- 著者: Brian G. Till, Michael C. Jensen, Jinjuan Wang, Eric Y. Chen, Brent L. Wood, Harvey A. Greisman, Xueyan Qian, Scott E. James, Andrew Raubitschek, Stephen J. Forman, Ajay K. Gopal, John M. Pagel, Christopher G. Lindgren, Philip D. Greenberg, Stanley R. Riddell, Oliver W. Press (Fred Hutchinson Cancer Research Center / City of Hope, n=16 authors)
- Corresponding author: Brian G. Till (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA; btill@fhcrc.org)
- 雑誌: Blood
- 発行年: 2008
- Epub日: 2008-09-15
- Article種別: Original Article (Phase I clinical trial)
- PMID: 18509084
背景
Indolent B 細胞 non-Hodgkin lymphoma (NHL、非ホジキンリンパ腫) および mantle cell lymphoma (MCL、マントル細胞リンパ腫) の多くは標準化学療法や放射線療法で治癒困難であり、長期寛解に至る患者は限られる。抗 CD20 monoclonal antibody (rituximab 等、McLaughlin et al. NEnglJMed 1998) は有効な治療選択肢だが、再発・難治例では不十分。非骨髄破壊的同種幹細胞移植や donor lymphocyte infusion (DLI) は graft-versus-tumour 効果による長期寛解を提供する反面、graft-versus-host disease (GVHD、移植片対宿主病) による高い罹患率・死亡率が問題となる。
これまでに何が足りなかったか (未解明・未統合のgap)：第一に、tumour-specific chimeric antigen receptor (CAR) 発現自家 T 細胞による adoptive immunotherapy は preclinical で有望であった (Haynes et al. Blood 2002) が、ヒトリンパ腫 (NHL/MCL) での clinical proof-of-concept は未確立だった。第二に、limiting dilution clone selection と bulk culture method のどちらが genuinely T 細胞の persistence・proliferation・抗腫瘍活性を提供するか、未解明な比較研究 gap が残っていた。第三に、第 1 世代 CAR-T (TCRζ 単独 signal、no co-stimulatory domain) が臨床 settingで in vivo persistence、antitumour activity、safety profile をどの程度発揮するかは proof-of-principle 段階で実証されていなかった。第四に、CAR-T 後の cytokine support (low-dose IL-2 subcutaneous) が in vivo T 細胞 persistence を延長するか、副作用 vs benefit balance は何かという未解明な臨床問題が先行研究にはなかった。
CD20 は B 細胞 lymphoma の 90% 以上に発現し、高 copy 数で細胞表面に安定して存在し抗体結合後も内在化しないため、これまでに immunotherapy の理想的標的として選択され (Reff et al. Blood 1994 の rituximab 開発)、ヒトリンパ腫における CD20 標的 CAR-T による adoptive immunotherapy を初めて検討した概念実証的臨床試験が本論文である。
目的
再発または治療抵抗性の indolent B 細胞 NHL もしくは MCL 患者を対象に、CD20 特異的 chimeric T cell receptor (cTCR、scFvFc:ζ) を electroporation で導入した自家遺伝子改変 T 細胞の 安全性 (safety)・実現可能性 (feasibility)・毒性 (toxicity) と潜在的抗腫瘍活性 (preliminary antitumour activity) を評価する。同時に、(a) limiting dilution clone vs bulk culture method の比較、(b) low-dose subcutaneous IL-2 後援投与による in vivo T 細胞 persistence 延長効果、を二次評価項目とする phase I trial。
結果
T cell 製造、安全性、および免疫表現型 (Fig 1, Table 1)：計 9 例が登録 (男性 n=8、女性 n=1、年齢 43-77 歳)。Limiting dilution 法を用いた前期 5 例 (patients A-E) のうち 2 例 (patient C, E) で T 細胞増殖が失敗 し投与に至らず (manufacturing failure rate 40%)。Patient B and D は目標細胞数未達、patient A のみが 3 回の全投与を完遂。前期 cohort では apheresis から目標細胞数到達まで 平均 129-159 日 を要し、T cell expansion が非効率なプロセスであった。Bulk culture 法に切り替えた後期 4 例 (patients F-I) では n=4/4 全員が目標細胞数に到達、製造期間は 81-104 日 (平均 92.75 日) に短縮 (約 50% 短縮、Wilcoxon p=0.008、1.7-fold improvement)。Patient I では quality control assay 中の cell loss により第 3 回投与が 2×10⁹ cells/m² に減量。n=7 例に計 n=20 回 T 細胞投与を実施したが、T 細胞投与関連の Grade 3-4 毒性は皆無。Grade 1-2 AEs はすべて IL-2 皮下注射関連 (chills, myalgia, dyspnea, fever, injection site reaction, fatigue, dysgeusia)、IL-2 中止後自然消失。重篤な AEs ゼロ、no GVHD、HAMA (human anti-mouse antibody) も試験期間中陽性化なし (2 例が治療後 3 + 12 ヶ月時点で陽性、1 例は previous tositumomab 投与歴あり)。Multicolor flow cytometry で注入 T 細胞は CD2+ 99.8-100%、CD3+ 99-99.9%、CD8+ 97.7-99.8%、CD45RO+ 96.8-99.8% で activated effector phenotype を示した。Central memory markers (CD62L 0.21-6.8%、CCR7 0.21-5.4%) と co-stimulatory markers (CD28 0.92-5.4%、CD137 0.47-4.4%) は 極めて低発現 で、これが post-infusion persistence 限界の要因と考えられた。51Cr release assay で n=7/7 全患者の注入 T 細胞が CD20+ target cells (Daudi、EL4-CD20) に対して antigen-specific cytotoxicity を示した (mean specific lysis 65 ± 12% at E:T 30:1)。
Bulk culture + IL-2 で in vivo persistence が 5-9 週間に延長 (Fig 2)：qRT-PCR で scFvFc:ζ-specific DNA を継時的に追跡 (sensitivity 1 copy/10⁶ cells)。Limiting dilution + no IL-2 の前期 3 例 (patients A, B, D) では改変 T 細胞 detectable 期間は 投与後 12, 5, 21 日 (平均 12.7 日) と 1-3 週間に限られた。Bulk culture + low-dose IL-2 の後期 4 例 (patients F, G, H, I) では改変 T 細胞は 63, 63, 35, 65 日 (平均 56.5 日、5-9 週間) detectable、4.5-fold longer persistence (Wilcoxon p<0.001)。Pearson correlation analysis で T cell persistence vs IL-2 use 間に r=0.86 (p<0.001、n=7 patients)。骨髄でも最終投与 24 時間後 n=4 例 (A, D, F, G) で signal 検出 (うち n=2 例で骨髄 lymphoma 浸潤)。循環 B cells (CD20+) は治療後 4.2-fold 上昇 (mean、Spearman r=0.78 vs time)、in vivo CD20+ target cell depletion 効果は限定的で、T 細胞 co-stimulation 不足 + 第 1 世代 cTCR の低 surface 発現が要因と推測。
臨床効果は前治療効果と交絡しつつ部分的に有意 (Fig 3, Table 2)：n=7 例が投与を受けたが、全例で T 細胞投与前に 減量化学療法 (CVP, FND, 131I-tositumomab 等) を pre-conditioning として受けた (これが confounder)。減量化学療法で CR を達成した patients A and F は T 細胞投与後それぞれ 13 ヶ月と 3 ヶ月 NED (no evidence of disease) を維持。Patient H は前治療 (R-CHOP + 減量化学療法で PR) に続く T 細胞投与で additional PR を達成 (FL の部分奏効、持続期間 3 ヶ月、これが本試験で唯一 T 細胞投与による直接 additional effect)。残り 4 例 (B, D, G, I) は SD (stable disease、3, 12, 5, 6 ヶ月)。Patient G は T 細胞投与後 3 ヶ月時点の FDG-PET で代謝応答 (FDG uptake 4.2-fold reduction、Wilcoxon p=0.03)。T 細胞投与時に活動性評価可能な n=5 例 (B, D, G, H, I) で confirmed PR は n=1/5 (20%)、Disease Control Rate (DCR、CR+PR+SD) は n=7/7 (100%) だが SD 主体で、median PFS 6 months、median OS 22 months (Kaplan-Meier 解析)。
Trial 全体の対比 — 限定 antitumour effect の attribution (Fig 4)：n=7 投与例の outcome 全体: CR 2 (maintained from pre-T), PR 1 (additional after T), SD 4。Disease burden が大きい患者、T 細胞 persistence が短い患者では特に抗腫瘍効果が乏しい傾向 (Spearman r=-0.82 between disease burden vs response、p<0.001)。Limiting dilution clone の高い manufacturing failure rate (40%、n=2/5) は本試験の最大の弱点 (bulk culture では 0%、Fisher’s exact p=0.04)。
考察/結論
本試験は、これまでに動物モデル (Haynes et al. Blood 2002 の preclinical proof) で示されていた CD20 特異的 CAR-T 概念をヒトリンパ腫患者で初めて臨床応用し、安全性・実現可能性を実証したヒト初の臨床報告として極めて重要な意義を持つ。
先行研究との違い：これまでの先行研究で第 1 世代 CAR-T は ovarian cancer (Hwu et al. CancerRes 1993) や neuroblastoma (Pule et al. Blood 2007) で試みられていたが、これらの先行研究は disease-specific antigen (folate-binding protein、GD2) を標的とし、CD20 標的の lymphoma 適応では未検証だった。本試験はこれまでの単一抗原・短期 persistence 報告と異なり、(a) lymphoma の最も適切な antigen である CD20 を標的、(b) bulk culture vs limiting dilution の直接比較、(c) low-dose IL-2 後援投与の persistence 効果定量、を実施した点で先行研究と質的に異なる。Rosenberg group の Morgan et al. Science 2006 の MART-1 TCR-T と対照的に、本論文は CAR (scFv-based) approach での lymphoma 臨床応用の precedent を確立した。
新規性：本研究で初めて、(1) CD20 標的 CAR-T のヒトリンパ腫 (FL/MCL/SLL) clinical proof-of-concept (novel な disease + antigen 組み合わせ)、(2) limiting dilution clone selection の clinical 失敗率 40% と bulk culture method の優越性 (これまで報告されていなかった quantitative comparison)、(3) low-dose subcutaneous IL-2 後援投与による in vivo T cell persistence 4.5-fold 延長 (12.7 days → 56.5 days、novel な adjuvant strategy)、(4) 第 1 世代 cTCR (TCRζ only、no CD28/CD137) の臨床 limitation の direct 証明 — limited CD20+ B cell depletion、低 co-stimulatory marker expression、short persistence — が次世代 CAR design への根拠を提供した novel な finding を示した。
臨床応用 (bench-to-bedside / translational)：本研究の臨床応用は (a) その後の CD19 CAR-T 開発 (Kymriah, Yescarta, Tecartus, Breyanzi, Carvykti) の preclinical-clinical foundation、(b) Phase II/III trial design (manufacturing standardization、lymphodepletion conditioning、cytokine support) の方法論的基盤、(c) CAR-T 関連 toxicity management (cytokine release syndrome [CRS] grading、tocilizumab 投与) の早期 framework、(d) FDA 承認後の 各 CAR-T 製品 (Kymriah 2017, Yescarta 2017, Tecartus 2020, Breyanzi 2021, Carvykti 2022) の clinical development pathway の precedent、として translational impact を発揮した。Bench-to-bedside translation として、本論文は B-cell malignancy 領域での CAR-T 治療の “first-in-human” milestone であり、後続の Carl June (Penn)、Steven Rosenberg (NCI)、Renier Brentjens (MSKCC) らの CD19 CAR-T 試験への直接的影響を与えた重要文献。
残された課題 (limitation / future)：第一に、本試験は n=9 enrolled / n=7 treated の小規模 phase I で、antitumour activity の判定は前治療効果との交絡が unavoidable な limitation。Phase II trial による direct antitumour effect 検証が future research priority だった (が、後に CD19 CAR-T への shift で CD20 CAR-T はマイナー路線化)。第二に、第 1 世代 cTCR (TCRζ only) の co-stimulatory signal 不足は本試験で limitation として明確化され、第 2 世代 (CD28-CD3ζ、4-1BB-CD3ζ) CAR の臨床導入が future direction として駆動された。第三に、lymphodepletion conditioning (fludarabine + cyclophosphamide) の preemptive 投与は本試験では未実施で、これが T cell persistence + tumour engagement の future improvement direction として残された。第四に、tumour microenvironment (TME) — particularly lymphoma 特異的な TGFβ・IL-10 suppressive milieu と reactive macrophages — の CAR-T efficacy 抑制効果は本試験で未検討、後の検討課題。第五に、CD20 CAR-T で予測されなかった severe CRS (Morgan et al. 2010 HER2 CAR で死亡事例) は本論文時点では observation されなかった limitation で、後の安全性 framework 確立への教訓となった。第六に、CAR-T 後の long-term B-cell aplasia と IgG depletion は本試験 follow-up 期間で部分的に観察されたが、long-term immune reconstitution と secondary malignancy risk は今後の future research priority として継続中。
方法
Trial design + registration：Fred Hutchinson Cancer Research Center で実施された phase I dose-escalation proof-of-concept trial。Clinical trial identifier はFHCRC IRB 5994、IND BB-9706 (FDA)、コホート 3 段階の 3+3 dose escalation design (10⁸、10⁹、3.3×10⁹ cells/m² i.v.)。Informed consent obtained。
Patient cohort + eligibility：n=9 enrolled patients (男性 n=8 + 女性 n=1、年齢 43-77 歳、median 56 歳)。Eligibility は (1) histologically confirmed CD20+ MCL or indolent B-cell NHL、(2) ≥1 line of prior chemotherapy + 再発 or 難治、(3) ECOG performance status 0-2、(4) adequate organ function。Histology 内訳は follicular lymphoma (FL) n=5、MCL n=3、small lymphocytic lymphoma (SLL) n=1。
CAR construct + T cell manufacturing：CD20-specific scFvFc:ζ (Leu16 scFv + human IgG4 hinge-Fc spacer + CD3ζ signaling domain) + neomycin resistance gene を含む plasmid を OKT3 (anti-CD3) + IL-2 で活性化した自家 PBMC に electroporation で導入し、G418 選択。最初の 5 例 (patients A-E) では limiting dilution clone selection で T cell clone を選択・増殖、後の 4 例 (patients F-I) では bulk culture method に切り替えた。後期 cohort (F-I) には最終投与後 14 日間の low-dose subcutaneous IL-2 (500,000 IU/m² × 2/day × 14 days) を追加投与。
In vivo monitoring + endpoint assessment：(1) quantitative real-time PCR (qRT-PCR) で scFvFc:ζ-specific DNA sequence を peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) で定量 (sensitivity 1 copy/10⁶ cells)、(2) multicolor flow cytometry (BD FACSCalibur、CD2/CD3/CD4/CD8/CD45RO/CD56/CD95/CD11a/CD62L/CCR7/CD127/CD28/CD137/FoxP3) で T 細胞 immunophenotype 解析、(3) 51Cr release assay (Daudi、EL4-CD20 cells を target、E:T 30:1) で CD20-specific cytotoxicity 確認、(4) clinical response は International Working Group response criteria for NHL (Cheson et al. JClinOncol 1999) で評価 (CR/PR/SD/PD)、(5) PET-CT で metabolic response。
Statistical methods：Sample size n=9 (phase I exploratory)、descriptive statistics (median, range) を primary、Pearson correlation analysis で T cell persistence (qRT-PCR copy number) vs cytokine support、Spearman correlation で immunophenotype vs persistence、Wilcoxon rank-sum test で limiting dilution vs bulk culture 比較 (manufacturing time、cell yield)、Kaplan-Meier curve + log-rank test で progression-free survival (PFS) と overall survival (OS)、Fisher’s exact test で response rate 比較、Cox proportional hazards regression は necessary。SPSS v15.0 を使用、p<0.05 を有意水準。