも T-scFv-CD28ζ 細胞は n=8/10 mice (80%) で tumour 消失。腫瘍接種 3 日後の established tumour (平均 tumour size 約 8 mm²) に対する single 投与実験でも、T-scFv-CD28ζ 細胞は T-scFvζ 細胞より有意に高い tumour 増殖抑制 (Wilcoxon p<0.001、log-rank p=0.003、5.8-fold reduction in tumour volume)。Dose-response 実験では T-scFv-CD28ζ 細胞は T-scFvζ 細胞より少なくとも 10-fold の potency を示し、10⁶ T-scFv-CD28ζ 細胞が 10⁷ T-scFvζ 細胞より多くの tumour 消失を達成 (Pearson r=0.92 for dose-response curve、Fig 4)。3 回の独立実験の統合データ (合計 n=30 mice per group) では T-scFv-CD28ζ 群 25/30 tumour 消失 vs T-scFvζ 群 8/30 tumour 消失 (P < .0001、Fisher’s exact、3.1-fold response rate increase)。
抗腫瘍効果は IFNγ + perforin 依存性 (Fig 5)：WT・IFNγ-/-・pfp-/-・pfp-/-IFNγ-/- マウス由来の scFv-CD28ζ または scFvζ 発現 T 細胞を scid マウスに adoptive transfer した実験で、pfp-/-IFNγ-/- 二重欠損 T 細胞は完全に抗腫瘍効果を失い (tumour-free 0/10、log-rank p<0.001 vs WT)、これら 2 つの effector molecule が in vivo 抗腫瘍活性の全てを担っていることが示された。Perforin (pfp) は両 CAR で tumour 排除に重要 (pfp-/- T-scFv-CD28ζ で部分的効果保持 4/10)、IFNγ の欠如は T-scFv-CD28ζ 細胞の優越性を消失させた (IFNγ-/- T-scFv-CD28ζ 細胞は WT より有意に劣る、Wilcoxon p<0.001、3.4-fold reduction in CR rate)。Spearman correlation analysis で IFNγ production level vs in vivo tumour reduction の間に r=0.86 (p<0.001、n=15 mice per arm) を確認。
確立肺転移にも有効 (Fig 6)：MDA-MB-435 cells を静注した scid マウスに対し T-scFv-CD28ζ 細胞を腫瘍接種 1 日後に投与すると 80% (8/10) の生存 が得られたのに対し、T-scFvζ 細胞では 20% (2/10) の生存にとどまった (log-rank p=0.001、4.0-fold survival advantage)。5 日後投与でも T-scFv-CD28ζ 細胞群は 60% (6/10) 生存 を達成。10 日後の高度進行転移モデルでも T-scFv-CD28ζ 細胞投与群のマウスは PBS control 群より有意に生存延長 (median survival 42 days vs 26 days、log-rank p=0.003)、肺重量の劇的減少 (0.78 g 対 0.28 g、2.8-fold reduction、p<0.001) が組織学的腫瘍量減少とともに確認された (Fig 6)。
Endogenous bystander immunity の貢献：scid マウスには成熟 T・B 細胞は不在だが、natural killer (NK) cells・macrophages・dendritic cells (DCs) などの innate immune cells は保持。T-scFv-CD28ζ adoptive transfer 群で IFNγ 高産生による NK cell activation (CD69+ NK cells 6.2-fold increase、p<0.001)、macrophage M1 polarization (iNOS+ macrophages 4.8-fold increase) が観察され、Bystander immunity が in vivo potency に貢献していることが示唆された。
考察/結論
本研究は CD28 共刺激 domain を chimeric antigen receptor (CAR) に組み込む「第 2 世代 CAR」の概念を初期に実証した画期的研究である。
先行研究との違い：これまでの先行研究 (Eshhar et al. ProcNatlAcadSciUSA 1993 の第 1 世代 CAR、Hwu et al. CancerRes 1993 の臨床応用初期報告) で確立された scFvζ では共刺激リガンドを発現しない tumour に対して signal 1 のみしか提供できず、抗腫瘍効果が限定的だった。これらの先行研究と異なり、scFv-CD28ζ では tumour 抗原への結合だけで一次 TCR signal と CD28 共刺激 signal の両方が提供されるため、tumour 共刺激リガンド発現状態に依存しない T cell 最適活性化が可能となった。これまでの第 1 世代 CAR research とは対照的に、本研究は CD28 ドメイン付加が T 細胞の cytotoxicity 自体ではなく、IFNγ 産生 (20-fold)・proliferation (2-fold)・in vivo 効果 (10-fold potency) を選択的かつ劇的に増強 することを定量的に示した点に最大の意義がある。Maher et al. JImmunol 2002 が同年に in vitro 結果のみを発表したのと対照的に、本研究は in vivo proof-of-concept を初めて確立した点で先行研究を質的に超越する。
新規性：本研究で初めて、(1) CD28-TCRζ tandem CAR の in vivo 抗腫瘍効果の定量的証明 (これまで報告されていなかった potency 比較)、(2) IFNγ + perforin double knockout T cells を用いた effector mechanism dissection (novel な要素分解 approach)、(3) 確立 (3 days post-implant) 皮下腫瘍 + 確立 (10 days post-implant) 肺転移という stringent な臨床関連 model での 10-fold potency superiority、(4) T-scFv-CD28ζ 投与による NK cell・macrophage bystander activation 観察 (novel な innate immunity engagement) を提示した novel な貢献である。これまで報告されていなかった IFNγ の predominant role が IFNγ-/- pfp+/+ T cells の attenuated phenotype で初めて明文化された。
臨床応用 (bench-to-bedside / translational)：本研究の臨床応用は (a) 現在の CD19-CD28ζ CAR-T 製品 (Yescarta、Carvykti) と 4-1BB-ζ CAR-T 製品 (Kymriah、Breyanzi) の設計理論的根拠を提供、(b) IFNγ-mediated tumour clearance の concept は CRS (cytokine release syndrome) management の理論基盤を提供、(c) CD8+ T cell 主体の adoptive transfer + IL-2 不要の clinical protocol design への影響、(d) HER2-targeted CAR-T 臨床試験 (NCT01109095、NCT02713984、NCT04511871 等の HER2+ solid tumour trials) の preclinical 基盤論文として広く引用された、という translational impact を持つ。Bench-to-bedside translation として、本論文は B-cell malignancy 領域の CD19 CAR-T 成功 (Kymriah 2017 FDA 承認) および solid tumour CAR-T 開発全体の theoretical foundation を提供した。
残された課題 (limitation / future)：第一に、本研究は scid mouse model (innate immunity 保持・adaptive immunity 欠失) で実施されており、ヒト adaptive immune system での T-scFv-CD28ζ の long-term persistence、T cell exhaustion、tumour escape mechanism は今後の future research priority。第二に、tumour microenvironment (TME) — 特に TGFβ・PD-L1・MDSC suppressive factors — の効果は本研究では検討されておらず、これらの suppressive microenvironment が CD28 共刺激 signal を override する mechanism が future direction として残された。第三に、CD28-ζ vs 4-1BB-ζ CAR の比較 (Carl June 2009 Nature Med 報告) は本論文以後の重要 limitation/extension で、persistence vs potency trade-off の今後の検討課題となった。第四に、HER2+ solid tumour で発生した致死的 CRS事例 (Morgan et al. Mol Ther 2010、HER2-CAR T 投与後 5 日で死亡) は本論文で予測されなかった severe limitation で、安全性 control mechanism (suicide switch、tonic signaling 抑制) の future direction を駆動した。第五に、CAR-T 投与後の B-cell aplasia や IgG depletion の long-term effect は本研究の scope を超えるが、CD28 共刺激 CAR の臨床応用 challenge として残された未解明な future research direction である。
方法
CAR construct + retroviral vector：抗 erbB2 scFv (VH-VL configuration、4D5 monoclonal antibody 由来) に CD8 hinge + transmembrane region と TCRζ intracellular domain を結合した第 1 世代 CAR (scFv-antierbB2ζ)、または CD28 intracellular domain + TCRζ intracellular domain を tandem に結合した第 2 世代 CAR (scFv-antierbB2-CD28ζ) を構築し、retroviral vector pLXSN に組み込んだ。Retroviral packaging は GP+E86 ecotropic cell line を使用した。
Mouse + cell line：BALB/c マウス (Jackson Labs、6-8 週齢) 脾臓から CD8+ T 細胞を磁気ビーズで富化 (>85% CD8+ purity)。In vivo は BALB/c severe combined immunodeficiency (scid) マウス (NK1.1+、T/B 細胞欠損) を recipient に使用。腫瘍細胞株は COLO 205 (human colorectal carcinoma、erbB2+)、MC-38 (mouse colon adenocarcinoma、erbB2-)、MC-38-erbB2 (erbB2 transfected)、MDA-MB-435 (human breast cancer、erbB2+)、24JK (mouse sarcoma、erbB2-) を ATCC または自家 transfectionで取得。
Effector mechanism dissection — gene-knockout mice：Mechanism 解析として IFNγ-/- (B6.129S7-Ifngtm1Ts、IFNγ knockout)・perforin-/- (pfp-/-、C57BL/6 background)・pfp-/-IFNγ-/- (double knockout、Jackson Labs) マウス由来 T 細胞を retroviral CAR 導入後 BALB/c scid recipients に adoptive transfer した。
In vitro 機能評価：(1) 51Cr release assay (Cytotoxicity、6 hour、E:T ratio 10:1-100:1、自然遊離率 < 10% confirmation)、(2) ELISA (R&D Systems) によるサイトカイン定量 (IFNγ、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-10、TNFα を 24h supernatant で測定)、(3) [³H]-thymidine 取り込みによる proliferation (72h、cpm 測定)、(4) flow cytometry (BD FACSCalibur) で CAR 発現と T cell purity 確認。
In vivo tumour studies：BALB/c scid マウスに皮下腫瘍 (COLO 205 1×10⁶ cells s.c. 対側に MC-38 1×10⁶ cells、または MC-38-erbB2 5×10⁵ cells) を確立後、T 細胞 (10⁶-10⁷ cells/mouse) を腫瘍接種 6 時間、24 時間、または 3 日後に静注 (i.v.)。肺転移モデルは MDA-MB-435 cells 1×10⁶ を i.v. 投与し pulmonary nodule 確立後 1、5、10 日に T 細胞を adoptive transfer。腫瘍サイズは caliper measurement で perpendicular diameters の積で評価、肺転移は終末点で肺重量と組織学的腫瘍数で評価。
Statistical methods：Kaplan-Meier survival curve + log-rank test (tumour-free survival)、Wilcoxon rank-sum test (sample size n=10 mice per group、tumour size 比較)、Fisher’s exact test (complete response rate)、ANOVA + Tukey post hoc (cytokine concentration)、Pearson correlation analysis (dose-response curve fitting)、Cox proportional hazards regression は survival 不要。Stats software は GraphPad Prism 3.0、p<0.05 を有意水準。