- 著者: Isabella Parolini, Cristina Federici, Carla Raggi, Luana Lugini, Simonetta Palleschi, Angelo De Milito, Carolina Coscia, Elisabetta Iessi, Mariantonia Logozzi, Agnese Molinari, Marisa Colone, Massimo Tatti, Massimo Sargiacomo, Stefano Fais
- Corresponding author: Stefano Fais (Department of Therapeutic Research and Medicines Evaluation, Unit of Antitumor Drugs, Istituto Superiore di Sanita, Rome, Italy)
- 雑誌: The Journal of biological chemistry
- 発行年: 2009
- Epub日: 2009-09-30
- Article種別: Original Article
- PMID: 19801663
背景
エクソソームは、正常細胞およびがん細胞から分泌される直径 30-100 nm 程度の膜小胞であり、タンパク質、脂質、RNA、miRNA (microRNA) などの多様な分子を運搬し、細胞間の傍分泌性コミュニケーションにおいて重要な役割を果たす。特にがん領域では、腫瘍細胞由来エクソソームがアポトーシス誘導分子を搭載し、T細胞の細胞傷害活性を阻害することで、腫瘍免疫回避に寄与することが報告されている。また、正常細胞と腫瘍細胞由来のエクソソームでは、その機能的および構造的特性が異なることが示唆されている。エクソソームの分子組成や生物学的機能については多くの研究が行われてきたが、これらの微小胞の制御的役割についてはまだ不明な点が多い。エクソソームが細胞間コミュニケーションの媒体となるという複数の仮説が提唱されており、受容体細胞へのタンパク質、可溶性因子、そして特にRNAやmiRNAの送達を通じて、受容体細胞のタンパク質発現を調節することが Valadi et al. NatCellBiol 2007 により示されている。これは、生体の正常な恒常性維持と、腫瘍を含む様々な疾患の病態形成の両方において極めて重要である。さらに、免疫系細胞における膜小胞分泌機構の基礎は Raposo et al. JExpMed 1996 によって示され、生体内におけるエクソソームの存在やその多様な生理活性についても Thery et al. NatRevImmunol 2002 により体系的にレビューされている。
しかしながら、腫瘍エクソソームのトラフィッキング機構、特にその放出および細胞間移動のメカニズムは未解明であった。エクソソームと受容体細胞の相互作用についても、受容体-リガンド結合、エンドサイトーシス、膜融合など複数の仮説が存在するが、腫瘍細胞との膜融合による取り込みについては、これまで研究がほとんど行われておらず、詳細な分子メカニズムの解明に向けた知見が不足していた。例えば、エクソソームが正常な樹状細胞にエンドサイトーシス経路で取り込まれること Morelli et al. Blood 2004 や、血小板と融合する可能性が示唆されているが、腫瘍エクソソームとがん細胞の相互作用の性質を直接的に調べた研究は圧倒的に不足しており、大きな知識ギャップ (knowledge gap) が存在していた。
悪性腫瘍の微小環境は、細胞外pHが 6.0-6.5 と酸性を呈することが知られている。この酸性環境が、腫瘍細胞のカニバリズムや薬剤耐性といった悪性行動を制御することが、本研究グループにより先行研究で示されてきた。悪性メラノーマ細胞は、正常細胞が生存できないような酸性微小環境下でも生存可能であり、その理由は過活性なプロトンポンプが細胞質の酸性化を防いでいるためである。プロトンポンプ阻害剤 (proton pump inhibitor: PPI) はこの機構を標的とし、細胞質酸性化および酸性小胞の細胞内蓄積を誘導する抗腫瘍効果が報告されている。これらの知見に基づき、微小環境の酸性度が腫瘍エクソソームのトラフィック、すなわちその放出と腫瘍細胞による取り込みの両方を調節する上で関与している可能性が考えられたが、腫瘍の生理的pH条件である低pH条件下でのエクソソーム放出レベルやその動態は不明であり、解明すべき課題として残されていた。このように、腫瘍微小環境の酸性度がエクソソームの生物物理学的特性や細胞内取り込み効率に与える直接的な影響については、これまで十分な検証がなされておらず、研究データが著しく不足していた。
目的
本研究は、腫瘍微小環境の低pH (6.0) が腫瘍エクソソームの放出および細胞への取り込みに与える影響を定量的に評価することを第一の目的とした。次に、エクソソームの細胞への取り込みメカニズムが、エンドサイトーシスではなく膜融合であるという仮説を検証し、その分子機構を解明することを目指した。さらに、pH条件の違いがエクソソームの膜生物物理学的特性 (膜流動性、相状態) および脂質組成にどのような変化をもたらすかを解析し、膜融合効率の変動を媒介するメカニズムを明らかにすることを目的とした。具体的には、酸性条件下で放出されたエクソソームの膜剛性と脂質組成、特にスフィンゴミエリン (sphingomyelin: SM) およびガングリオシドGM3 (ganglioside GM3: GM3) 含量との関連性を検討した。加えて、プロトンポンプ阻害剤 (PPI) によるエクソソーム取り込みの抑制効果を検証し、腫瘍微小環境のpHがエクソソームトラフィックを制御する上で重要な役割を果たすことを示す。最後に、caveolin-1 (cav-1) を腫瘍悪性度に関連するカーゴモデルとして用い、低pH条件下でのエクソソーム媒介タンパク質転送の増強を検証し、エクソソームが悪性形質の傍分泌的拡散システムとして機能する可能性を評価することを目的とした。
結果
酸性pH条件下でのエクソソーム分泌増加: Mel1ac (pH 6.0) 細胞 (n=4 replicates) は、Mel1 (pH 7.4) 細胞と比較して、有意に多くのエクソソームを放出することが示された。タンパク質量での定量において、3〜4日間培養後に有意差 (p < 0.05) が認められ、酸性条件下での分泌促進が確認された (Fig 1B)。Lamp-2およびRab5Bのウェスタンブロット解析でも、酸性エクソソームでこれらのマーカーの増加が確認された (Fig 1C)。細胞周期解析 (n=3 replicates) および電子顕微鏡観察では、酸性培養による細胞毒性や超微細構造の異常は認められず、細胞の生存能力は低pH条件によって影響を受けないことが確認された。
エクソソームの膜融合による取り込み: NHS-ロダミン標識エクソソームを Mel1 細胞 (n=1 x 10^6 cells) に添加すると、Rab5B陽性早期エンドソームおよびLamp-1陽性リソソームとの共局在が認められたが、ゴルジ装置との共局在は観察されなかった (Fig 2A)。R18脂溶性プローブ脱クエンチング法を用いた膜融合アッセイ (n=3 replicates) では、エクソソームを細胞に添加後30分で最大蛍光の約 30% のFDが観察され、細胞を添加しない系ではFDの上昇はなかった (Fig 2B)。この脂質混合は膜融合の直接的な証拠と解釈された。融合活性は温度依存性を示し、生理的温度 (37℃) で最も高かったが、CaCl2依存性は弱かった。0.5% PAFで固定したエクソソームでは融合が約 20% 低下し、octylglucosideで可溶化後再構成したエクソソームも融合活性を示さなかった (Fig 2C)。これらの結果は、脂質が膜融合に直接関与する一方で、タンパク質が融合過程において構造的な役割を担うことを示唆する。さらに、フィリピン (コレステロール枯渇剤) で細胞を前処理すると、融合活性が約 50% 低下し (Fig 2D)、コレステロールを含む脂質組成が融合に必須であることが判明した。
低pH条件下での融合効率増大: 酸性エクソソーム (exoMel1ac) と酸性細胞 (Mel1ac) の組み合わせでは、通常pH条件 (exoMel1とMel1) よりも有意に高い融合効率を示した。この融合活性の差は5分以内に現れ、20〜30分後に統計学的に有意差 (p < 0.05) となった (Fig 2E)。フローサイトメトリーによるタイムコース実験でも、R18標識exoMel1acのMel1ac細胞 (n=3 x 10^4 cells/mL) への取り込みが、exoMel1のMel1細胞への取り込みよりも15分時点から有意に高かったことが確認された。フィリピン処理によるエクソソーム取り込みの低下は、酸性および通常pH条件の両方で認められたが、酸性条件下での取り込み低下はより顕著であった (Fig 2F)。これは、酸性環境がエクソソームの膜特性を変化させ、融合を促進する可能性を示唆する。
酸性エクソソームの高膜剛性: Laurdan蛍光分光法によるGP値は、37℃において exoMel1ac > exoMel1 > Mel1ac細胞 = Mel1細胞 の順で高く、酸性エクソソームが最も膜剛性が高いことを示した (Fig 4A)。全サンプルにおいて、GP値はLaurdan励起波長増大とともに低下し、これは液晶相を示すものであり、ゲル相との共存は認められなかった (Fig 4B)。これらのデータは、細胞とエクソソーム間、および異なるpH条件下で放出されたエクソソーム間で膜流動性に顕著な違いがあることを示し、脂質側方相分離がエクソソーム/細胞融合過程に直接関与する可能性を排除した。酸性エクソソームのGP値は、緩衝条件下のエクソソームと比較して有意に高かった (p < 0.05)。
脂質組成の差異: 脂質組成分析の結果、酸性エクソソームはSM + GM3含量が通常エクソソームより有意に高かった (exoMel1ac: 29 ± 1% vs exoMel1: 22 ± 1%、p < 0.05、1.3-fold increase)。一方、PEは酸性エクソソームで低下した (28 ± 1% vs 35.5 ± 2%、p < 0.05) (Table 1)。コレステロール含量は、エクソソームが親細胞よりも著しく高かった (exoMel1ac: 0.25 ug/ug protein vs Mel1ac: 0.03 ug/ug protein; exoMel1: 0.67 ug/ug protein vs Mel1: 0.06 ug/ug protein)。SMとコレステロールは脂質ラフト形成の主要構成要素であり、高SM + GM3含量が酸性エクソソームの高膜剛性と高融合効率の分子基盤である可能性が示唆された。
融合の腫瘍特異性: exoMel1の融合効率を転移性メラノーマ細胞 (Mel1〜3: 19-23%)、原発性メラノーマ細胞 (MelP1〜3: 9-12%)、および正常末梢血単核球 (PBMC: peripheral blood mononuclear cell) (<5%) で比較したところ、転移性腫瘍細胞で最も高く、正常PBMCではほとんど融合が観察されなかった (Fig 5C)。共焦点顕微鏡観察でも、R18-exoMelとPKH67-PBMC間では脂質混合イベントが観察されなかった (Fig 5D)。これは、エクソソームの融合が腫瘍細胞、特に悪性度の高い細胞に対して特異的に起こることを示唆する。
PPI処理による融合抑制: Mel1ac細胞 (n=1 x 10^6 cells) をPPI (10 ug/mL) で一夜前処理すると、酸性エクソソームの取り込みが有意に低下した (p < 0.01) (Fig 5B)。通常pH条件のエクソソーム (exoMel1) の取り込みはPPI処理で変化しなかった。この結果は、PPIが腫瘍の酸性化を阻害することで、低pH依存的な融合促進機構を遮断することを示している。
cav-1の傍分泌的送達: cav-1を高発現する Me665/1 細胞由来の酸性エクソソームは、cav-1を発現しない WM983A 細胞 (n=1 x 10^6 cells) の膜分画にcav-1およびLamp-2の移行を誘導した (Fig 6B)。この効果は酸性エクソソーム (exoMe665/1ac) で顕著であり、通常pH由来エクソソームでは低値であった。融合効率も同細胞系で酸性エクソソームが高値 (30分後有意差、p < 0.05) であることを確認した (Fig 6A)。これは、酸性条件下でエクソソームによる腫瘍関連分子の細胞間送達が増強される可能性を示唆する。
考察/結論
本研究は、腫瘍微小環境の低pHがエクソソームのトラフィックを制御する多面的なメカニズムを初めて体系的に示した先駆的研究である。
先行研究との違い: エクソソームの取り込み機構として、これまで提唱されてきたエンドサイトーシス経路や受容体介在性経路 Morelli et al. Blood 2004 と異なり、腫瘍細胞においては膜融合が主体であること、かつタンパク質が融合の構造的支持に必要であることが示された。パラホルムアルデヒド (PAF) 固定 (タンパク質架橋) やoctylglucoside溶解 (タンパク質変性) でも部分的にしか融合が低下しないことから、脂質と特定のタンパク質が協調して融合を駆動すると考えられる。これはウイルス膜融合の機構と類似点を持つが、エクソソームにおけるこのメカニズムはこれまで報告されていない点で対照的である。
新規性: 本研究で初めて、腫瘍微小環境の酸性化がエクソソーム放出を増加させ、高スフィンゴミエリン (SM) およびガングリオシドGM3 (GM3) 含量による高剛性エクソソームを産生することで融合効率を高めるという一連の機構を新規に確立した。スフィンゴ脂質は長鎖飽和アシル鎖により密なパッキングを形成し、コレステロールとともに高秩序の脂質マイクロドメイン (lipid rafts) を形成する。GM3はこれらドメインの認識マーカーであり、エクソソームの「融合コンピテント」状態を規定すると考えられる。
臨床応用: 転移性腫瘍細胞が正常細胞や原発性メラノーマ細胞よりもエクソソームの融合受容性が高いことは、腫瘍進行と腫瘍エクソソーム取り込み能の正の相関を示す。このことは、caveolin-1 (cav-1) のような腫瘍悪性表現型に関連する分子の傍分泌的伝播が悪性度の高い腫瘍細胞間でより効率的に起こることを意味し、「エクソソームによる悪性形質拡散」仮説を支持する。この知見は、腫瘍の悪性化メカニズムの理解と、新たな治療標的の探索に臨床的意義を持つ。さらに、プロトンポンプ阻害剤 (PPI) がエクソソーム融合を抑制するという発見は、PPIの新たな抗腫瘍機序を提供する。PPIは腫瘍細胞のプロトンポンプを阻害して細胞外pH上昇を引き起こし、エクソソームの融合誘導環境を消失させるという二重の抗腫瘍効果を持つことが示唆され、臨床応用への道を開くものである。
残された課題: 今後の検討課題として、in vivoモデルでの腫瘍酸性化-エクソソーム融合-悪性形質拡散の連鎖の実証、およびPPIの臨床応用としてのエクソソーム標的抗腫瘍療法の検討が重要である。本研究の限界 (limitation) として、in vitroモデルであり使用したエクソソーム量が細胞に対して恣意的である点、エンドサイトーシス経路との定量的な比較が不十分である点、脂質ラフト関連分子の機能的役割が間接的証拠にとどまる点が挙げられる。また、酸性エクソソームのタンパク質組成の網羅的解析 (プロテオミクス) は行われておらず、どのタンパク質が融合の構造的骨格を担うかは未確定であり、今後の研究による解明が待たれる。
方法
細胞およびエクソソーム単離: ヒト転移性メラノーマ細胞株である Mel1、Mel2、Mel3、Me665/1、および原発性メラノーマ細胞株である MelP1、MelP2、MelP3、WM983A を用いた。特に、cav-1を発現しない WM983A 細胞をレシピエント細胞として使用した。Mel1 細胞を酸性pH (6.0、Mel1ac) または通常pH (7.4、Mel1) の培地で培養し、2、3、4日後に培養上清から連続超遠心分離 (最終 100,000 x g) とスクロースグラジエント遠心分離によりエクソソームを精製した。精製されたエクソソームは、Lamp-2、Rab5B、CD81などの既知のエクソソームマーカーに対するウェスタンブロット解析により同定を確認した。
膜融合アッセイ (R18脱クエンチング法): エクソソームの膜融合活性は、自己消光濃度の蛍光脂溶性プローブ R18 (octadecyl rhodamine B chloride) でエクソソームを標識し、蛍光脱クエンチング (fluorescence dequenching: FD) を分光蛍光法で継続的にモニタリングすることで評価した。R18標識エクソソーム (10 ug) を 1 x 10^6 個の Mel1 細胞に添加し、30分間の蛍光変化を測定した (励起 560 nm、発光 590 nm)。最大FDは Triton X-100 (polyethylene glycol p-isooctylphenyl ether) と octylglucoside (octyl-beta-D-glucopyranoside) の添加により算出した。融合効率 (%FD) は、((F - Fi) / (Fmax - Fi)) x 100 の式で計算した。また、0.5% パラホルムアルデヒド (paraformaldehyde: PAF) で固定したエクソソームや、octylglucosideで可溶化後再構成したエクソソームの融合活性も評価した。細胞をフィリピン (filipin) (10 ug/mL) で前処理し、コレステロール枯渇が融合に与える影響も検討した。
エクソソーム取り込み評価: NHS-ビオチン (Sulfo-Biotin-NHS) で標識したエクソソームを細胞に添加し、ウェスタンブロット (ストレプトアビジン-HRP) により取り込み量を定量した。プロトンポンプ阻害剤 (PPI、10 ug/mL) で細胞を前処理した場合のエクソソーム取り込みへの影響も評価した。
膜流動性 (Laurdan蛍光分光法): エクソソームおよび親細胞の膜流動性は、蛍光プローブ Laurdan (6-dodecanoyl-2-dimethylaminonaphthalene、0.11 uM) を用いた蛍光分光法により評価した。37℃で45分間プローブを負荷した後、40℃から5.5℃までの温度勾配で励起スペクトルを測定し、一般化分極 (generalized polarization: GP) 値 = (I435 - I490) / (I435 + I490) を算出した。GP値が高いほど膜脂質の秩序度が高く、膜剛性が高いことを示す。
脂質組成分析: Folch法により脂質を抽出し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー (thin layer chromatography: TLC) で分離した。銅アセテート染色とデンシトメトリーにより、SM + GM3、ホスファチジルセリン (PS) + ホスファチジルイノシトール (PI) + ホスファチジルコリン (PC)、ホスファチジルエタノールアミン (PE) の各脂質分画の相対量を定量した。遊離コレステロール含量は、Amplex Red Cholesterol Assayキットを用いて測定した。
cav-1転送実験: cav-1を高発現する Me665/1 細胞由来の酸性pH (6.0) および通常pH (7.4) エクソソームを、cav-1陰性の WM983A 細胞に2時間添加した。その後、WM983A 細胞の膜分画を単離し、cav-1およびLamp-2に対するウェスタンブロット解析により、エクソソーム媒介によるcav-1の転送効率を評価した。
共焦点顕微鏡: NHS-ロダミンで標識したエクソソームを細胞に4時間添加した後、Rab5B (早期エンドソーム)、Lamp-1 (リソソーム)、Golgina (ゴルジ装置) に対する免疫染色を行い、エクソソーム取り込み後の細胞内分布を評価した。また、R18標識エクソソームと PKH67 (green fluorescent cell linker) 標識細胞を用いた生細胞でのリアルタイム共焦点顕微鏡観察により、脂質混合イベントを可視化した。
統計解析: 結果は平均値 ± 標準偏差 (S.D.) で表した。平均値間の比較には、両側不対 Student t-test (Student’s t-test) を用い、p < 0.05 を有意とみなした。