- 著者: Yongkang Yang, Chelsey Chen, Yajing Lyu, Olesia Gololobova, Xin Guo, Tina Yi-Ting Huang, Vijay Ramu, Varen Talwar, Elizabeth E. Wicks, Shaima Salman, Daiana Drehmer, Dominic Dordai, Qiaozhu Zuo, Kenneth W. Witwer, Kathleen L. Gabrielson, Gregg L. Semenza
- Corresponding author: Gregg L. Semenza (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA)
- 雑誌: The Journal of clinical investigation
- 発行年: 2025
- Epub日: 2025-07-15
- Article種別: Original Article
- PMID: 40662366
背景
乳がん (BC) は世界中で数百万人の女性に影響を及ぼす最も一般的ながんの一つであり、BC関連死の90%以上は原発腫瘍から遠隔部位、特に骨、肝臓、肺、脳への転移が原因である (Siegel et al., 2024)。転移性BC患者の10〜16%に臨床的脳転移が認められ、剖検では20〜40%で確認される (Palmieri et al., 2006; Weil et al., 2005)。4つの主要な転移部位の中で、脳転移はBC患者の主要な死因であり (Wang et al., 2021)、HER2陽性BCおよびトリプルネガティブBC (TNBC) では脳転移が転移性BCの1/3以上を占めるが (Anders et al., 2011)、その分子機構は依然として十分に解明されていない (Chiang & Massagué, 2008; Valiente et al., 2020)。脳転移患者の2年生存率は2%未満と極めて低い (Weil et al., 2005)。脳転移が成立するためには、がん細胞が血液脳関門 (BBB) を突破する必要がある。BBBは内皮細胞、周皮細胞、アストロサイト、および2つの基底膜から構成される微小血管の半透過性構造であり、分子、タンパク質、粒子が脳へ移行するのを厳密に制御している (Gril et al., 2020; Daneman & Prat, 2015)。BBB透過性の亢進が脳転移において重要な役割を果たすことが示されているが (Adkins et al., 2016; Connell et al., 2013; Gril et al., 2018; Lockman et al., 2010; Lyle et al., 2016)、その根底にある分子および細胞メカニズムは未解明な点が多く、この領域には依然として知識のギャップが残されている。
これまでの研究では、脳指向性BC細胞のin vivo選択 (Bos et al., 2009; Yoneda et al., 2001)、脳転移を促進または抑制する特定の遺伝子およびシグナル伝達経路の同定 (Chang et al., 2020; Wyss et al., 2021)、そして腫瘍由来細胞外小胞 (EVs) が特定の臓器への転移を促進する役割が明らかになってきた (Hoshino et al. Nature 2015; Rodrigues et al. NatCellBiol 2019; Klotz et al., 2020)。EVsはエクソソームやエクトソームを含み、原発腫瘍のがん細胞や間質細胞に由来するタンパク質、脂質、RNA、DNAを含有し、多くの患者の血漿中で検出される (Hoshino et al. Cell 2020)。EVsの表面に発現する膜タンパク質の中には、BC細胞の遊走および浸潤に既知の役割を持つインテグリンがあり (Desgrosellier & Cheresh, 2010)、臓器指向性転移を促進することが示されている。例えば、インテグリンα6β4およびα6β1を含むEVsは肺線維芽細胞および上皮細胞に結合することで肺転移を促進し、αvβ5を含むEVsはクッパー細胞に結合することで膵臓がんの肝転移を促進する (Hoshino et al. Nature 2015)。脳転移性BC細胞由来のEVsが脳血管内皮細胞に結合することも報告されているが、脳転移に関与する特定のインテグリンは未同定であり、この点に関する知見が不足している。
進行BCの多くには、重度の腫瘍内低酸素領域 (PO2 ≤ 10 mmHg = 1.5% O2) が存在する (Harris, 2002; Vaupel et al., 2004)。低酸素誘導因子 (HIFs) は、O2によって調節されるHIFαサブユニット (HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α) と構成的に発現するHIF-1βサブユニットからなるヘテロ二量体転写活性化因子であり (Wang et al., 1995; Yuan et al., 2024)、BC細胞が20% O2から1% O2に移行すると数千のRNAの発現を調節する (Lombardi et al., 2022; Lyu et al., 2024; Wang et al., 2021)。HIFsはコンセンサス結合部位5’-(A/G)CGTG-3’を含む低酸素応答エレメントに結合し (Semenza et al., 1996)、ヒストン修飾酵素をリクルートして転写開始と伸長を増加させる (Lyu et al., 2024; Wang et al., 2021; Dioum et al., 2009)。腫瘍生検におけるHIF-1α発現の増加はBC患者の死亡率と関連しており、HIFsは血管新生、がん幹細胞の特異化、上皮間葉転換、グルコースおよび脂質代謝、免疫回避、浸潤、転移を媒介する遺伝子産物の発現を活性化する (Cowman & Koh, 2022; de Heer et al., 2020; Wicks & Semenza, 2022)。HIF-1がBCの脳転移を促進することが示唆されているが (Ebright et al., 2020; Wyss et al., 2021)、その根底にあるメカニズムは完全には解明されていないという課題が残されている。
目的
本研究の目的は、低酸素がHIF-1 (hypoxia-inducible factor 1) を介して乳がん (BC) 細胞の脳転移能を増強する分子および細胞メカニズムを解明することである。特に、インテグリンβ3 (ITGB3) およびITGB3含有細胞外小胞 (EVs) が血液脳関門 (BBB) 透過性亢進および脳内コロニー形成に果たす役割を明らかにすることを目指した。具体的には、HIF-1によるITGB3発現の誘導、ITGB3のEVsへの取り込み、ITGB3+EVsと脳内皮細胞との相互作用、およびその結果としてのBBB透過性亢進とBC細胞の経内皮細胞移動促進のメカニズムを詳細に解析する。これらの知見を通じて、BC脳転移の新たな治療標的を同定し、臨床応用への可能性を探る。
結果
HIF標的遺伝子としてのITGB3の同定: MDA231-BrM2細胞において、RNA-Seq解析により2,234個のHIF依存的低酸素誘導RNAが同定された。ChIP-Seq解析では1,474個のHIF-1α結合部位が特定された。これらのデータと、親株MDA231と比較してMDA231-BrM2で過剰発現する1,957個の遺伝子を統合した結果、44個の遺伝子が3つの基準全てを満たした (Figure 1E, F, Table 1)。この中で、インテグリンβ3 (ITGB3) は、先行研究でEVsを介した肺転移 (α6β4/α6β1) や肝転移 (αvβ5) の臓器指向性に関与するインテグリンが報告されていたことから、脳転移の候補として注目された。ChIP-Seqデータ解析により、ヒトITGB3遺伝子の転写開始点から24 kb上流にHIF-1α結合ピークが同定され、この部位にはHIF-1結合コンセンサス配列5’-(A/G)CGTG-3’が3箇所クラスター化していた (Figure 2I)。ChIP-qPCRにより、低酸素条件下でHIF-1αおよびHIF-1βがこのITGB3 -24 kb部位に有意に結合濃縮されることが確認されたが、HIF-2αの結合は認められず、ITGB3がHIF-1の直接的な標的遺伝子であることが示された (Figure 2J, p<0.0001)。
ITGB3発現の低酸素・HIF-1依存的制御: 4T1-BR5およびMDA231-BrM2細胞を1% O2で24〜48時間処理すると、ITGB3 mRNAおよびタンパク質レベルが大幅に上昇した (Figure 2A, B, p<0.0001)。HIF-1αのノックダウン (shHIF1A) は、この低酸素誘導性のITGB3発現上昇を抑制したが、HIF-2αのノックダウン (shHIF2A) では抑制されなかった (Figure 2C-F, p<0.0001)。フローサイトメトリー解析により、低酸素は細胞表面のITGB3タンパク質発現も増加させることが示された (Figure 2G, H, p<0.0001)。ITGB3 mRNAおよびタンパク質の発現は、親株4T1と比較して脳転移高能サブクローン4T1-BR5で顕著に高く、脳転移能との相関が示唆された (Figure 2A, B)。さらに、ITGB3発現は再酸素化後24〜48時間は高レベルで維持され、96時間かけて緩やかに減衰する「低酸素メモリー」現象が観察された (Supplemental Figure 4A)。
ITGB3依存的な遊走・浸潤および脳コロニー形成: Boyden chamber assayを用いた遊走・浸潤能の評価では、shITGB3、shITGAV、またはshHIF1AのいずれかのshRNAによるノックダウンが、低酸素誘導性の4T1-BR5およびMDA231-BrM2細胞の遊走・浸潤を有意に抑制した (Figure 3E-H, Supplemental Figure 2E-H, p<0.0001)。HIF阻害剤digoxin (200 nM) およびαvβ3阻害剤cilengitide (5 μM) による薬理学的阻害も同様に、低酸素誘導性の遊走・浸潤を顕著に減少させた (Figure 4B-E, p<0.0001)。ITGB3の過剰発現は、常酸素条件下でも細胞の遊走・浸潤を促進し、ITGB3がこれらの機能に必要かつ十分であることを示した (Supplemental Figure 3B-E)。in vivoのLV注入モデルでは、低酸素前処理 (1% O2 48時間) により4T1-BR5細胞の脳コロニー面積が有意に増加した (Figure 5A, B, p<0.01)。shHIF1AまたはshITGB3によるノックダウンは、4T1-BR5 (n=5 mice, 14日後) およびMDA231-BrM2 (n=8 mice, 40日後) のいずれのモデルにおいても脳転移を顕著に減少させた (Figure 5C-F, p<0.0001)。例えば、HIF-1αノックダウンにより4T1-BR5細胞の脳転移面積はコントロールと比較して約60%減少した。
ITGB3のEVsへの選択的輸出と低酸素による増強: MDA231-BrM2および4T1-BR5細胞は、1% O2条件下でEVs産生量が増加したが、EVsのサイズ分布 (50-150 nm) は変化しなかった (Figure 6A, B, Supplemental Figure 5A, B)。EVsは、EVマーカーであるCD9、CD63、CD81、TSG101が豊富に存在し、ER由来のコンタミネーションマーカーであるカルネキシンは含まれていなかった (Figure 6D)。ITGAVのノックダウンはEVs中のITGB3取り込みを減少させ、ITGB3のノックダウンはEVs中のITGAV取り込みを減少させたことから、両者がαvβ3ヘテロ二量体として機能することが示唆された (Supplemental Figure 5G)。NFCM解析により、低酸素はEVs表面のITGB3保持率をMDA231-BrM2で25.8%から43.4%へ、4T1-BR5で13.8%から18.6%へ増加させた (Figure 6E, Supplemental Figure 5H)。一方、肺転移特異的インテグリンであるITGB4のEVs表面保持率には低酸素による変化は認められず、低酸素誘導性のITGB3が脳指向性EVsの表面に選択的に発現することが示された (Figure 6F)。
ITGB3+EVsの脳内皮細胞結合・脳滞留: PalmGRET標識EVsを用いたフローサイトメトリー解析では、低酸素NTC由来EVsはhCMEC/D3およびHBEC-5i脳内皮細胞への結合が有意に増加した (Figure 7A, B, Supplemental Figure 6A, B, p<0.0001)。一方、shHIF1AまたはshITGB3由来EVsでは、脳内皮細胞への結合が有意に減少した (Figure 7A, B, p<0.0001)。LV注入4時間後の脳内EVs滞留を蛍光顕微鏡およびナノルシフェラーゼアッセイで評価したところ、低酸素NTC由来EVsが有意に高い滞留を示し、shHIF1AまたはshITGB3由来EVsでは滞留が減少した (Figure 7C-H, p<0.001)。これらの結果は、低酸素がHIF-1依存的にITGB3発現をEVsに誘導し、それが循環EVsの脳内滞留増加に必要であることを示している。
BBB透過性亢進とBC細胞transmigration促進: hCMEC/D3単層をITGB3+EVsで前処理すると、GFP発現MDA231-BrM2細胞との接着が有意に増加した (Figure 8B, C, p<0.05)。FITC-dextran漏出アッセイで評価したBBB透過性は、shNTC低酸素由来EVsで前処理した内皮単層で最大となり、shHIF1AまたはshITGB3由来EVsではこの効果が消失した (Figure 8F, p<0.0001)。EVsはVEGFA誘導性のVEGFR2リン酸化を増強し、この効果は低酸素由来EVsで最大となり、shHIF1AまたはshITGB3由来EVsでは減弱した (Figure 9A, B)。ITGB3過剰発現細胞由来EVsは内皮透過性の上昇を再現し、VEGFR2阻害剤sunitinib (5 μM) によりこの透過性亢進が抑制された (Figure 9C, D, p<0.0001)。ITGB3+EVsで前処理した内皮単層を介したBC細胞のtransmigrationも増強され、shHIF1AまたはshITGB3由来EVsでは効果が消失した (Figure 9E, F, p<0.001)。
考察/結論
本研究は、低酸素誘導性因子HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1) が乳がん (BC) 細胞のインテグリンβ3 (ITGB3) 発現を直接的に誘導し、ITGB3含有細胞外小胞 (EVs) の産生を促進することで、脳転移を増強する新規メカニズムを明らかにした。この発見は、腫瘍由来EVs表面のインテグリンが臓器指向性を規定するという先行研究の概念を拡張し、脳転移における特異的インテグリンとしてITGB3、およびその上流制御因子としてHIF-1を初めて同定した点で新規性がある。Hoshino et al. Nature 2015は、α6β4/α6β1が肺転移、αvβ5が肝転移を促進することを示したが、本研究は「αvβ3-脳」という新たなパラダイムを確立した点で、これまでの報告とは異なる。
本研究で示されたメカニズムは以下の通りである。第一に、腫瘍内低酸素環境がHIF-1を活性化し、ITGB3遺伝子の転写を直接的に誘導する。第二に、HIF-1依存的に発現したITGB3は、ITGAVとヘテロ二量体 (αvβ3) を形成し、EVsに選択的にパッケージ化される。第三に、これらのITGB3+EVsが循環中に脳内皮細胞に結合し、VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2) シグナル伝達を亢進させることで血液脳関門 (BBB) の透過性を上昇させる。第四に、BBB透過性の亢進がBC細胞の経内皮細胞移動 (transendothelial migration) を促進し、最終的に脳内コロニー形成を誘導する。特に、再酸素化後も24〜48時間にわたりITGB3発現が維持される「hypoxic memory」現象は、循環中のBC細胞が脳指向性を保持するメカニズムを説明する上で重要である。この知見は、Bos et al. Nature 2009が報告した脳転移関連遺伝子の同定をさらに深化させるものである。
本研究の成果は、BC脳転移の予防および治療戦略の開発に臨床応用される可能性を秘めている。HIF阻害剤 (digoxin) やαvβ3阻害剤 (cilengitide)、VEGFR2阻害剤 (sunitinib) の単独または併用による治療が、脳転移の進行を抑制する新たなアプローチとなり得る。特に、sunitinibがITGB3+EVsによる内皮透過性亢進を抑制することが示されたことは、既存薬の新たな適用可能性を示唆する。また、EVs中のITGB3は、血中バイオマーカーとして脳転移リスクの層別化や治療効果のモニタリングに利用できる可能性がある。Hoshino et al. Cell 2020やWortzel et al. DevCell 2019が示したEVsのバイオマーカーとしての有用性を裏付けるものである。
残された課題として、本研究では免疫不全マウスモデルと免疫能を有する同系マウスモデルを用いて短期的な脳内コロニー形成を評価したが、長期的な巨大転移巣形成や全身性転移への影響、および他の脳転移高頻度がん種 (肺がん、黒色腫など) への一般化可能性については今後の検討が必要である。また、ヒト乳がん患者の血中EVsにおけるITGB3定量と臨床転帰との相関検証も重要な課題である。さらに、in vivoでのEVsの脳内皮細胞への取り込みメカニズムや、EVsが血管透過性亢進を引き起こす直接的なメカニズム (細胞外相互作用か細胞内シグナルか) についても、さらなる研究が求められる。Rodrigues et al. NatCellBiol 2019が報告したように、腫瘍由来EVsは脳転移において複雑な役割を果たすため、HIF-1→ITGB3→EVs→VEGFR2→BBB透過性という軸を標的とした治療戦略の開発が期待される。
方法
ヒトTNBC細胞株MDA-MB-231の脳転移高能サブクローンMDA231-BrM2とマウスTNBC 4T1および脳転移高能サブクローン4T1-BR5を使用し、実験を行った。細胞はDMEM培地で培養し、1% O2の低酸素条件下で処理した。HIF標的遺伝子を同定するため、20% O2と1% O2条件下でのRNA-SeqおよびHIF-1α抗体を用いたChIP-Seqを実施した。HIF-1α、HIF-2α、ITGB3、ITGAVの各遺伝子を標的とするshRNAを安定的に導入したノックダウン株を作製し、遺伝子発現への影響を評価した。薬理学的阻害剤として、HIF阻害剤であるdigoxin (100-200 nM)、αvβ3阻害RGDペプチドであるcilengitide (5 μM)、およびVEGFR2阻害剤であるsunitinib (5 μM) を使用した。
細胞の遊走・浸潤能はBoyden chamber assayを用いて評価した。遊走能は非コーティング膜、浸潤能はMatrigelコーティング膜を用いて測定した。in vivo脳転移モデルは、同系BALB/cマウス (n=5-8 mice) に4T1-BR5細胞を、免疫不全ヌードマウス (n=8 mice) にMDA231-BrM2細胞を左心室 (LV) 内注入することで構築した。脳は14日後 (4T1-BR5) または40日後 (MDA231-BrM2) に採取し、H&E染色による組織学的解析で転移巣面積を定量した。
細胞外小胞 (EVs) は、細胞培養上清から超遠心分離法 (ultracentrifugation) により単離した。EVsの数とサイズ分布は、ナノフローサイトメトリー (NFCM) およびナノ粒子トラッキング解析 (NTA) で特性評価した。透過型電子顕微鏡 (TEM) によりEVsの形態を確認した。EVsの細胞内膜を特異的に標識するため、パルミトイル化EGFP-ナノルシフェラーゼ (PalmGRET) レポータータンパク質を発現するMDA231-BrM2サブクローンを作製した。PalmGRET標識EVsを用いて、脳内皮細胞 (hCMEC/D3およびHBEC-5i) への結合をフローサイトメトリーで評価した。LV注入後の脳内EVs滞留は、蛍光顕微鏡およびナノルシフェラーゼアッセイで測定した。
血液脳関門 (BBB) 機能の評価には、hCMEC/D3単層を用いたFITC-dextran透過性アッセイを実施した。EVsによるVEGFR2シグナル伝達への影響は、VEGFA刺激後のVEGFR2リン酸化レベルをウェスタンブロットで解析することで評価した。BC細胞の経内皮細胞移動 (transmigration) は、EVsで前処理した内皮単層を介したBoyden chamber assayで測定した。統計解析には、Student’s t検定またはANOVAを用い、p値が0.05未満を有意とした。