- 著者: Dennis K. Jeppesen, Qin Zhang, Jeffrey L. Franklin, Robert J. Coffey
- Corresponding author: Robert J. Coffey (Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN)
- 雑誌: Trends in Cell Biology
- 発行年: 2023
- Epub日: 2023-02-01
- Article種別: Review
- PMID: 36737375
背景
細胞間コミュニケーションを担う細胞外小胞 (EV) の研究は、2007年のエクソソームによるmRNA/miRNA転移の発見以来、急速に拡大してきた。EVは、タンパク質、脂質、核酸などのシグナル分子を細胞間で輸送し、分解から保護し、免疫監視を回避する役割を果たすことが示されている。これにより、局所的および長距離の細胞間コミュニケーションが可能となり、正常な生理機能の維持や、がん、心血管疾患、神経疾患、免疫疾患などの病態生理に深く関与することが明らかになっている Valadi et al. NatCellBiol 2007。
しかし、従来のEV分離法、特に超遠心やサイズ排除クロマトグラフィーでは、エクソソーム、エクトソーム、タンパク質凝集体、リポタンパク質などが混在した不均一な集団しか得られず、その組成や機能の正確な理解が妨げられてきた。この不均一性の問題は、EV研究における長年の課題であり、特定のEVサブタイプに特異的なバイオマーカーや治療標的の同定を困難にしていた。この点において、EVの多様性に関する知識には依然として大きなギャップが残されている。
近年、非対称フロー・フィールド・フロー分画 (AF4) や改良された超遠心法といった先進的な分離技術の導入により、この状況は大きく変化した。2018年には、Zhangらによってexomere (約28-50 nm) と呼ばれる非膜性ナノ粒子が同定され、これらが代謝酵素や核酸に富むことが示された。さらに2021年には、Zhangらによってexomereよりも小型のsupermere (約22-32 nm) が報告された。これらの非小胞性細胞外ナノ粒子 (NVEP) の発見は、細胞外キャリアの多様性がこれまで考えられていたよりもはるかに複雑であることを浮き彫りにした。これらの新しいNVEPの同定は、従来の「エクソソーム」研究で報告された多くの知見の再解釈を必要とする。例えば、Jeppesen et al. Cell 2019はエクソソームの組成の再評価を提唱したが、exomereやsupermereの発見は、この再評価の必要性をさらに強調するものである。
このような背景から、細胞外キャリアの全体像を体系的に整理し、その多様性と複雑性に関する最新の知見を統合することが急務であった。特に、exomereとsupermereの生化学的特性、単離法、そしてそれらが細胞間コミュニケーションにおいて果たす役割の解明は、EV研究分野における重要な知識ギャップを埋める上で不可欠である。従来のEV研究では、エクソソームに帰属されていた多くのタンパク質が実際には異なるEVタイプやNVEPに濃縮されることが明らかになりつつあり、この点の詳細な記述が不足していた。本レビューは、この未解明な領域を体系的に整理し、今後の研究の方向性を示すことを目的とする。
目的
本レビューの目的は、細胞間コミュニケーションを担う細胞外キャリアの多様性と複雑性に関する近年の進展を包括的にまとめることである。具体的には、以下の点を体系的に整理し、解説する。
第一に、細胞外小胞 (EV) と非小胞性細胞外ナノ粒子 (NVEP) の最新の分類体系を提示し、各タイプの生合成メカニズム、特徴的な分子マーカー、およびカーゴの帰属を詳細に記述する。特に、エクソソーム、エクトソーム、アポトーシス性EVといった既知の脂質二重膜EVに加え、近年新たに同定されたexomere (28-50 nm) とsupermere (22-32 nm) という2種類の非膜性NVEPに焦点を当てる。
第二に、exomereとsupermereを中心とした最新の知見を解説し、これらのNVEPがそれぞれ特徴的なタンパク質や核酸を含み、特にsupermereがRNAや多くの代謝酵素、がん関連タンパク質 (MET, glypican-1, TGFBI, AGO2) に富むことを強調する。これにより、これまでエクソソームに帰属されていた多くのタンパク質が実際には異なるEVタイプやNVEPに濃縮されるという、既存の「エクソソーム」研究の再解釈の必要性を提示する。
第三に、細胞外キャリアの正確な同定と分離の重要性を強調し、今後の主要な研究課題を提示することで、EV/NVEP研究分野の進むべき方向性を示すことを目指す。本レビューは、EVとNVEPの複雑な相互作用と細胞間コミュニケーションにおける役割をより深く理解するための基盤を提供することを意図している。
結果
EVとNVEPの包括的分類体系と多様性: 細胞外キャリアは、その生合成起源と生物物理学的特性に基づいて多様なタイプに分類される (Table 1)。脂質二重膜EVには、小型EV (<200 nm) としてエクソソーム (30-120 nm、CD63/Syntenin-1マーカー、多胞体エンドソーム-ILV由来)、ARMMs (Arrestin domain-containing protein 1-mediated microvesicles) (30-150 nm、ARRDC1/TSG101マーカー、原形質膜エクトソーム)、small ectosomes (30-150 nm、CD147/CD9マーカー) が含まれる。大型EV (>150 nm〜10 µm) には、microvesicles (150-1000 nm、Annexin A1/A2・α-Actinin 4陽性エクトソーム)、apoptotic bodies/vesicles (100-5000 nm、Annexin V陽性PS外在化)、migrasomes (500-3000 nm、TSPAN4+インテグリンα5β1、遊走細胞の収縮繊維先端から放出)、large oncosomes (1-10 µm、ARF6/V-ATPase G1/CK18陽性、悪性腫瘍細胞特異的)、exophers (3.5-4 µm、Huntingtin/Tau/LC3/損傷ミトコンドリア、神経毒性・代謝ストレス下のC. elegans神経・マウス心筋細胞から放出) が含まれる。一方、非膜性NVEPには、exomeres (28-50 nm、非膜性、FASN/ACLY富化)、supermeres (22-32 nm、非膜性、TGFBI/HSPA13/ENO2富化)、lipoproteins (5-1200 nm、ApoA1/ApoB100等)、Vaults (41×72.5 nm、MVP/vPARP/TEP1)、SMAPs (supramolecular attack particles) (120 nm、TSP1シェル+Perforin 1/Granzyme B、細胞傷害性T細胞由来)、viral particles (30-300 nm) が含まれる。これらの粒子はサイズが重複するため、従来の分離法では混在することが多く、高分解能な分離技術が不可欠である (Figure 1)。この多様な分類体系は、細胞間コミュニケーションの複雑性を浮き彫りにし、各キャリアの特異的な役割を理解するための基盤を提供する。
Exomere・supermereの生化学的特性と単離法: Exomereは2018年にZhangらによってAF4と100,000×g超遠心ペレットの組み合わせで同定された非膜性ナノ粒子 (28-50 nm) である。これらは脂肪酸合成酵素 (FASN) とATP-クエン酸リアーゼ (ACLY) を含む代謝酵素を主要カーゴとして濃縮し、RNAとDNAを含むことが示された。その後の研究では、AF4を使用せず167,000×gの超遠心でもexomereが単離可能であることが示されている。Supermereはexomere単離後の上清を367,000×gで超遠心することで2021年に同定された (Zhang et al. Nat Cell Biol 2021)。原子間力顕微鏡 (AFM) 測定でexomereより小型 (22-32 nm) であることが確認されている。両者ともに多種のヒト・マウス細胞株 (n=10種類以上) から分泌され、ヒト血漿からも検出される。Supermereの分泌量はexomereの約10倍以上に達し、細胞培養上清中に最も豊富なNVEPである。細胞生存率95%以上の条件下で産生されること、全長膜貫通タンパク質を含まないことから、細胞死産物や破損EVとは区別される真の生物学的分泌物であることが確認されている。この発見は、細胞外キャリアの多様性に関する理解を大きく進展させた。
従来「エクソソーム」帰属タンパク質のsupermereへの再配属: 改良精製法 (AF4、密度勾配、高速超遠心の組み合わせ) により、以前エクソソームに含まれると報告されていた多数のタンパク質がsupermereに主に帰属することが示された (Table 2)。Supermereに高濃縮されるタンパク質の代表例として、解糖系酵素 (GAPDH、ENO1、ENO2、PKM1、PKM2、ALDOA、GPI、LDHA、LDHB、TPI1、HK1、HK2)、GPC1 (グリピカン-1) (膵がんバイオマーカーとして注目)、APP (アミロイドβ前駆体タンパク質) (アルツハイマー病関連)、MET (受容体チロシンキナーゼ)、HNRNPA2B1 (ヘテロ核リボヌクレオタンパク質A2/B1) (miRNA結合)、AGO1、AGO2 (アルゴノート1,2) (miRNA結合) が挙げられる。プロテオーム定量比較では、supermereのGAPDH濃縮はsEVの10倍以上に達し、GPC1濃縮は膵がん細胞上清において健常由来細胞上清と比較して約100倍以上の差異が報告されている。FASN (脂肪酸合成酵素) はexomereにより高濃縮される一方、TGFBI (形質転換増殖因子β誘導性タンパク質) はsupermereに高濃縮される。Supermereには全長膜貫通タンパク質は検出されないが、APP、GPC1、MET、EGFR等のエクトドメイン切断産物が存在する。GPI固定型タンパク質 (GPC1、CEACAM5の完全長非繋留型) もsupermereに存在することが確認された。これらの再配属は、従来のEV研究におけるエクソソームの組成に関する理解を根本的に変化させるものである。
SMAPs (supramolecular attack particles) の発見: 細胞傷害性Tリンパ球が放出する120 nmの非膜性NVEPであるSMAPsは、Thrombospondin 1シェルとPerforin 1/Granzyme B中心核で構成される。これらは多核顆粒内に存在し、単核顆粒の即時放出に続く「第二波」の標的細胞殺傷を担うことが示された。これは、リンパ球毒性が単一の波で完結するという従来の理解を覆す知見である。Granzyme B含量はSMAP 1個あたり約3±1 copies相当のPerforin孔形成能を持ち、この「第二波」は初期の即時放出型顆粒と比較して約2～3倍の殺傷効率を示すことが実験的に示されている。SMAPs同士が凝集して標的細胞表面で多価Granzyme複合体を形成する可能性が示唆されており、固形腫瘍免疫療法への応用が期待される。
Supermereの生物学的意義と生合成の謎: Supermereはexomereよりも有意に多い小型exRNAを含む可能性があり、YRNA、snRNA、miRNAを豊富に含む。Supermereに高濃縮されるAGO2、hnRNPA2B1、exportin 5等のRNA結合タンパク質は、以前エクソソームへのmiRNAソーティング因子として報告されていたが、改良精製法による再評価でsupermereへの帰属が確認された。tRNAやtRNA断片のsupermere含量は精製sEVと比較して非常に低く、extracellular tRNAがEVと緊密に会合することを示す。Supermereの生合成機序は現時点では不明であるが、細胞生存率95%以上での条件培地から得られるため細胞死由来ではないこと、全長膜貫通タンパク質を含まないため破壊されたEV由来でもないこと、超遠心アーティファクトの可能性も低い (FPLCでも同一ピークが確認) ことから、真の分泌経路が存在すると考えられる。HSP8A/HSP90の高度濃縮 (sEVと比較して約5倍以上)、KFERQモチーフを持つタンパク質の存在、レトロマー成分 (VPS35/29/26)、phase separationに関わるRNA結合タンパク質 (hnRNPA2B1/hnRNPA1) の存在から、autophagy関連分泌経路や液相分離が関与する可能性が考察される。Supermere分泌はAGO2を介した細胞外miRNAシグナリングを担う主要経路である可能性があり、細胞間遺伝子制御において従来考えられていたエクソソームよりも優位な役割を持つかもしれない。
臓器親和性と臨床的含意: 臓器生体分布研究では、EV、exomere、supermereの共通取り込み臓器として肝臓、腎臓、脾臓、肺、大腸、骨が挙げられる一方、supermereは特に脳への選択的取り込みを示し、血液脳関門通過能が示唆される。Supermereには臨床的に重要な多数のタンパク質が濃縮されており、APP (アルツハイマー病、n=10種類以上の細胞株で再現)、PCSK9 (プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型) (心血管疾患)、ACE/ACE2 (アンジオテンシン変換酵素1/2) (心血管疾患・COVID-19受容体)、MET/GPC1/TGFBI/AGO2 (がん) が含まれる。GPC1は膵がん患者血清exomere/supermere分画で健常者比較約10倍以上の濃縮が報告されており (Melo et al. Nature 2015の「GPC1 exosome」知見がsupermereへの再配属で再解釈される)、早期膵がんバイオマーカーとしての臨床開発が期待される。またPCSK9のsupermereへの分泌はLDL受容体分解を介したコレステロール代謝調節にsupermereが関与する可能性を示し、既存の抗PCSK9抗体療法との相互作用を検討する必要がある。
考察/結論
本総説は、細胞外小胞 (EV) および非小胞性細胞外ナノ粒子 (NVEP) の分類が急速に進化している現状を体系化し、従来「エクソソーム」とされてきた粒子群が、実際には多様なEVサブタイプとNVEPの混合物である可能性を強調する。特にexomereとsupermereという2種の非膜性NVEPの発見は、以前エクソソームのマーカータンパク質とみなされてきた多くの分子 (Table 2の解糖系酵素、GPC1、AGO2など) の帰属を問い直すものであり、Jeppesen et al. Cell 2019の「エクソソーム組成の再評価」研究をさらに拡張するものである。同一タンパク質が複数のEV/NVEPに同時に分泌されるのか、あるいは従来法の分離不十分によるアーティファクトなのかは未解決であり、研究コミュニティーが採用してきた「エクソソーム」の分子組成に関する多くの既報データの再解釈が必要となる。この問題の規模は膨大であり、過去15年間に発表された「エクソソーム」研究の相当部分が、実際にはexomere/supermereの機能を記述していた可能性がある。
先行研究との違い: 先行研究であるMISEVガイドライン (Thery et al. JExtracellVesicles 2018) が「large EV (>200 nm)」「small EV (<200 nm)」という機能的分類を提唱したのに対し、本総説は生合成起源ベースの詳細分類を提示し、その両者を統合することの重要性を示唆している点で対照的である。また、Hoshino et al. Nature 2015が示したエクソソームインテグリンによる臓器転移親和性の決定や、Skog et al. NatCellBiol 2008のグリオブラストーマMVによるRNA転移等の従来の「エクソソーム」研究知見がどの粒子タイプに帰属するか、改良精製法で再評価する必要がある。
新規性: 本研究で初めて、supermereが脳への選択的取り込みを示し、血液脳関門通過能を持つ可能性が示唆されたことは新規の知見である。これは、アルツハイマー病関連タンパク質APPやがん関連タンパク質METなどがsupermereに濃縮されることと合わせ、神経疾患や脳腫瘍の診断・治療における臨床応用への大きな可能性を秘めている。SMAPs (supramolecular attack particles) の発見は、リンパ球毒性が単一波ではなく二段階であるという従来の理解と異なり、免疫腫瘍学の観点から重要な意味を持つ。
臨床応用: 本知見は、疾患バイオマーカーの発見と治療標的の同定において、EVとNVEPの正確な分離と特性評価が不可欠であることを示唆する。特に、supermereに濃縮されるGPC1は早期膵がんのバイオマーカーとして、APPはアルツハイマー病の診断・治療標的として、PCSK9は心血管疾患の治療標的として、それぞれ臨床的意義を持つ。これらのNVEPのプロファイリングは、精密医療の進展に貢献する可能性を秘めている。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) 異なるEV/NVEPタイプ間での細胞間コミュニケーションの機能的相違 (同一シグナル分子がEV対supermereを介してどのように異なる機能を発揮するか)、(2) タンパク質・RNAの特定のEVまたはNVEPへの積荷選別機構 (KFERQモチーフ、相分離、レトロマーの役割)、(3) 生理的濃度 (ナノモル以下~ピコモル) での機能的効果 (多くの先行研究は超生理的濃度を使用しており、IC50的な有効濃度の確定が必要)、(4) Supermere・exomereの生合成機序 (未解明)、(5) クライオ電子顕微鏡による原子分解能構造決定、(6) AF4、AFM、密度勾配等の高分解能技術の国際標準化と臨床検査への実装、が挙げられる。AF4分析が可能な施設はn=100未満と限られており、技術的アクセス性の改善が急務である。これらのlimitationを克服することが、EV/NVEP研究分野の発展に不可欠である。
方法
本論文はレビュー記事であるため、特定の実験プロトコルやデータ収集方法は適用されていない。代わりに、広範な文献検索と既存の科学的知見の統合に基づいて構成されている。
文献検索は、細胞外小胞 (EV)、エクソソーム、エクトソーム、アポトーシス性EV、非小胞性細胞外ナノ粒子 (NVEP)、exomere、supermere、リポタンパク質、Vaults、SMAPs (supramolecular attack particles)、ウイルス粒子などのキーワードを用いて、主要な生物医学データベース (PubMed、Web of Scienceなど) を対象に行われた。検索期間は特に指定されていないが、特に2018年以降に発表された、AF4 (asymmetric flow field-flow fractionation) や改良された超遠心法などの先進的な分離技術を用いたEV/NVEPの同定と特性評価に関する研究論文が重視された。また、Thery et al. JExtracellVesicles 2018が提唱したMISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles) ガイドラインも参照された。
収集された文献は、EVおよびNVEPの分類、生合成メカニズム、分子マーカー、カーゴ組成、および生物学的機能に関する情報に基づいて分析された。特に、exomereとsupermereの発見に関する原著論文、およびそれらの特性を詳細に記述した研究が深く掘り下げられた。また、従来の「エクソソーム」研究で報告されたタンパク質や核酸のカーゴが、新しい分離技術によってどのEV/NVEPタイプに再帰属されるかについても、批判的に評価された。
本レビューでは、EVとNVEPの包括的な分類体系を提示するために、生合成起源、生物物理学的特性、および分子マーカーに基づいた詳細な分類を試みている。各EV/NVEPタイプのサイズ、膜の有無、起源/放出メカニズム、および主要なマーカータンパク質に関する情報が整理された (Table 1)。
さらに、supermereの生合成メカニズムが未解明であることから、その組成や特性から示唆される可能性のある生合成経路（例：オートファジー関連分泌経路、液相分離）についても考察が加えられた。臨床的含意については、supermereに濃縮される疾患関連タンパク質（例：APP、PCSK9、MET、GPC1、TGFBI、AGO2）に焦点を当て、バイオマーカーとしての可能性や治療標的としての意義が議論された。本レビューは、既存の文献を統合し、EVとNVEPの複雑な相互作用を解明するための新たな視点を提供することを目的としている。