- 著者: Jassowicz L, Feng F, Warta R, Heinicke F, Wöllner A, Briesch H, Sor F, Soller J, Lotsch C, Wong JKL, Park CG, Aubert N, Scheer M, Hu Z, Knoll M, Schlegel J, Frank L, Dao Trong P, Jungwirth G, Nohman AI, Maaß K, Grabe N, Barthel M, Butz S, Lulay C, Zucknick M, Bortolomeazzi M, Sant P, Thewes V, Michel L, Fremd C, Schneeweiss A, Sun C, Rippe K, Abdollahi A, von Deimling A, Unterberg A, Krieg SM, Mallm JP, Lichter P, Zapatka M, Seiffert M, Herold-Mende C
- Corresponding author: Lena Jassowicz (Heidelberg University Hospital); Martina Seiffert (DKFZ); Christel Herold-Mende (Heidelberg University Hospital)
- 雑誌: Cancer cell
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-04-27
- Article種別: Original Article
- PMID: 42049023
背景
乳癌脳転移 (BCBM) は、乳癌患者の最大32%に発症し、生存中央値16ヶ月と極めて予後不良な疾患である (Kuksis et al. 2021)。BCBMの治療戦略には、手術、放射線療法、全身療法が含まれるが、脳転移患者は他の部位の転移患者と比較して最悪の予後に直面しており、脳内でも効果的な治療法の改善が喫緊の課題である (Sperduto et al. 2020)。腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) の量は乳癌サブグループにおいて予後因子であり (Savas et al. 2016)、ネオアジュバント化学療法後のTIL増加は病理学的腫瘍奏効と相関することが報告されている (Park et al. 2020)。現在、免疫チェックポイント阻害剤 (ICB) は、原発性および転移性トリプルネガティブ乳癌 (TNBC) 治療の重要な柱である (Cortes et al. 2022; Schmid et al. 2022)。
歴史的に脳は免疫特権臓器とされてきたが、複数の研究により、脳転移が多様な末梢免疫細胞によって浸潤されることが示されている (Klemm et al. 2020; Friebel et al. 2020; Karimi et al. 2023; Gonzalez et al. 2022)。しかし、BCBMにおけるICBの有効性や免疫微小環境の不均一性については包括的な理解が不足している。ICBはメラノーマや肺癌の脳転移では有効性が示されているが (Tawbi et al. 2018; Long et al. 2018; Goldberg et al. 2020)、BCBMにおけるICBのデータは限られているものの、BCBMマウスモデルでのICB有効性 (Niesel et al. 2021; Nayyar et al. 2024) や、ヒトBCBMへのT細胞動員を示唆する報告 (Sun et al. 2023)、小規模な混合腫瘍コホートでの頭蓋内でのICB効果 (Brastianos et al. 2023) など、有望な結果も示されている。しかし、BCBMに特化したICBの予測因子に焦点を当てた前向き臨床試験はまだ実施されていない。
これまでのBCBMの免疫学的解析は、コホートサイズの制約、異なる腫瘍種の混合、または解析深度の不足により、BCBM特異的な免疫浸潤の患者間不均一性や予後との関連を十分に解明できていなかった (Klemm et al. 2020; Friebel et al. 2020; Karimi et al. 2023; Gonzalez et al. 2022; Berghoff et al. 2016; Duchnowska et al. 2016; Griguolo et al. 2022)。したがって、BCBM特異的な免疫浸潤の患者間不均一性とその臨床的関連性、および機能的に関連する免疫細胞サブセットの理解が未解明なまま残されており、これが治療法の開発における知識ギャップとなっている。特に、脳転移の微小環境における免疫細胞の動態や、それらがICB応答にどのように影響するかについては、依然として不明な点が多い。
目的
本研究は、156例の乳癌脳転移 (BCBM) からなる大規模かつ均質なコホートにおいて、マルチモーダル解析（組織サイトメトリー、バルクRNA-seq、単核RNA-seq (snRNA-seq)、フローサイトメトリー、空間トランスクリプトミクス）を統合的に実施し、BCBMの免疫微小環境の不均一性を包括的に特徴づけることを目的とした。さらに、患者予後と関連する免疫ランドスケープを同定し、その機能的意義を患者由来モデルで検証するとともに、免疫療法応答予測バイオマーカーとしての遺伝子発現シグネチャを開発し、独立コホートで検証することを目指した。これにより、BCBMにおける抗腫瘍免疫の重要な洞察を提供し、臨床応用可能な新規バイオマーカーを特定することを目的とする。特に、CD8+組織常在記憶T細胞様細胞 (TRM様細胞) や三次リンパ構造 (TLS) の臨床的関連性、および免疫チェックポイント阻害 (ICB) 治療に対する応答予測因子としての可能性を詳細に評価することを目指した。
結果
CD8+ T細胞浸潤の患者間不均一性と予後独立性: 137例のBCBMにおけるCD8+ T細胞密度は6〜874 cells/mm²（中央値67 cells/mm²）と極めて高い患者間不均一性を示した (Figure 1K)。この浸潤率はBCBMサブタイプ、患者年齢（平均55歳）、Karnofsky performance index (KPI)、転移個数、前治療（化学療法、放射線、ICB、ステロイド）のいずれとも有意な関連を示さなかった (Figures 1K-1M)。CD8+ T細胞高浸潤（上位4分位以上）は、単変量Kaplan-Meier解析 (n=125 patients, ログランク検定) および多変量Cox比例ハザードモデル (n=116 patients) において、独立した予後良好因子として確認された (HR 0.65, 95% CI 0.45-0.95, p=0.026) (Figures 1N, 1O; Table S2)。腫瘍内CD8+ T細胞密度と周囲のT細胞密度は有意に相関しており (Figure 1I, 1J)、血液脳関門 (BBB) 通過がBCBM T細胞浸潤の律速段階として機能することが示唆された。また、腫瘍関連ミクログリア/マクロファージ (TAM) (HLA-DR+) はBCBM中で最も多い免疫細胞（中央値454 cells/mm²）であり、HLA-DR高発現TAM密度も独立した予後良好因子として同定された (Figure S4)。
5つの免疫エコタイプの同定と予後的意義: 137例のBCBM組織サイトメトリーデータを用いた非教師ありk-meansクラスタリングにより、5つの免疫エコタイプが同定された (Figures 2B-2K)。エコタイプ1（免疫砂漠型、47%）は最もリンパ球浸潤が乏しく、エコタイプ2はリンパ球が少なく顆粒球密度が最高であった。エコタイプ3はT細胞・TAM主体の浸潤、エコタイプ4は広範な免疫細胞浸潤（顆粒球含む）、エコタイプ5はB細胞豊富を特徴とした。多変量Cox比例ハザードモデル (n=116 patients) で、エコタイプ3 (HR 0.58, 95% CI 0.36-0.95, p=0.03) とエコタイプ5 (HR 0.44, 95% CI 0.23-0.84, p=0.01) が独立した予後良好因子として同定された (Figure 2N; Table S2)。TNBC BCBMはエコタイプ2、4、5に多く見られ、小脳BCBMは免疫砂漠型（エコタイプ1）の割合が最低であった (Figures 2L, 2M)。
snRNA-seqによる単細胞レベルの細胞アーキテクチャ解析: 28例のTNBC BCBMのsnRNA-seqにより、総細胞数56,268個（中央値UMI数8,228 per cell、平均3,513遺伝子/細胞）から12の主要細胞型が同定された (Figures 3C, 3D)。細胞の71%が腫瘍細胞であり、残りが脳常在細胞、血管関連細胞、免疫細胞であった (Figure 3E)。骨髄系細胞 (n=4,853 cells) は10のサブクラスターを形成し、HLA-DR/DP/DQ高発現群としてTAM STAT1+、TAM HSPE+ (Heat Shock Protein E+)、TAM MG HAMP+ (Hepcidin Antimicrobial Peptide+)、TAM MG CCL3+の4サブクラスターが予後良好と関連した (Figures 3F, 3G, S10)。一方、MRC1+ (Mannose Receptor C-type 1+) TAMは免疫抑制表現型を示した。T/NK細胞 (n=2,142 cells) のサブクラスタリングでは、CD8+ T細胞は2つの主要表現型に分かれた (Figures 3H, 3I)。CD8+ TRM様細胞はITGAE (CD103)、PDCD1 (PD-1)、GZMB、GZMH、PRF1、KLRC1 (NK-like) を高発現し、腫瘍反応性T細胞シグネチャと一致した (Figures 3I-3L; Table S5)。
CD8+ TRM様細胞の表現型・機能・空間分布: 8例の新鮮BCBMのフローサイトメトリーで、TRM様細胞 (CD103+) は血液CD8+ T細胞と比較して高い活性化マーカー (CD38、CD69、PD-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3) を示し、腫瘍内に周囲組織より有意に多く濃縮されていた (p≤0.0001) (Figures 4B-4F)。自家腫瘍オルガノイドT細胞キリングアッセイ (48h, n=5 patients) において、CD8+ TRM様細胞はnon-TRM memory T細胞よりも有意に高いCaspase 3/7活性（腫瘍細胞アポトーシス）を誘導した (adjusted p<0.01) (Figures 4I-4K)。TRM様細胞高割合（全BCBM中11%）は、単変量・多変量生存モデルで独立した予後良好因子として確認された (HR 0.53, 95% CI 0.31-0.91, p=0.02) (Figures 4N, 4O; Table S2)。空間トランスクリプトミクス解析 (n=8 BCBM samples) では、CD8+ TRM様細胞が腫瘍領域に空間的に濃縮されていることが示された (Figure 5D)。CD8+ TRM様細胞と腫瘍細胞間のクロストークは、TGFβシグナル伝達とPVR/NECTIN2-TIGIT軸が関与することが予測された (Figure 5E)。
デュアルICBによる腫瘍細胞殺傷増強: 12例のBCBM TIL-腫瘍細胞共培養実験で、デュアルICB（抗PD-1ペムブロリズマブ 50 μg/mL + 抗TIGITチラゴルマブ 50 μg/mL）により、腫瘍細胞生存率が有意にさらに低下した (9/12例で有意なTIL媒介腫瘍殺傷、単剤では有意差なし、Wilcoxon検定p<0.05) (Figures 5P-5R)。これは、デュアルICBがBCBMにおけるCD8+ T細胞応答を再活性化する可能性を示唆する。
三次リンパ構造 (TLS) の独立予後因子としての確認: 全BCBMの11%、エコタイプ5の59%に三次リンパ構造 (TLS) が検出され、DC-LAMP+ DCが含まれていた (Figures 6A-6C)。TLSを有するBCBMも、多変量Cox比例ハザードモデル (n=116 patients) で独立した予後良好因子として同定された (HR 0.44, 95% CI 0.22-0.88, p=0.02) (Figures 6E, 6F; Table S2)。TRMランドスケープとTLSランドスケープのオーバーラップは最小限であり、異なる抗腫瘍免疫機構を反映していることが示唆された (Figure 6D)。
新規TRMおよびTLSシグネチャの予後予測能: バルクRNA-seqから導出されたTRMおよびTLS遺伝子発現シグネチャは、独立バリデーションコホート (CATCHコホート、n=35 patients) の単変量・多変量モデルで予後良好と有意に関連した (TRM: HR 0.36, 95% CI 0.16-0.82, p=0.015; TLS: HR 0.42, 95% CI 0.17-1.01, p=0.053) (Figures 7B, 7C, 7E, 7F)。これらのシグネチャは腫瘍変異負荷 (TMB) やマイクロサテライト不安定性 (MSI) とは無相関であり (Figures 7D, 7G)、独立した予測因子としての可能性を示した。さらに、TCGA原発乳癌データセット (n=1,048 patients) でも両シグネチャは多変量モデルで独立した予後因子として検証され (TRM: HR 0.76, 95% CI 0.65-0.89, p<0.001; TLS: HR 0.77, 95% CI 0.66-0.90, p=0.001) (Figures 7H, 7J, 7K, 7M)、ICB治療患者コホートにおいてTRMおよびTLSシグネチャスコアがICB応答者で有意に高いことが示された (Figures 7P, 7Q)。特に、TRMシグネチャスコアはICB応答者で非応答者と比較して有意に高かった (p<0.05)。
考察/結論
本研究は、156例のBCBMを対象とした初の包括的マルチモーダル免疫解析であり、原発性乳癌のTIL解析からは予測不可能なBCBM特異的な2つの予後良好免疫ランドスケープ (TRM、TLS) を発見・検証した。
先行研究との違い: 従来の「脳は免疫特権臓器」という概念に反し、本研究はBCBMの一部 (11%) が活発な抗腫瘍免疫 (TRM) を有することの大規模実証を初めて行った。また、先行研究ではコホートサイズの制約や異なる腫瘍種の混合によりBCBM特異的な免疫浸潤の不均一性を十分に解明できていなかったが、本研究では大規模かつ均質なコホートを用いることで、この不均一性を詳細に特徴づけた点で異なっている。特に、CD8+ TRM様細胞の機能的殺傷能を自家腫瘍オルガノイドモデルで直接検証した点は、これまでの単なる細胞浸潤の報告とは対照的である。
新規性: 本研究で初めて、CD8+ TRM様細胞が脳転移微小環境で腫瘍細胞と空間的に直接接触し、かつ機能的殺傷能を有するという細胞型特異性を確立した。これは単なる浸潤ではなく、機能評価を伴う点で新規性が高い。さらに、デュアルICB（抗PD-1+抗TIGIT）がex vivoで腫瘍殺傷を有意に増強したという初めての機能的根拠を提供し、TIGIT軸の臨床的妥当性を示唆した。また、TRMおよびTLSシグネチャが原発乳癌コホート (TCGA n=1,048 patients) にも適用可能で独立予後因子であること、および転移未発症患者で発症患者より有意に高いスコアを示すことを確認した点も新規である。
臨床応用: バルクRNA-seqから算出可能なTRMおよびTLSサロゲートシグネチャは、費用対効果の高いバイオマーカーとして、BCBM患者のICB適応選択に活用できる可能性がある。特に、TRMおよびTLSシグネチャスコアがICB応答予測に関連することが示されたため、これらのバイオマーカーは個別化医療の推進に貢献しうる。また、原発乳癌ではTRM免疫シグネチャが基底細胞様サブタイプに多く、ルミナルサブタイプには少なかったが、BCBMでは全てのサブタイプでTRM免疫ランドスケープが同等に検出されたことから、TNBC以外のBCBM患者においてもICBの有効性を評価する価値があることを示唆する。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) TRMおよびTLSシグネチャのICB応答予測能を前向き臨床試験（BCBM対象ICBコホート）で検証すること、(2) TRM様細胞の持続的抗腫瘍免疫とTIGIT/PD-1共発現による枯渇様表現型の克服戦略の開発、(3) 体液性免疫 (TLS) と細胞性免疫 (TRM) ランドスケープが独立して存在する機構的説明、(4) TRMスコアとTMB/MSIが無相関である理由の解明（ネオアンチゲン量以外の免疫応答規定因子の探索）、が重要である。本研究は神経外科的に切除された検体に基づいているため、手術適応のないBCBM患者サブグループを過小評価している可能性がlimitationとして挙げられる。また、顆粒球はsnRNA-seqデータでは検出されなかったため、その表現型や免疫抑制機能の特性評価にはさらなる研究が必要である。
方法
本研究では、156例の神経外科的に切除されたBCBM組織サンプルおよび生細胞懸濁液を対象に、マルチモーダルな解析を実施した。まず、137例のBCBMに対し、多重蛍光免疫染色と半自動画像解析を組み合わせた組織サイトメトリーを用いて、主要な免疫細胞（CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、腫瘍関連ミクログリア/マクロファージ (TAM)、顆粒球、B細胞、樹状細胞 (DC)）の密度を定量した。細胞密度はスライド全体で評価され、信頼性の高い結果を得た。
次に、28例のTNBC BCBM（CD8+ T細胞浸潤率と免疫エコタイプの多様性を代表するように選択）から単核RNA-sequencing (snRNA-seq) を実施し、56,268個の細胞をプロファイリングした。これにより、12の主要細胞型と、骨髄系細胞（10サブクラスター）およびT/NK細胞（4つのCD4+ T細胞サブクラスター、3つのCD8+ T細胞サブクラスター、1つのNK細胞サブクラスター）のサブクラスターを同定し、それぞれの特徴的な遺伝子発現プロファイルを解析した。snRNA-seqデータは、患者特異的SNPを用いたデマルチプレックスパイプライン (Wong et al. 2023) を適用し、in silicoでのダブルレット検出を改善した。
機能解析として、8例の新鮮なBCBMから得られた腫瘍浸潤T細胞をフローサイトメトリーで解析し、末梢血T細胞と比較して活性化マーカーおよび免疫チェックポイント分子の発現を評価した。さらに、完全自家腫瘍オルガノイド-T細胞キリングアッセイを開発し、BCBM由来のCD8+ TRM様細胞とCD8+非TRM様記憶T細胞の腫瘍細胞殺傷能力を比較した。このアッセイでは、BCBM由来の腫瘍オルガノイドを培養し、自己T細胞を共培養することで、腫瘍細胞のアポトーシス誘導をCaspase 3/7活性として定量した。また、12例のBCBM TIL-腫瘍細胞共培養実験において、抗PD-1抗体（ペムブロリズマブ 50 μg/mL）と抗TIGIT抗体（チラゴルマブ 50 μg/mL）のデュアルICBが腫瘍細胞生存率に与える影響を評価した。
空間トランスクリプトミクスは、8例のBCBMに対し、単細胞解像度分子カートグラフィーを用いて実施し、主要細胞型および骨髄系・T細胞サブクラスターの組織内分布と相互作用を解析した。特に、腫瘍内領域と腫瘍周囲領域におけるT細胞サブセットの空間的濃縮を評価し、リガンド-レセプターペア発現に基づくCellChat解析を用いて細胞間相互作用を推測した。
臨床データとの統合解析には、単変量および多変量Cox比例ハザードモデル、Kaplan-Meier解析 (ログランク検定) を用いて、免疫細胞浸潤と患者予後との関連を評価した。非教師ありk-meansクラスタリングにより、免疫エコタイプを同定した。さらに、バルクRNA-seqデータからTRMおよびTLS免疫ランドスケープの遺伝子発現シグネチャを機械学習アプローチで導出し、独立したBCBMコホート (CATCHコホート、n=35 patients) および原発乳癌コホート (TCGAデータセット、n=1,048 patients) でその予後予測能を検証した。ICB治療患者コホート（メラノーマ、胃癌、肺癌、乳癌）におけるTRMおよびTLSシグネチャスコアとICB応答との関連もMann-Whitney検定を用いて評価した。