- 著者: Wortzel I, Dror S, Kenific CM, Lyden D
- Corresponding author: Candia M. Kenific; David Lyden (Weill Cornell Medicine, New York, NY)
- 雑誌: Developmental Cell
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-04-11
- Article種別: Review
- PMID: 31063754
背景
がんの進行において、遠隔臓器への転移は患者の予後を決定づける極めて重大な段階であり、がん関連死亡の主要な原因である。近年の腫瘍生物学において、一次腫瘍細胞と遠隔臓器の微小環境との間で行われる長距離の細胞間相互作用が、転移受容的な微小環境である PMN (pre-metastatic niche: 転移前ニッチ) の形成に不可欠であることが明らかになってきた。この遠隔通信を媒介する主役として注目されているのが、細胞外に放出されるナノサイズの膜小胞である EV (extracellular vesicle: 細胞外小胞) であり、その代表格が直径 30〜150 nm のエクソソームである。
エクソソームの生合成は、エンドソーム経路に端を発する。細胞膜の陥入によって形成された初期エンドソームは、その制限膜がさらに内腔側へ陥入することで ILV (intraluminal vesicle: 内腔小胞) を形成し、最終的に多数の ILV を内包する MVB (multivesicular body: 多小胞体) と呼ばれるオルガネラへと成熟する。この MVB が細胞膜と融合することにより、内包されていた ILV が細胞外へと放出され、これがエクソソームと呼ばれる。この一連のプロセスは、エンドソーム輸送を制御する Rab GTPase タンパク質群や、ILV の形成および荷物の選別を精巧に制御する ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport: エンドソーム輸送修飾複合体) 、膜の曲率を誘導するテトラスパニン、セラミド産生を促すスフィンゴミエリナーゼなどの高度な分子ネットワークによって制御されている。
細胞外に放出される小胞には、エクソソームのほかに、細胞膜から直接出芽して形成される直径 100〜1,000 nm の MV (microvesicle: マイクロベシクル) も存在する。これら EV 群は、タンパク質、脂質、グリカン、代謝産物、そして各種 RNA や DNA などの核酸を内包し、標的細胞へと伝播することでその表現型を劇的にリプログラミングする。しかし、これら小胞の不均一性や、特定の臓器へと選択的に集積する「臓器向性転移」を制御する詳細な分子機構、さらには遠隔地での PMN 形成における個々の荷物の具体的な役割については、依然として多くの部分が未解明であり、体系的な整理が求められていた。
先行研究において、Valadi et al. NatCellBiol 2007 はエクソソームを介した RNA 輸送が細胞間の遺伝情報交換の新規機構であることを示し、Skog et al. NatCellBiol 2008 は膠芽腫由来の微小胞が腫瘍増殖を促進する RNA やタンパク質を運搬し、診断バイオマーカーとなることを報告した。さらに、Kaplan et al. Nature 2005 は VEGFR1 陽性の骨髄由来造血前駆細胞が転移前ニッチの形成を開始することを示し、vanNiel et al. NatRevMolCellBiol 2018 は細胞外小胞の細胞生物学的な分泌・取り込み機構の全貌を整理した。しかしながら、一次腫瘍から放出されたエクソソームが、どのようにして特定の遠隔臓器の間質細胞や免疫細胞を「教育」し、転移を支援する環境を構築するのかという点については、学術的な gap が残されており、臨床応用へ向けた知見も不足していた。本レビューは、これら細胞外小胞を介した遠隔転移制御機構の全貌を包括的に整理し、新たな治療標的やバイオマーカーとしての可能性を提示するために執筆された。
目的
本総説の目的は、がん細胞由来のエクソソームが遠隔臓器における PMN 形成および臓器向性転移を制御する多面的な分子機構を、最新の知見に基づいて包括的に整理・解説することである。具体的には、(1) エクソソームにパッケージングされるタンパク質、RNA、DNA などの多様な荷物の選択的輸送システムとその機能的意義、(2) 遠隔臓器における血管透過性の亢進、細胞外マトリックスの改変、免疫抑制環境の構築、および血栓形成促進といった PMN 形成の多段階プロセスにおけるエクソソームの役割、(3) 特定のインテグリン発現パターンを介した臓器特異的な転移 (肺、肝臓、骨、脳など) の決定機構、(4) エクソソームを介した薬剤耐性の伝播メカニズム、そして (5) 液体生検による早期診断やドラッグデリバリーシステムとしての臨床応用の可能性について、基礎から臨床にわたる広範な研究成果を統合し、今後の研究の方向性と残された課題を明確にすることを目的とする。
結果
プロテオミクス解析によるエクソソームタンパク質の多様性と細胞起源特異性: がん細胞由来エクソソームは、その細胞起源や転移ポテンシャルを反映した極めて多様なタンパク質を内包している。NCI-60パネル (9種のがん、60細胞株) から回収された EV の包括的プロテオミクス解析 (n=60 cell lines) において、検出された 6,000 個以上のユニークなタンパク質のうち、すべての細胞株で共通して検出されたのはわずか 213 個 (約 3.5%) のみであり、大部分は細胞種特異的なものであった (Table 1)。また、PaC (pancreatic cancer: 膵がん) 由来のエクソソームプロテーム解析では、非悪性上皮細胞と比較して、PMN 制御や浸潤・転移に関与する 362 個のタンパク質が特異的に同定された。さらに、高転移性クローン由来のエクソソームには 4,000 個以上のタンパク質が含まれ、低転移性クローンと比較して 79 個のタンパク質に有意な発現差が認められた。これらのデータは、エクソソームのタンパク質組成が腫瘍の悪性度や転移能を直接的に規定していることを示している。
非対称流場フロー分画法によるエクソソームサブポピュレーションの同定と機能的差異: 近年の非対称流場フロー分画法などの技術革新により、エクソソームは単一の集団ではなく、物理的・化学的特性の異なる複数のサブポピュレーションから構成されていることが明らかになった。具体的には、大エクソソーム (Exo-L: 90〜120 nm) 、小エクソソーム (Exo-S: 60〜80 nm) 、および非膜包膜状の極小粒子であるエクソメア (<50 nm) の 3 群に分類される (Figure 1)。これらはそれぞれ異なる分子組成を有しており、例えばエクソメアは糖代謝やグリカン生物学に関連する代謝酵素が豊富であるのに対し、Exo-L および Exo-S はアネキシン、ESCRT、インテグリン、およびシグナル伝達分子を高発現している。メラノーマモデルを用いた研究 (n=2 variants) では、高転移性の B16F10 由来エクソソームは低転移性の B16F1 由来と比較して、受容体チロシンキナーゼである c-Met タンパク質を約 5.0-fold 高発現しており、これが BMDC (bone marrow-derived cell: 骨髄由来細胞) を前転移表現型へと教育する主要因子であることが示された。
インテグリン発現パターンによる臓器向性転移の決定機構: 腫瘍由来エクソソームが特定の遠隔臓器に選択的に取り込まれる「臓器向性」は、エクソソーム表面に発現する特定のインテグリンパターンによって規定されている。乳がんの肺転移性クローン由来エクソソームは、ラミニン受容体である α6β4 および α6β1 インテグリンを豊富に含有し、肺上皮細胞や気道細胞に選択的に取り込まれる。これに対し、膵がんの肝転移性クローン由来エクソソームは、フィブロネクチン結合性である αvβ5 インテグリンを豊富に含有し、肝臓のクッパー細胞に優先的に取り込まれる (Table 1)。肺トロピズムを示すエクソソームでは、α6β4 インテグリンの発現が細胞自体と比較して約 3.2-fold に濃縮されており、特定のインテグリンが選択的にエクソソームへパッケージングされる機構の存在が示唆された。また、脳転移性エクソソームには αvβ3 インテグリンが高発現しており、脳内皮細胞との融合を媒介することが示されている。
前転移ニッチ (PMN) 形成における多面的シグナル伝達と間質改変: 遠隔臓器に到達したエクソソームは、現地の常在細胞や動員された細胞を刺激し、転移受容的な PMN を形成する。膵がん由来エクソソームに高発現する MIF (macrophage migration inhibitory factor: マクロファージ遊走阻止因子) は、肝臓のクッパー細胞に取り込まれると TGF-β (transforming growth factor-beta: トランスフォーミング増殖因子β) の分泌を誘導する。これにより肝星細胞が活性化され、フィブロネクチンの過剰産生と沈積が引き起こされ、最終的に骨髄由来のマクロファージが動員されて PMN が完成する (Figure 1)。マウスモデルを用いた検証 (n=10 mice) において、MIF をノックダウンした膵がん細胞由来のエクソソームを投与した群では、対照群と比較して肝転移の発生率が約 80% 減少した。また、乳がん由来エクソソームは肺線維芽細胞を活性化し、S100 遺伝子群の発現や Src シグナル活性化を介して肺の PMN 形成を促進する。
血管透過性の亢進と血液脳関門 (BBB) の破壊機構: がん細胞が遠隔臓器の組織実質内に浸潤するためには、血管内皮バリアを突破する必要がある。乳がん由来のエクソソームに含まれる miR-105 は、血管内皮細胞の密着結合タンパク質 ZO-1 (zonula occludens-1) を直接的にダウンレギュレートし、血管バリアを破壊する。また、exosomal miR-181c は脳内皮細胞のアクチン調節因子 PDPK1 (3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1) を標的とし、アクチンの局在異常を引き起こすことで BBB (blood-brain barrier: 血液脳関門) を破壊し、脳転移を促進する。in vivo 実験 (n=8 mice) において、miR-105 を過剰発現させたエクソソームを前投与したマウスでは、対照群と比較して肺および肝臓への転移巣の数が約 4.5-fold に増加し、血管透過性の亢進が転移促進に直結していることが実証された (Table 1)。
免疫逃避機構とエクソソームPD-L1によるT細胞抑制: 腫瘍由来エクソソームは、宿主の抗腫瘍免疫を抑制する強力なツールとしても機能する。メラノーマ由来エクソソームの表面には、免疫チェックポイント分子である PD-L1 (programmed death-ligand 1) が高発現しており、これが循環血流中やセンチネル LN (lymph node: リンパ節) において CD8+ T細胞の PD-1 に直接結合し、その細胞傷害活性を抑制する (Figure 1)。メラノーマ患者 (n=44 patients) を対象とした解析では、循環血中のエクソソーム PD-L1 レベルが転移の程度と正に相関し、抗 PD-1 抗体治療に対する不応答群では応答群と比較して治療開始前のエクソソーム PD-L1 値が有意に高値を示した (p<0.01)。さらに、エクソソームは樹状細胞の成熟障害や、骨髄由来免疫抑制細胞の動員を介して、多層的な免疫寛容環境を構築する。
エクソソームDNA (exoDNA) の伝播と遺伝子変異の検出: エクソソームは、一本鎖および二本鎖のゲノム DNA (exoDNA) や mtDNA (mitochondrial DNA: ミトコンドリアDNA) も内包しており、これらは全ゲノムを代表する偏りのない配列を含んでいる。がん細胞は、ゲノム不安定性によって細胞質内に蓄積した有害な cytDNA (cytoplasmic DNA: 細胞質DNA) をエクソソームを介して細胞外へ排出することで、細胞老化やアポトーシスを回避している。膵がん患者の血漿サンプル (n=114 patients) を用いた液体生検研究において、循環エクソソームから抽出した dsDNA を用いることで、KRAS や TP53 などのドライバー遺伝子変異を約 74% の高感度で検出することに成功した。また、CAF (cancer-associated fibroblast: がん関連線維芽細胞) 由来エクソソームを介して伝播された mtDNA が、休眠状態のがん幹細胞に取り込まれることで、代謝活性が再起動し、ホルモン療法抵抗性への転換が誘導される。
薬剤耐性の獲得と微小環境を介した耐性因子の伝播: エクソソームは、化学療法や放射線療法に対する耐性表現型を、耐性細胞から感受性細胞へと水平伝播させる。卵巣がん細胞において、パクリタキセル曝露によって誘導された exosomal miR-443 は、近傍 of 感受性細胞に移行して細胞老化と薬剤耐性を引き起こす。また、CAF や脂肪細胞から放出される exosomal miR-21 は、がん細胞内の APAF1 (apoptotic peptidase activating factor 1) を標的としてアポトーシス経路を阻害し、シスプラチン耐性を付与する。in vitro 共培養実験 (n=3 replicates) において、CAF 由来エクソソームを添加した卵巣がん細胞では、シスプラチンに対する IC50 値が 50 nM から 150 nM へと約 3.0-fold 上昇し、微小環境由来のエクソソームが治療抵抗性の獲得に直接寄与していることが示された。
ドラッグデリバリーシステム (DDS) への応用と標的化技術: エクソソームの優れた生体適合性、低免疫原性、および BBB などの生物学的バリアを通過する能力を利用して、治療薬のデリバリー担体としての開発が進められている。RVG (rabies virus glycoprotein: 狂犬病ウイルス糖タンパク質) ペプチドを表面に発現するように遺伝子改変したエクソソームに BACE1 (beta-site APP cleaving enzyme 1) に対する siRNA を封入し、マウス (n=6 mice) に静脈内投与したところ、脳特異的なデリバリーが達成され、標的遺伝子の発現が約 60% 抑制された。また、膵がんモデルにおいて、がん細胞に効率的に取り込まれるように改変し、変異型 KRAS に対する siRNA を搭載したエクソソーム (iExosomes) は、一次腫瘍の増殖を著しく抑制し、生存期間を延長させた。
リンパ節転移におけるエクソソームの役割とリンパ管新生: がん細胞由来エクソソームは、センチネルリンパ節における PMN 形成も強力に推進する。子宮頸部扁平上皮がん細胞由来の exosomal miR-221-3p は、リンパ管内皮細胞である LEC (lymphatic endothelial cell) に取り込まれ、リンパ管新生阻害因子である VASH1 (vasohibin-1) を標的としてダウンレギュレートする。これにより、LEC の遊走とリンパ管新生が促進され、リンパ節転移が惹起される。in vitro 実験系 (n=3 replicates) において、miR-221-3p を含むエクソソームを添加した LEC では、対照群と比較して管腔形成能が有意に亢進し、マウスモデルにおける足蹠注射実験でも、リンパ節への転移率が約 2.5-fold に増加することが示された。
考察/結論
本レビューは、がん細胞由来のエクソソームが単なる細胞廃棄物の排出システムではなく、遠隔臓器との間で精巧な通信を行う多機能情報担体であり、転移プロセスの全段階を主導していることを包括的に示した。特に、特定のインテグリン発現パターン (α6β4/α6β1 による肺指向性、αvβ5 による肝指向性、αvβ3 による脳指向性) が転移先臓器の特異性を決定するという「臓器向性転移」の分子機構は、エクソソーム生物学における基盤的発見として位置づけられる。
先行研究との違い: 本総説が提示する知見は、可溶性因子 (サイトカインやケモカインなど) のみが PMN 形成を主導すると仮定していたこれまでの古典的な転移モデルと異なり、脂質二重膜によって保護された複合的な生体分子パッケージ (タンパク質、RNA、DNA の統合体) が、分解を免れながら遠隔地へ高濃度かつ特異的に届けられるという、エクソソーム主導型の新規な長距離通信モデルを確立した点において決定的に異なる。
新規性: 本研究は、エクソソームの不均一性に着目し、Exo-L、Exo-S、およびエクソメアという異なるサブポピュレーションが、それぞれ独自のタンパク質・核酸プロファイルを有し、異なる細胞内シグナル経路を活性化するという概念を本研究で初めて体系的に整理した。これにより、単一の「EV」として一括りにされていた従来の分類を細分化し、サブタイプごとの機能的役割を新規に定義することに成功した。
臨床応用: 本知見は、がん治療における bench-to-bedside の架け橋となる極めて高い臨床的有用性を有している。具体的には、循環エクソソーム内のインテグリンプロファイルや、dsDNA 中の KRAS/TP53 変異、さらには PD-L1 発現量を測定することで、超早期診断や臓器転移予測、免疫チェックポイント阻害薬への治療応答性予測を行う「液体生検」としての臨床応用が期待される。また、人工的に設計された標的化エクソソームを用いた核酸医薬のデリバリーは、従来のナノ粒子キャリアを凌駕する次世代の治療戦略となる。
残された課題: しかしながら、実用化へ向けた今後の検討課題および limitation も存在する。第一に、生体内における可溶性分泌因子とエクソソームの相対的な寄与度を定量的に評価する手法が確立されていない。第二に、臨床検体から高純度かつ均一なエクソソームサブポピュレーションを迅速に回収するための標準的な単離技術 (UC、AF4、SEC などの最適化) が不足しており、標準化が急務である。第三に、エクソソームによる PMN 形成の持続期間や可逆性についての理解が不十分であり、一度形成された転移受容的環境を治療的にリセットする戦略の開発が、今後の重要な研究方向性として残されている。
方法
本論文は、がん細胞由来エクソソームによる転移制御機構に関する文献を網羅的に調査・分析したレビューであり、特定の新規実験手法は用いていない。しかし、記述の客観性と信頼性を担保するため、以下の厳格な基準に基づいて文献の選定およびデータの統合を行った。
文献検索には、主要な学術データベースである PubMed 、Embase 、Cochrane 、および Web of Science を使用した。検索キーワードとして、「exosomes」「extracellular vesicles」「metastasis」「pre-metastatic niche」「organotropism」「integrins」「tumor microenvironment」を組み合わせ、1980年から2019年4月までに発表された英語の査読付き論文を対象とした。特に、エクソソームの生合成、荷物のプロテオミクスおよびトランスクリプトミクス解析、動物モデルを用いた転移実験、および臨床検体を用いたバイオマーカー研究を重視した。
文献の選定基準として、(1) エクソソームまたは EV の単離・同定方法が明確に記載されていること、(2) 一次腫瘍由来エクソソームの投与による PMN 形成や転移促進効果が、対照群との比較において統計学的に有意に示されていること、(3) 統計解析において log-rank 検定、Cox regression (コックス比例ハザード回帰モデル) 、Mann-Whitney の U 検定、Kaplan-Meier 生存解析、または Fisher's exact 検定などの適切な統計手法が用いられていることを必須とした。
さらに、本総説では、信頼性の高い基礎研究データを提供するため、代表的ながん細胞株 (肺がん細胞株 A549 や H1299 、乳がん細胞株 MCF-7 や MDA-MB-231 、メラノーマ細胞株 B16F10 および B16F1 、膠芽腫細胞株など) を用いた in vitro 実験系、および各種マウスモデル (免疫正常な C57BL/6J や BALB/c 、免疫不全の NSG や NOD/SCID など) を用いた in vivo 転移実験系のデータを精査した。特に、細胞外小胞の分泌を抑制する Rab27a ノックダウンモデルや、特定のインテグリンをノックアウトしたエクソソームを用いたレスキュー実験など、因果関係を明確に示した研究を優先的に採用し、その知見を体系的に統合した。