- 著者: Aleix Prat, Alejandro Navarro, Laia Paré, Noemí Reguart, Patricia Galván, Tomás Pascual, Alex Martínez, Paolo Nuciforo, Laura Comerma, Llucia Alos, Nuria Pardo, Susana Cedrés, Cheng Fan, Joel S. Parker, Lydia Gaba, Iván Victoria, Nuria Viñolas, Ana Vivancos, Ana Arance, Enriqueta Felip
- Corresponding author: Aleix Prat (Hospital Clinic de Barcelona; IDIBAPS, Barcelona)
- 雑誌: Cancer Research
- 発行年: 2017
- Epub日: 2017-05-09
- Article種別: Original Article
- PMID: 28487385
背景
抗PD-1抗体による免疫チェックポイント阻害療法は、非小細胞肺癌 (NSCLC)、悪性黒色腫、腎細胞癌など、複数の固形腫瘍において臨床的承認を得て、治療パラダイムを大きく変革した。しかし、その奏効率は癌種を問わず全体として約30%に留まり、大多数の患者が原発性または獲得性の治療抵抗性を示すことが大きな課題となっている。このため、治療効果を正確に予測し、患者選択を最適化するための有効なバイオマーカーの同定が喫緊の課題として浮上している。Pardoll et al. NatRevCancer 2012、Topalian et al. NEnglJMed 2012、Borghaei et al. NEnglJMed 2015、Robert et al. NEnglJMed 2015、Motzer et al. NEnglJMed 2015。
これまで、PD-L1免疫組織化学 (IHC) は肺癌において部分的な予測能を持つことが示されてきたが、その使用には複数の技術的限界が指摘されている。具体的には、使用される抗体やカットオフ値の不統一、腫瘍組織の動的な変化、腫瘍細胞と免疫細胞のどちらを染色対象とするかといった問題が挙げられ、単独のバイオマーカーとしての限界が明らかになっている。これらの課題は、PD-L1 IHCの臨床的有用性を制限し、より包括的で信頼性の高い予測ツールの必要性を示唆している。現在のところ、PD-L1 IHCは唯一の潜在的なバイオマーカーとして残されているが、その固有の限界は依然として未解明な部分が多く、統一されたコンセンサスが不足している。
遺伝子発現プロファイリングは、腫瘍免疫微小環境を多次元的に評価する強力な手段として注目されている。乳癌におけるPAM50 (Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay) などの先行研究は、nCounterプラットフォームがFFPE (ホルマリン固定パラフィン包埋) 組織検体から安定した遺伝子発現データを得られることを示し、その臨床的有用性を確立している。nCounter PanCancer Immune Panelは、730の免疫関連遺伝子と40の内在性コントロール遺伝子を一度に定量化できるため、FFPE組織に適用可能である点が臨床実装の観点から特に重要である。
先行研究では、Hugo et al. Cell 2016 が黒色腫において間葉系および炎症性表現型が抗PD-1耐性と関連すると報告し (693遺伝子、RNA-seq、15例 vs 13例)、またAyers et al. JImmunotherCancer 2015 がIFN-gamma (インターフェロンガンマ) シグネチャーが黒色腫、頭頸部癌、胃癌でペムブロリズマブの効果と相関することを示した。しかし、これらの研究は特定の癌種に焦点を当てたものであり、NSCLC、頭頸部扁平上皮癌 (HNSCC)、黒色腫といった異なる癌種を同一コホートで横断的に解析し、共通の多遺伝子発現プロファイルを評価した研究はこれまで存在しなかった。このような背景から、癌種を超えて抗PD-1治療効果を予測できる普遍的なバイオマーカーの探索が、未開拓な領域として残されている。
目的
本研究の主目的は、非小細胞肺癌 (NSCLC、非扁平上皮および扁平上皮の両方)、頭頸部扁平上皮癌 (HNSCC)、および悪性黒色腫の患者を対象に、抗PD-1治療前（または前治療時）のFFPE腫瘍生検検体を用いて、nCounter PanCancer Immune Panelで定義された免疫関連遺伝子シグネチャーと治療アウトカム（奏効率、非増悪率、無増悪生存期間 (PFS)）との関連を癌種横断的に検討することである。
具体的には、以下の点を明らかにすることを目指す。
- nCounter PanCancer Immune Panelによって測定される730の免疫関連遺伝子および事前定義された15の免疫シグネチャー、さらにunsupervised clusteringによって新規同定された4つのシグネチャーが、抗PD-1治療後の非増悪疾患 (NPD) 達成およびPFSと統計的に有意な関連を示すか。
- これらの免疫遺伝子シグネチャーの予測能が、癌種（NSCLC、HNSCC、黒色腫）、生検タイミング（ベースライン生検 vs アーカイバル生検）、および使用薬剤（ニボルマブ vs ペムブロリズマブ）に依存しない普遍的なものであるか。
- PD1、PD-L1、CD8A、CD4 mRNAの発現レベルの生検内および生検間での再現性を評価し、nCounterプラットフォームの臨床応用における安定性を検証する。
- 腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) およびPD-L1 IHC発現と免疫関連遺伝子発現との相関を解析し、多遺伝子発現プロファイリングが既存のバイオマーカーに付加的な情報を提供するかを検討する。
最終的に、本研究は、既存のバイオマーカーの限界を克服し、抗PD-1治療に対する奏効を予測する、薬剤・生検タイミング・癌種に依存しない堅牢な多遺伝子予測バイオマーカーとしての可能性を評価することを目指す。
結果
全体的な治療アウトカムと患者背景: 本研究では、65例の患者が解析対象となった。患者の内訳は男性50例 (77%)、中央値年齢59歳 (範囲 40-83歳) であった (Table 1)。前治療歴は2ライン以上が80%を占め、多くの患者が重度の前治療を受けていた。全体の奏効率 (CR+PR) は30.8% (CR 5%、PR 26%)、非増悪疾患 (NPD) 率は55.4% (CR+PR+3ヶ月以上のSD)、増悪 (PD) 率は44.6%であった。中央値PFSは3.47ヶ月 (95% CI 2.8-6.87ヶ月) であった。癌種間 (NSCLC/HNSCC/SKCM) で奏効率、NPD率、PFS率に有意な差は観察されず、異なる癌種を統合して解析することの妥当性が裏付けられた (Supplementary Table S2)。
免疫シグネチャーとNPD・PFS予測: 多変量解析（性別、生検タイミング、癌種、使用薬剤で調整）の結果、14の免疫シグネチャー（細胞傷害性細胞、NK細胞、Th1細胞、Cluster 2、CD8 T細胞、Cluster 1、T細胞、Cluster 4、Cluster 3、CD45、活性化CD4、樹状細胞、好中球、Treg）と、PD-L1、PD1、CTLA4遺伝子がNPDと有意に関連することが示された (Fig. 3B)。特に、男性は女性と比較してNPD達成率が高い傾向を示し、オッズ比 (OR) は4.89 (95% CI 1.44-19.76, p=0.015) であった。PFSについては、11のシグネチャー（NK細胞、Cluster 4、CD8 T細胞、Cluster 2、Cluster 1、Th1細胞、T細胞、活性化CD4、細胞傷害性細胞、樹状細胞、Treg）とPD1、PD-L1遺伝子が有意に関連することが判明した (Fig. 4A)。これらの関連性は、癌種 (NSCLC/HNSCC/SKCM)、生検タイミング (ベースライン vs アーカイバル)、および使用薬剤 (ニボルマブ vs ペムブロリズマブ) のいずれにも依存せず、一貫して認められた。性別はPFSと関連する唯一の臨床病理学的変数であり、男性のハザード比 (HR) は0.48 (95% CI 0.25-0.92, p=0.02) であった。
NK細胞シグネチャーの際立った予測的意義: 最も有意な予測因子の一つとしてNK細胞シグネチャーが同定された。NK細胞シグネチャーの低発現群（下位三分位）と高発現群（上位三分位）を比較すると、中央値PFSは低発現群で2.57ヶ月、高発現群で6.87ヶ月と有意な差が認められた (HR 0.39, 95% CI 0.185-0.815, p=0.0147) (Fig. 4B)。12ヶ月時点での無増悪割合は、低発現群で9.1%、高発現群で23.8%であった。24ヶ月時点では、それぞれ9.1%と14.28%であった。NK細胞シグネチャーは、CD8 T細胞シグネチャーおよび細胞傷害性細胞シグネチャーと高い相関（相関係数 >0.77）を示し、NK細胞を含む自然免疫とCD8 T細胞を介した適応免疫の複合的な活性化状態が、抗PD-1治療の奏効に寄与する基盤となる可能性が示唆された (Fig. 2D)。
unsupervised clusteringによる癌種固有の免疫プロファイル: 730の免疫関連遺伝子を用いたunsupervised hierarchical clusteringにより、65検体は2つの主要なグループに分類された (Fig. 1)。非扁平上皮NSCLC検体は全体的に高い免疫遺伝子発現を示す傾向があった一方、扁平上皮NSCLCおよびSKCM検体は低い発現傾向を示した (p<0.001)。この癌種固有の免疫プロファイルは、TCGA (The Cancer Genome Atlas) のRNA-seqデータセット (HNSCC 566例、扁平上皮NSCLC 554例、非扁平上皮NSCLC 576例、SKCM 474例、合計n=2,170) でも同様に確認され、nCounterデータとの一致率は86.2% (56/65) であった (Fig. 2A)。PD-L1遺伝子は黒色腫検体で他の癌種と比較して有意に低発現であった (Fig. 2B)。
nCounterプラットフォームの高い再現性: PD1、PD-L1、CD8A、CD4 mRNAの発現レベルについて、nCounterプラットフォームの高い再現性が確認された。生検内変動（同一生検からの複数回抽出）の標準偏差 (SD) は、PD1で0.136、PD-L1で0.05、CD8Aで0.046、CD4で0.03（0-10スケール）と非常に小さかった。また、生検間変動（同一腫瘍からの異なるコア生検）のSDも、PD1で0.239、PD-L1で0.04、CD8Aで0.12、CD4で0.07と低く、FFPE検体を用いた遺伝子発現測定が臨床実装に十分な安定性を持つことが裏付けられた。
PD-L1 IHCとmRNAの関連: 評価可能な51例の検体において、PD-L1 IHC (Ventana Sp263) とPD-L1 mRNA発現の間に強い正の相関 (相関係数 r=0.90) が認められた (Supplementary Fig. S4)。しかし、CD8AおよびCD4 mRNAとの相関は中程度 (r=0.53およびr=0.42) であり、PD1 mRNAとの相関は弱かった (r=0.25)。また、腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) の割合は、PD1およびCD8A mRNAレベルと中程度の相関 (r=0.54およびr=0.53) を示したが、CD4およびPD-L1 mRNAとの相関は弱かった (r=0.37およびr=0.35) (Supplementary Fig. S3)。これらの結果は、PD-L1 IHCやTIL評価が捉えきれない免疫微小環境の情報を、多遺伝子発現シグネチャーが補完する可能性を示唆している。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究の核心的な発見は、NK細胞、CD8 T細胞、Th1細胞、IFN活性化を含む12以上の免疫シグネチャーが、癌種（NSCLC、HNSCC、黒色腫）、生検タイミング（ベースライン vs アーカイバル）、および使用薬剤（ニボルマブ vs ペムブロリズマブ）のいずれにも依存せず、一貫して非増悪疾患 (NPD) および無増悪生存期間 (PFS) と有意に関連したことである。この結果は、「既存の適応免疫活性化を反映する安定したmRNA発現パターン」が抗PD-1治療効果を予測するという仮説を強力に支持する。この知見は、Ayers et al. JImmunotherCancer 2015 (IFN-gammaシグネチャー、KEYNOTE-001/-012) やFehrenbacherら (T-effector/IFN-gamma、POPLAR試験) のNSCLC固有の知見とも整合する。しかし、Hugo et al. Cell 2016 が黒色腫において間葉系・炎症性表現型が抗PD-1耐性と関連すると報告したが、PD-L1やCD8A/B、IFN-gammaシグネチャーとの関連は認めなかった点とは対照的である。また、Asciertoら (Cancer Immunol Res 2016) は腎細胞癌で代謝関連遺伝子が抗PD-1耐性と関連すると報告し、免疫チェックポイント関連遺伝子との関連は認めなかった。これらの知見との差異は、癌種の違いや解析手法（RNA-seq vs nCounter）の差異によると考えられる。
新規性: 本研究の独自性は主に3点挙げられる。第一に、NK細胞シグネチャーがCD8 T細胞と並んで強力な予測因子として同定された点である。NK細胞は自然免疫の主要なエフェクター細胞であり、本データはNK細胞を含む自然免疫と適応免疫の複合的な活性化状態が、抗PD-1治療効果の鍵となる可能性を新規に示唆する。第二に、NSCLC、HNSCC、黒色腫という異なる腫瘍型を同一コホートで横断的に解析し、共通の免疫予測シグネチャーを同定した多癌種対応設計である。これは、癌種を超えた普遍的なバイオマーカーの探索において重要な一歩となる。第三に、アーカイバル生検（3ヶ月以上前）でもベースライン生検と同等の予測能を示したことであり、これは過去に採取された治療前生検検体の再利用が可能であることを意味し、臨床的に極めて重要な知見である。
臨床応用: nCounterプラットフォームは、単一の標準化されたFFPEベースアッセイとして、PD-L1 IHCを超えた多次元的な免疫状態評価を提供できる可能性を持つ。乳癌におけるPAM50アッセイと同様の臨床実装経路が期待され、治療前の患者選択に貢献しうる。本研究で示された高い生検内および生検間再現性は、nCounterプラットフォームが臨床現場での堅牢なバイオマーカー測定に適していることを裏付ける。これらの免疫関連遺伝子発現プロファイルは、PD-L1 IHCの限界を補完し、より精密な患者層別化を可能にすることで、個別化医療の推進に貢献する臨床的意義を持つ。
残された課題: 本研究にはいくつかのlimitationが存在する。第一に、n=65という探索的規模のレトロスペクティブ研究であり、検証コホートが欠如している点である。したがって、本研究で同定されたバイオマーカーの予測能を確定するためには、大規模な前向きランダム化試験でのバリデーションが今後の課題となる。第二に、解析時点でイベント数不足のため、全生存期間 (OS) の解析が実施されなかった点である。第三に、HNSCCの症例数が5例と少なく、この癌種に特化した強固な結論を導き出すことは困難である。しかし、HNSCC患者における免疫関連遺伝子発現の予測的価値については、既に他の臨床的エビデンスが存在する。第四に、治療中の生検検体（on-treatment samples）を評価しておらず、治療前検体と比較して治療中の免疫プロファイルがより予測的である可能性も指摘されている。最後に、PD-L1 IHC発現と免疫遺伝子発現を比較できた検体は6例と限られていたが、広範なIHC染色パターンをカバーしており、PD-L1 mRNAとの高い相関が観察された。
結論として、本研究は、多遺伝子発現プロファイルが単一バイオマーカーを超えた予測能を持つという方向性を示した先駆的研究として位置づけられる。今後は、腫瘍変異量 (TMB) などのゲノムバイオマーカーとの統合評価や、大規模コホートでの検証が、これらの免疫シグネチャーの臨床的有用性を確立するための重要なステップとなる。
方法
本研究は、バルセロナの2つの医療機関（Vall d’Hebron病院およびHospital Clinic）で実施された複数の臨床試験に参加した進行癌患者65例を対象とした探索的・レトロスペクティブコホート研究である。対象患者の内訳は、非扁平上皮NSCLC 22例、扁平上皮NSCLC 13例、HNSCC 5例、皮膚黒色腫 (SKCM) 25例であった。全患者はニボルマブ (56.9%) またはペムブロリズマブ (43.1%) のいずれかの抗PD-1単剤療法を受けた。患者の約80%が2ライン以上の前治療を受けており、多くが重度の前治療歴を持つ症例であった。黒色腫患者25例中7例 (28%) はイピリムマブによる前治療歴があった。
腫瘍検体は、抗PD-1治療開始前3ヶ月以内に入手された「ベースライン生検」 (n=33、51%)、または3ヶ月以上前に入手された「アーカイバル生検」 (n=32、49%) に分類された。両タイプの生検検体は統合して解析された。FFPE組織スライドは、まずヘマトキシリン・エオシン染色により腫瘍細胞の存在と腫瘍領域を確認した。RNA精製にはRoche High Pure FFPET RNA Isolation Kitを使用し、必要に応じてマクロダイセクションを実施して正常組織の混入を避けた。約50 ng以上の総RNAを用いて、nCounterプラットフォーム (NanoString Technologies) およびPanCancer Immune Profiling Panelにより、730の免疫関連遺伝子と40のハウスキーピング遺伝子の発現を定量化した。データはlog2変換後、nSolver 2.6パッケージを用いてハウスキーピング遺伝子で正規化された。生データはGene Expression Omnibus (GSE93157) に登録されている。
免疫遺伝子シグネチャーとして、事前定義された15のシグネチャー（例: CD8 T細胞、NK細胞、Th1細胞、B細胞、マクロファージ、Treg、樹状細胞、好中球、IFN活性化など）を評価した。これに加え、全免疫関連遺伝子を用いたunsupervised hierarchical clusteringにより、相関係数0.8以上かつ15遺伝子以上を含む4つの新規シグネチャー（Cluster 1-4）を同定した。各シグネチャーのスコアは、構成遺伝子のメディアン発現値として算出された。個別遺伝子（PD1、PD-L1、CTLA4）の発現も評価対象とした。
治療アウトカムは、RECIST 1.1基準の修正版に基づき、完全奏効 (CR)、部分奏効 (PR)、安定 (SD)、増悪 (PD) を定義した。非増悪疾患 (NPD) は、少なくとも3ヶ月以上のCR/PR/SDを達成した症例と定義した。無増悪生存期間 (PFS) は、治療開始日から増悪または最終追跡日までの期間とした。
統計解析には、多変量ロジスティック回帰モデルおよびCox比例ハザードモデルを用いた。これらのモデルでは、性別、生検タイミング、癌種、使用薬剤を共変量として調整した。遺伝子またはシグネチャー発現とCR、OR、NPD率との関連はロジスティック回帰分析で評価し、PFSとの関連はKaplan-Meier曲線とログランク検定、およびCox比例ハザードモデルで解析した。統計的有意性は両側p値0.05未満とした。
nCounterプラットフォームの再現性評価のため、PD1、PD-L1、CD8A、CD4 mRNAの発現について、生検内変動 (intrabiopsy variability) と生検間変動 (interbiopsy variability) を評価した。生検内変動は、35患者の同一生検から平均2.6回のRNA抽出を行い、そのSDを算出した。生検間変動は、5つの独立した腫瘍から採取された計15の異なるコア生検（平均2.5生検/腫瘍）を用いて評価し、SDを算出した。
腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) の割合は、51例のH&E染色スライドを用いて、International TILs Working Group 2014のガイドラインに従って評価した。PD-L1免疫組織化学 (IHC) は、6例のFFPE肺癌検体において、Ventana Sp263 (抗PD-L1抗体クローン) アッセイを用いて腫瘍細胞のPD-L1発現割合を評価した。これらのIHCおよびTILデータとmRNA発現レベルとの相関も解析した。