- 著者: Adrian E. Morelli, Adriana T. Larregina, William J. Shufesky, et al.
- Corresponding author: Adrian E. Morelli (Thomas E. Starzl Transplantation Institute, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA)
- 雑誌: Blood
- 発行年: 2004
- Epub日: 2004-07-29
- Article種別: Original Article
- PMID: 15284116
背景
樹状細胞 (DC) は、T細胞の寛容または免疫を決定するシグナルを検出することで、細胞微小環境のバイオセンサーとして機能する抗原提示細胞 (APC) である Banchereau et al. Nature 1998。DCは、受容体介在性エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、またはファゴサイトーシスによって細胞外抗原を獲得し、隣接細胞から放出される微小胞の取り込み、そして最近記述された「エクソソーム」と呼ばれるナノ小胞 (≤100 nm) との相互作用によって抗原を取り込むことが知られている Albert et al. JExpMed 1998。エクソソームは、後期エンドソームまたは多胞体 (MVB) の膜が逆方向に芽生えることで形成され、MVBが原形質膜と融合することで細胞外空間に放出される Raposo et al. JExpMed 1996。当初は腫瘍細胞株で記述されたが Trams et al. BiochimBiophysActa 1981、エクソソームは白血球や上皮細胞からも産生されることが示されている Harding et al. JCellBiol 1983。
エクソソームの機能は依然として未解明な点が多いが、APCにとっての抗原源であり、Tリンパ球への抗原提示に関与することが報告されている Thery et al. NatRevImmunol 2002。主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) および共刺激分子を高濃度に発現するエクソソームは、T細胞クローンやT細胞株を弱く活性化するものの、ナイーブT細胞を刺激することはできない。このナイーブT細胞刺激能の低さは、T細胞受容体の架橋能力が低いこと (ナイーブT細胞活性化には不十分であること)、およびその小さなサイズと膜組成に起因すると考えられていた。しかし、DCの存在下では、エクソソームのT細胞刺激能が増強されることが示されている。
エクソソームとDCの細胞間相互作用のメカニズムは未確立であった。エクソソームがDCと相互作用する際に、単にDC表面に結合するのか、膜融合するのか、あるいは内在化されてプロセシングされるのかは不明であった。特に、エクソソームが機能的なMHC-I/ペプチド複合体をDCに転送し、CD8+ T細胞を活性化する可能性が示唆されていたが、その詳細なメカニズムは確立されていなかった。また、移植免疫の文脈では、ドナー由来エクソソームを静脈内投与した場合の体内動態、宿主DCによる間接的同種認識 (indirect allorecognition) への寄与、および移植寛容誘導における応用可能性については、実験的根拠が不足していた。本研究は、これらの知識ギャップを埋めることを目的とした。
目的
本研究は、エクソソームと樹状細胞 (DC) の相互作用メカニズムを多角的に解明することを目的とした。具体的には、以下の3つの主要な目的を設定した。
- DCによるエクソソーム内在化の分子機構の解明: DCがエクソソームを内在化する際に、どのような表面分子が関与し、そのプロセスが能動的であるか受動的であるかを明らかにすること。特に、MFG-E8 (乳脂肪球上皮成長因子8)/ラクトアドヘリン、CD11a、CD54、ホスファチジルセリン (PS)、テトラスパニン (CD9、CD81) といった候補分子の役割を検証する。
- 内在化エクソソームの細胞内輸送とMHCクラスII抗原提示経路の実証: 内在化されたエクソソームがDC内でどのように細胞内輸送され、どの細胞内コンパートメントで処理されるのかを追跡すること。さらに、エクソソーム由来の抗原がMHCクラスII分子にロードされ、CD4+ T細胞に提示されるメカニズムを分子レベルで実証すること。
- 血流中アロゲニックエクソソームのin vivo動態と移植免疫への関与の解析: 血流中を循環するアロゲニックエクソソームがin vivoでどのように捕捉され、どの細胞種に取り込まれるのかを追跡すること。特に、脾臓DCによるエクソソームの取り込みがDCの成熟に影響を与えるか、また、エクソソーム由来の同種抗原がCD4+ T細胞に提示されることで、移植免疫における間接的アロ認識経路にどのように寄与するのかを解析し、移植寛容誘導への応用可能性を探ること。
結果
エクソソームの表面分子依存的内在化: マウス骨髄由来樹状細胞 (BMDC) (n=5 mice, B10) がエクソソームを内在化するかを解析した。BALB/c BMDC由来エクソソームは、MHC-I/II、CD71 (トランスフェリン受容体)、CD80、CD86、およびDCによるエクソソームのドッキングまたは内在化に関与すると考えられるリガンド (CD11a-c、CD54 (細胞間接着分子-1; ICAM-1)、MFG-E8/ラクトアドヘリン、CD9、CD81、および外部化されたホスファチジルセリン (PS)) を発現する65-100 nmの膜小胞で構成されていた (Figure 1A-C)。in vitroで、30% ± 7%のDCが37°Cで2時間以内にPKH67標識 (緑色) エクソソームを内在化した (Figure 2A)。エクソソームの取り込みは、サイトカラシンD、EDTA、または4°Cで低下し、エクソソームがDC表面に付着するのではなく、能動的に内在化されたことを示唆した (Figure 2A)。エクソソームの取り込みは、αv (CD51) とβ3 (CD61) インテグリン、CD11aとそのリガンドCD54、またはテトラスパニンCD9とCD81の同時阻害により有意に減少した (p≤.001) (Figure 2B)。PSの可溶性アナログであるO-ホスホ-L-セリンは、エクソソームのBMDCによる内在化を抑制した (p<.001)。MFG-E8/ラクトアドヘリンのアゴニストmAb 2422はBMDCによるエクソソームの捕捉を増加させ (Figure 2B)、RGD配列を含むヘキサペプチドの添加はDCによるエクソソームの取り込みを減少させた (Figure 2B)。補体受容体3および4 (CD11b-c/CD18) のブロッキングでは阻害は検出されなかった (Figure 2B)。
未成熟DCによるエクソソームの効率的な内在化: エクソソームを捕捉する能力が未成熟 (CD11c+ CD86-) DCと成熟 (CD11c+ CD86+) DCで異なるかを検証した。PKH67標識エクソソームのファゴサイトーシス後、BMDCをCyChrome-CD11cおよびPE-CD86 mAbで標識した結果、エクソソームは主に未成熟 (CD86-) BMDCによって内在化された (Figure 2C)。脾臓DCの2つの主要なDC集団、すなわちCD11c+ CD8α- CD86- 未成熟DC (辺縁帯に位置) とCD11c+ CD8α+ CD86lo 未成熟/半成熟DC (T細胞領域に存在) の両方がin vitroでPKH67標識エクソソーム (BALB/c) を内在化した (Figure 2D)。エクソソームがDC表面に付着するのではなく、脾臓DCによってエンドサイトーシスされたことを確認するため、脾臓DC (n=4 replicates, B10) をPKH67+エクソソーム (BALB/c) と短時間 (30分、37°C) インキュベートし、冷EDTA/PBSで洗浄、固定後、BALB/cエクソソーム表面に存在するが脾臓DC (B10) 表面には存在しないマーカー (IA d, FasL, 膜結合TNFα) を認識するmAbで標識した。アクセプターDC (B10, IA b+) 表面にエクソソーム (BALB/c) のIA d, FasL, またはTNFαが検出されなかったことから、エクソソームが内在化され、DC表面に付着していなかったことが確認された (Figure 2D)。
内在化エクソソームの細胞内ソーティング: BMDCにおける内在化エクソソームの細胞内輸送を研究した。未成熟 (CD86-) BMDC (n=4 cells, B10) をTexas red-transferrin (赤色; 早期エンドソーム標識用) またはDil-低密度リポタンパク質 (Dil-LDL; 赤色; 後期エンドソーム/リソソーム染色用) で前培養し、PKH67標識 (緑色) DC由来エクソソーム (BALB/c) と共培養し、共焦点顕微鏡で解析した。PKH67は5分という早期に早期エンドソームで検出され (Figure 3A-B)、2時間後にはDil-LDL+ 後期エンドソーム/リソソーム (LAMP-1+) で検出された (Figure 3C-D)。この結果は、LAMP-1 mAbで標識したBMDCのサイトスピンでも確認された (Figure 3E)。免疫電子顕微鏡により、BMDCエクソソーム (BALB/c) を5-nm金IA d mAbで表面標識し (Figure 3F)、BMDC (B10) とインキュベートした。20分後、5-nm金標識エクソソームは、その限界膜にLAMP-1を発現する後期エンドソーム内部で検出された (Figure 3G-I)。より遅い時点 (1-2時間) では、5-nm金粒子はLAMP-1を発現する電子密度の高いリソソーム小胞内で検出された (Figure 3J)。BMDC表面に5-nm金標識エクソソームや5-nm金粒子は検出されなかった (Figure 3G, アスタリスク)。
DCによる内在化エクソソーム由来同種抗原のMHCクラスII提示: BMDCがエクソソーム由来の同種ペプチドをMHCクラスIIにプロセシングし、ロードする能力を調査した。BMDC (n=3 experiments, B10; IA b; IE-) を同種エクソソーム (BALB/c, IA d; IEα+) と24時間インキュベートした後、成熟 (CD86+) BMDCは、IA b-IEα52-68に特異的なY-Ae mAbによる染色で評価したところ、表面にIA b-IEα52-68を発現した (Figure 4A)。エクソソーム由来のIEα52-68同種ペプチドのIA bへのロードが、低pH小胞を介した内在化エクソソームのプロセシングを必要とするかを検討するため、エンドサイトーシス小胞内の酸性化とプロテオリシスを阻害するNH4Clを用いて同様の実験を行った。NH4Clは、エクソソーム (BALB/c) 摂取後のBMDC (B10) におけるY-Aeエピトープ形成を可逆的に減少させた (Figure 4A)。BMDC (B10) がエクソソーム由来抗原からペプチドをT細胞に提示する能力を測定した。エクソソーム (BALB/c) と培養後、BMDC (B10) は、用量依存的にIA b-IEα52-68を特異的なCD4+ T細胞ハイブリッドBEα20.6および1.3H1に提示した (Figure 4B)。コントロールとして、IEαを発現するC3Hエクソソームを与えたBMDC (B10) もT細胞ハイブリッドを刺激した (Figure 4B)。エクソソーム (BALB/c) で前培養したDC (B10) によるT細胞ハイブリッドの刺激は、Y-Ae mAbによってブロックされた (Figure 4C)。CD40を介した活性化は、BMDCがエクソソーム由来の同種ペプチドをCD4+ T細胞に提示する能力をさらに増強した (Figure 4D)。
in vivoにおけるエクソソームの体内動態と脾臓DCによる抗原提示: PKH67標識同種エクソソームをB10マウスに静脈内注射後2時間で、PKH67は脾臓辺縁帯のMOMA-1+ メタロフィリックマクロファージ、ER-TR9+ マクロファージ、およびCD11c+ DCで検出された (Figure 5A-C)。PKH67はH2D d (PKH67およびH2D dはBALB/cエクソソーム由来) と共局在し、脾臓B10 DCのLAMP-1+ 小胞に蓄積した (Figure 5D-E)。24〜48時間後、PKH67+封入物を含むCD11c+ DCが脾臓濾胞の中心で検出された (Figure 5F)。静脈内エクソソーム投与後2時間で、脾臓CD11c+ DC (そのほとんどがCD8α-) は、循環PKH67+エクソソームをF4/80+ 赤脾髄マクロファージよりも効率的に内在化した (10% ± 3% vs 3% ± 0.7%) (Figure 5G)。CD8α+ DCにおけるPKH67の割合は、後の時点で増加した。in vivoで循環するPKH67+エクソソームは、肝臓の (F4/80+) クッパー細胞にも捕捉された (Figure 5H-J)。
エクソソーム静脈内投与は脾臓DCの成熟を誘導しない: 血流中エクソソームの捕捉がin vivoでの脾臓DCの成熟に影響を与えるかを調査した。B10マウスに同種エクソソーム (BALB/c) を静脈内注射 (200 µg/マウス) 後24時間で、脾臓DCはDC成熟マーカーであるIA b, CD86, またはCD54の発現を上昇させなかった (Figure 6A)。エクソソームの投与は、in vivoでのアゴニストCD40 mAb (腹腔内) による脾臓DC成熟を妨げなかった (FGK4.5, Figure 6A)。DCによるサイトカインmRNA発現へのエクソソームの影響はRPAで解析した。同種エクソソーム (BALB/c) との相互作用後4時間および16時間で、BMDC (n=2 experiments, B10) が発現するサイトカインmRNAに有意な変化は検出されなかった (Figure 6B-C)。
in vivoにおける脾臓DCによるエクソソーム抗原のCD4+ T細胞への提示: 脾臓DCが内在化エクソソーム由来の同種抗原をプロセシングし、in vivoでMHC IIにロードしてCD4+ T細胞に提示する能力を解析した。エクソソーム (BALB/c) をB10マウスに静脈内注射後24〜36時間で、IA b-IEα52-68を発現する脾臓DCが脾臓のT細胞領域で検出された (Figure 7A)。フローサイトメトリーにより、脾臓DCの10%から15%がエクソソーム由来の同種ペプチドをMHC-II分子にロードしていた (Figure 7B)。36時間後、フローソーティングにより分離した脾臓CD8α- DCおよびCD8α+ DC (B10) を1.3H1 CD4+ T細胞の刺激源として使用したところ、CD8α+ DCのみがIA b-IEα52-68を提示し、T細胞活性化を誘導した (Figure 7C)。CD8α- DCおよびDCを除去した脾臓細胞 (CD11c-画分) は、同種ペプチドをT細胞に提示しなかった (Figure 7C)。
考察/結論
本研究は、エクソソームが樹状細胞 (DC) に特異的な表面分子機構を介して能動的に内在化され、早期エンドソームから後期エンドソーム/LAMP-1+ 多胞体 (MVB) を経由してMHCクラスII分子に抗原提示されるという、一連の経路を分子・細胞レベルで初めて包括的に解明した重要な研究である。
新規性: 本研究で初めて、エクソソームの内在化が、MFG-E8/ラクトアドヘリン、αvβ3インテグリン、CD11a、CD54、ホスファチジルセリン、およびテトラスパニン (CD9、CD81) といった複数の表面分子に依存する能動的なプロセスであることを実証した。特に、MFG-E8/ラクトアドヘリンのアゴニスト抗体2422がエクソソームの取り込みを増加させること、およびRGD配列含有ペプチドが取り込みを減少させることを示し、MFG-E8の役割を新規に同定した。また、in vivoにおいて血流中のエクソソームが脾臓のCD8α+ DCによって捕捉され、MHCクラスII経路で抗原提示されることを初めて明らかにした。
先行研究との違い: これまでの研究では、エクソソームが機能的なMHC-I/ペプチド複合体をDCに転送し、CD8+ T細胞を活性化する可能性が示唆されていたが、その詳細なメカニズムは不明であった。本研究は、エクソソームが単にDC表面に結合するのではなく、能動的に内在化され、エンドソーム経路でプロセシングされることを示し、従来の概念と異なり、MHCクラスII経路を介したCD4+ T細胞への抗原提示も可能であることを明らかにした。また、エクソソームの取り込みが補体受容体 (CD11b/c-CD18) には依存しない点も、アポトーシス細胞の取り込みとは対照的である。
臨床応用: 本研究の知見は、エクソソームが移植免疫における間接的アロ認識経路の代替抗原源となる可能性を示唆しており、移植寛容誘導のための新規治療戦略の臨床応用への道を開くものである。特に、ドナー由来エクソソームの静脈内投与が宿主DCの成熟を誘導しないという発見は、末梢性T細胞寛容の維持に寄与する可能性があり、拒絶反応を抑制しつつ寛容を誘導する治療法の開発に繋がる臨床的意義を持つ。
残された課題: 今後の検討課題として、エクソソームの細胞種特異的な組成がDCの活性化やT細胞応答に与える影響を詳細に解析する必要がある。また、in vivoにおけるエクソソームの体内動態が、投与経路 (皮下 vs 静脈内) や微小環境における危険信号の有無によってどのように変化し、それがT細胞応答の性質 (免疫誘導 vs 寛容誘導) にどう影響するかをさらに解明することが残されている。さらに、CD8α- DCからCD8α+ DCへのエクソソーム抗原の転送メカニズムや、CD8α+ DCが末梢性T細胞寛容を誘導する具体的な分子メカニズムについても、今後の研究で深掘りする必要がある。
方法
マウスと試薬: C57BL/10 (B10) およびBALB/cマウスはThe Jackson Laboratoryから入手した。1H3.1 TCRαβトランスジェニック (tg) マウスはDr. C. JanewayおよびDr. C. Viretから提供された。研究は施設動物実験委員会によって承認された。組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (rGM-CSF) はSchering-Ploughから、インターロイキン4 (mrIL-4) はR&D Systemsから供与された。サイトカラシンDおよびPKH67はSigmaから購入した。Y-Ae mAbおよび1.3H1細胞はDr. C. Janewayから、BEα20.6細胞はDr. P. Marrackから提供された。mAb 2422はDr. S. Nagataから提供された。
DCの作製: 骨髄 (BM) DCは既報の方法で作製した。B10マウスの大腿骨からBM細胞を採取し、低張溶解により赤血球を除去した。赤血球、TおよびBリンパ球、ナチュラルキラー (NK) 細胞、顆粒球は、mAb (TER-119, CD3ε, B220, NK-1.1, Gr1, IA b; BD PharMingen) とそれに続くウサギ補体 (Cedarlane) とのインキュベーションにより除去した。BM細胞はRPMI-1640培地 (Life Technologies)、10% (v/v) ウシ胎児血清 (FCS)、グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、HEPES、2-ME、抗生物質、およびmGM-CSFとmIL-4 (1000 U/mL) を加えて培養した。脾臓DCは既報の方法で分離した。B10マウスの脾臓をコラゲナーゼ (400 U/mL、30分、37°C) で消化し、0.01 M EDTAハンクス平衡塩溶液 (HBSS) に再懸濁した。DC濃縮懸濁液は、脾臓細胞を16% (w/v) メトリザミド (Sigma) で遠心分離することにより得た。脾臓DCの精製のため、DC濃縮懸濁液をビーズCD11c mAbで標識し、磁気カラム (Miltenyi Biotech) でソーティングした (DC純度 ≥ 92%)。
BMDC由来エクソソームの作製: BALB/c BMDCは「DCの作製」に記述された方法で作製した。4日目に、培地を新鮮な培地と、一晩超遠心分離 (100,000 g) で得られたエクソソームフリーFCS (10% v/v) に交換した。DC上清は6日目と8日目に回収し、4°Cで300 g (10分)、1,200 g (20分)、10,000 g (30分)、100,000 g (60分) で遠心分離した。エクソソームはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、一晩超遠心分離 (100,000 g) でペレット化した。エクソソーム調製物中のタンパク質量はBradfordアッセイ (BioRad) で評価した。フローサイトメトリー解析のため、500 µgのエクソソームを、CD11bまたはIA d mAbでコーティングされた一定数の4.5 µmビーズ (Dynabeads, Dynal) とインキュベートした。エクソソームでコーティングされたビーズは、以下のフィコエリトリン (PE) mAb (BD PharMingen) で標識した: H2D d, IA d, IE (BioDesign International), CD8α, CD9, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16/32, CD25, CD40, CD49d, CD54, CD71, CD80, CD81, CD86, CD95, CD107a, CD178, 腫瘍壊死因子 (TNF)α, TNF関連アポトーシス誘導リガンド (TRAIL; eBioscience), および抗乳脂肪球 (MFG)-E8/ラクトアドヘリン (クローン2422)。ホスファチジルセリン (PS) はPE-アネキシンV (BD PharMingen) で検出した。
電子顕微鏡: エクソソーム懸濁液は4%パラホルムアルデヒド (PF) で固定し、グリッドに載せて観察した。BALB/c BMDCエクソソームは5-nm金IA d mAbで標識し、B10 BMDCとインキュベートした。その後、BMDCをPFで固定し、3%ゼラチン中でインキュベートし、2.3 Mスクロースに再懸濁し、液体窒素中で凍結した。超薄切片はラット抗リソソーム関連膜タンパク質-1 (LAMP-1) mAb (1D4B, BD PharMingen) で標識し、続いて12-nm金抗ラットIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) で標識した。すべての透過型電子顕微鏡写真は、JEM1210電子顕微鏡 (JEOL) を80 kVで使用して取得した。画像はネガ (Kodak TEM Film; Kodak) から直接プリントし、Polycontrast紙 (Kodak) にプリントした。画像はScanJet 5300Cフラットベッドスキャナー (Hewlett Packard) を使用して1000 dpiでデジタル化した。
BMDCによるエクソソームの内在化: BALB/c BMDCエクソソームをPKH67で標識し、5 × 10^5個のB10 BMDCと混合した (1時間、37°C)。その後、細胞を冷PBSで洗浄し、PE CD11c mAbで標識し、PFで固定した。PKH67+エクソソームを有するCD11c+ DCの割合をフローサイトメトリーで解析した。ブロッキング実験では、BMDCを以下のmAb (10-25 µg/mL, BD PharMingen) で前培養した (30分、4°C): CD9 (KMC8), CD11a (M17/4), CD11b (M1/70), CD11c (HL3), CD18 (GAME-46), CD51 (H9.2B8), CD543E2, CD612G9.G2, CD812F7, またはMFG-E8 (2422)。一部のアッセイは、10 mM O-ホスホ-L-セリン、10 mM O-ホスホ-D-セリン (Sigma)、1 mg/mL H-Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro-OH (GRGDTP) または1 mg/mL H-Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro-OH (GRADSP) (Calbiochem) を用いて実施した。
共焦点顕微鏡: 早期および後期エンドソームの同定のため、BMDCを25 µg/mLのTexas red-transferrinまたは10 µg/mLのDil-低密度リポタンパク質 (Dil-LDL; Molecular Probes) とFCSを含まない培地中で30分間37°Cでインキュベートし、PBSで洗浄した。その後、BMDCをPKH67標識エクソソームと混合した。BMDCによるエクソソームの取り込みは、冷0.1%アジ化ナトリウムPBSで洗浄し、続いてPFで固定することにより停止させた。BMDCはポリ-L-リジンコーティングスライドに付着させ、Leica TCS-NT共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems) で画像化した。
抗原提示アッセイ: 1H3.1 TCRtg CD4+ Tリンパ球、およびT-T細胞ハイブリッドBEα20.6と1.3H1 (いずれもIA b (B10) 中のIEα52-68 (BALB/c) に特異的) を応答細胞として使用した。1H3.1 CD4+ T細胞は、1H3.1マウスの脾臓細胞から、CD8α, B220, IA b, NK1.1, およびF4/80 mAbを用いたネガティブセレクション、続いてDynabeads抗ラットIgG + DynabeadsパンマウスIgG (Dynal Biotech) とのインキュベーション、および磁気ソーティングにより精製した。IEα52-68ペプチドASFEAQGALANIAVDKAは高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で精製し、質量分析で確認した。B10 BMDCは1 µg/mLのIEα52-68、卵白アルブミン (OVA)-ペプチドSIINFEKL、または段階希釈したBALB/cエクソソームでパルスした。T細胞ハイブリッドの刺激は、段階希釈した (B10) BMDCを、平底96ウェルプレートのウェルあたり10^5個のハイブリッド細胞とインキュベートすることにより実施した。ブロッキング実験では、BMDCを30 µg/mLのY-Ae mAbまたは無関係なIgG2bで30分間前処理してからT細胞を加えた。24時間後、50 µLのアリコート上清を回収し、96ウェルプレートの100 µL培養液中でウェルあたり5000細胞のHT-1細胞株に対するIL-2産生を24時間テストした。細胞は培養の最後の4時間、ウェルあたり1 µCi (0.037 MBq) の[³H]チミジンでパルスした。1H3.1 CD4+ T細胞の増殖は72時間後に評価し、細胞は培養の最後の16時間、ウェルあたり1 µCi (0.037 MBq) の[³H]チミジンでパルスした。取り込まれた放射性同位元素の量はベータカウンターを使用して決定した。
免疫蛍光: クライオスタット切片 (8 µm) は4% PFで固定し、ヤギ血清でブロックし、以下のビオチン-mAbとインキュベートした: CD11c, H2D d (BD PharMingen), MOMA-1 (Bachem), F4/80 (Bachem), またはER-TR9 (Bachem)。その後、スライドを1:3000シアニン3 (Cy3)-ストレプトアビジン (Jackson ImmunoResearch Laboratories) とインキュベートした。トリプルラベリングのため、切片はビオチンY-Ae、ハムスターCD11c、およびラットB220 mAbとインキュベートした。第2ステップとして、スライドをCy3-ストレプトアビジン、Cy2抗ハムスターIgG、およびCy5抗ラットIgGとインキュベートした。サイトスピン (230 g) は4% PFで固定し、ヤギ血清でブロックし、ビオチンH2D d、ビオチンIA b、またはラットLAMP-1 mAbと一晩 (4°C) インキュベートし、続いてビオチン抗ラットIgとCy3-ストレプトアビジンとインキュベートした。核は4′6-ジアミジノ-2フェニルインドール2HCl (DAPI) (Molecular Probes) で染色した。
RNAseプロテクションアッセイ (RPA): サイトカインmRNAの解析は、既報のRPAで実施した。簡単に述べると、RNAは磁気ソーティングで分離したCD11c+ BMDCからTotal RNA Isolation Kit (BD PharMingen) を用いて分離した。マウスIL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p35, IL-12p40, インターフェロンα (IFNα), IFNβ, IFNγ, 腫瘍壊死因子α (TNFα), 形質転換成長因子β1 (TGFβ1), GM-CSF, 遊走阻止因子 (MIF), およびハウスキーピング遺伝子L32とグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) をコードするcDNAを、T7ポリメラーゼ指向性[γ-³²P]-ウリジン5′-三リン酸 (UTP)-標識アンチセンスRNAプローブのテンプレートとして使用した。各ターゲットmRNA 5 µgとアンチセンスRNAプローブセットとのハイブリダイゼーション (16時間、56°C) の後、RNAseおよびプロテイナーゼK処理、フェノールクロロホルム抽出、および保護されたRNA二重鎖の酢酸アンモニウム沈殿を行った。各RPAには、対応するアンチセンスRNAプローブセットを分子量標準として含めた。酵母tRNAをネガティブコントロールとして使用した。サンプルはアクリルアミド-尿素シーケンシングゲルで電気泳動した。バンドの定量はデンシトメトリー (Molecular Dynamics) で実施した。
統計解析: 結果は平均 ± SDで表した。平均間の比較は分散分析 (ANOVA) の後、Student Newman Keuls検定で実施した。2つの平均間の比較はStudent t検定で実施した。P値が0.05未満を有意とみなした。