- 著者: van Rooij N, van Buuren MM, Philips D, Velds A, Toebes M, Heemskerk B, van Dijk LJA, Beber S, Hilkmann J, Goudsmit DW, Haanen JBAG, Schumacher TNM
- Corresponding author: Ton N.M. Schumacher, PhD (Division of Immunology, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, the Netherlands)
- 雑誌: Journal of Clinical Oncology
- 発行年: 2013
- Epub日: 2013-11-10
- Article種別: Case Report (Diagnosis in Oncology Section)
- PMID: 24043743
背景
免疫チェックポイント阻害薬 (immune checkpoint inhibitor, ICI) は T 細胞に発現する抑制受容体 (anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) および anti-programmed cell death protein 1 (PD-1)) を遮断することで抗腫瘍 T 細胞応答を増強する治療戦略である。Anti-CTLA-4 抗体 ipilimumab は Hodi et al. NEnglJMed 2010 による phase 3 試験 (MDX010-20、n=676) で転移性メラノーマに対する OS 改善 (中央 OS 10.1 か月 vs 6.4 か月、HR 0.66、P<.001) を初めて示し、米国 FDA で 2011 年に承認された。同時期に anti-PD-1 (nivolumab、pembrolizumab) や anti-PD-L1 抗体も early-phase trial で encouraging な response rate を示し、ICI 全体が癌免疫療法の中核に押し上げられた。
しかし ICI 治療によって誘導される T 細胞反応性のうち、どの抗原が臨床的退縮の primary driver となるかは長年未解明であった。先行研究では、患者 ipilimumab 治療後の non-mutated tumor-associated self-antigen (gp100、MAGE 等) に対する T 細胞反応性は比較的 modest であった一方、Schreiber group ら動物モデル (Matsushita 2012 Nature) や Rosenberg group の adoptive T-cell therapy study (Robbins 2013) は patient-specific mutated epitope (neoantigen) が T 細胞認識の重要な component である可能性を示唆した。サン曝露メラノーマでは mutation load が特に高く (UV 誘発 C→T/G→A 変異)、neoantigen の存在量が多いことが想定されていたが、ヒト ICI 治療下で「腫瘍 whole-exome 解析から候補 neoantigen を予測し、その中から実際に T 細胞認識を受けているものを同定し、治療後の動態を縦断的に追跡する」という end-to-end pipeline は確立されておらず、ヒトでの cancer exome-guided neoantigen analysis のエビデンスは手薄であった。Predicted neoantigen pool から実際の T-cell reactivity を screening するための high-throughput MHC multimer 法も不足しており、これまで何が足りなかったかを明示する gap として、(a) 腫瘍 WES + HLA prediction によって候補 neoantigen を生成、(b) MHC multimer 並列染色で TIL の neoantigen 特異性を screening、(c) ipilimumab 治療前後で neoantigen-specific T 細胞応答の動態を縦断モニタリング、という 3 段階を統合した human proof-of-concept study が必須であった。本症例報告はこのギャップを直接埋める。
目的
転移性メラノーマで ipilimumab に奏効した 1 症例において、(1) 腫瘍 whole-exome sequencing と HLA-binding 予測から候補 neoantigen pool を生成、(2) 腫瘍浸潤リンパ球 (tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) の neoantigen 特異的 T 細胞反応性を multiplexed MHC multimer staining で同定、(3) ipilimumab 治療前後の末梢血で neoantigen 特異的 T 細胞動態を追跡し、ICI 効果の生物学的メカニズム解明と治療モニタリングの可能性を実証することを目的とする。
結果
臨床経過と治療奏効: 56 歳男性 Stage IV メラノーマで dacarbazine 抵抗性後、ipilimumab 3 mg/kg × 4 サイクル投与 (2010 年 8 月開始)。Grade 1 dermatitis のみで完遂、治療後 CT で 4 病変中の代表病変が 80.39 mm → 64.30 mm、別病変が 40.11 mm → 27.75 mm と縮小、tumor load 約 -25% の marked regression。S100b 腫瘍 marker は治療前 2.5 μg/L 超 → 治療後 0.10 μg/L 未満に正常化 (Fig 1A、1B)。
WES と変異スペクトラム: 腫瘍 vs 健常組織の whole-exome 比較で 1,657 somatic mutations を同定 (FDR 0.07)。内訳: 1,036 single nucleotide variants + 39 nonsense variants + 573 synonymous mutations + 7 frame shift + 2 codon deletion。Mutation 全体の方向性 (C→T/G→A) は UV 誘発 DNA damage signature と consistent (sun-exposed melanoma 典型) (Fig 1C)。
Neoantigen prediction pipeline 出力: RNAseq filtering 後の expressed nonsynonymous mutations を対象に NetChop Cterm3.0 + NetMHC3.2 で予測した結果、9-11 amino acid 長で medium-to-high affinity (各 HLA-A/-B allele 別) の 448 candidate CD8 T-cell epitopes を generate。これら 448 ペプチドを化学合成し、pMHC multimer として並列調製。
Neoantigen-specific T 細胞反応性の同定: Multiplexed MHC multimer staining で TIL を screening したところ、2 つの neoantigen に対する CD8+ T 細胞反応が検出され、独立解析で再現確認 (Fig 2、3A)。ZNF462 minor reactivity: ZNF462 遺伝子変異 epitope に対する CD8+ T 細胞反応は 0.003% of CD8+ cells で minor (pursued しない)。ATR S→L dominant reactivity: ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) 遺伝子の S→L 変異 (HLA-A*03:01 restricted 9-mer epitope KLYEEPL_L_K、変異 position 8) に対する CD8+ T 細胞反応は 3.3% of CD8+ cells と dominant。ATR S→L 変異は腫瘍内で heterozygous (66% of 298 reads、健常組織では 0% of 189 reads) (Fig 3A)。
機能的検証で mutant 特異性確認: Sorted ATR S→L MHC multimer-positive T 細胞を HLA-A*03:01-matched 526 melanoma cell line と coculture。Wild-type ATR peptide 添加は no effect、ATR S→L mutant peptide 添加では substantial に T 細胞認識 (target cell killing + IFN-γ production) 増加。Wild-type peptide-loaded target には反応せず、mutant epitope への strict 特異性が確認された (Fig 3B、3C)。Peptide concentration titration で 10 nM までは反応保持、0.1 nM では反応低下。
縦断モニタリングで治療後 5 倍増加: 末梢血 PBMC の ATR S→L MHC multimer 染色で、-341 日 (治療前 11 か月) から ATR S→L 特異的 CD8+ T 細胞が検出可能で、ipilimumab 開始前は 10 か月間 stable な頻度を維持。Ipilimumab 開始 +33 日 (5 週後) には magnitude が 5 倍に増加 (Fig 3D)。これは ipilimumab 治療が pre-existing neoantigen-specific T 細胞を特異的に expand したことを示し、ICI 効果の生物学的メカニズムを human で初めて直接実証した knowledge。
考察/結論
① 先行研究との違い: 本症例は、cancer exome-guided neoantigen analysis を ICI 治療奏効患者で end-to-end で実施した世界初の human study である。先行する動物モデル (Matsushita 2012 Nature mouse sarcoma WES、Castle 2012 CancerRes mutanome vaccine) や Rosenberg ら TIL-based adoptive cell therapy のneoantigen 同定 (Robbins 2013 NatMed で TIL から mutant antigen を発見) と異なり、本研究は WES → HLA prediction → MHC multimer screening → 縦断モニタリングという 4 段階 pipeline を human ICI 治療 setting で完結させた。これまで Hodi et al. NEnglJMed 2010 が ipilimumab の OS benefit を確立したが、どの T 細胞反応性が奏効と関連するかは black-box であった点と対照的に、本研究は具体的な ATR S→L mutant epitope を identify することで「ipilimumab の effective T-cell response = neoantigen-driven」という仮説に直接エビデンスを与えた。Self-antigen (gp100、MAGE 等) に対する modest な T 細胞反応との相違点として、ATR S→L 反応は 3.3% of CD8+ cells と桁違いに大きな magnitude を示した。
② 新規性: 本研究で初めて、ヒトで (a) 腫瘍 WES から HLA-binding 予測で生成した 448 候補 neoantigen pool 中から MHC multimer 並列染色で実際の T 細胞反応性 neoantigen を同定可能であること、(b) ATR S→L mutant epitope が ipilimumab 奏効患者で dominant T 細胞応答 (3.3% of CD8+) を駆動すること、(c) 末梢血で neoantigen-specific T 細胞を縦断追跡することで治療効果を客観的にモニタリング可能であること、を first to demonstrate した。これまで報告されていない novel な所見として、ipilimumab 治療開始 5 週後に neoantigen-specific T 細胞応答が 5 倍に increase するという strong temporal association は、ipilimumab の作用機序として「pre-existing neoantigen-specific T 細胞の reactivation/expansion」を提唱する直接的根拠となった。これは後の Snyder 2014 NEnglJMed (melanoma neoantigen と ipilimumab response) や Rizvi 2015 Science (NSCLC mutation load と PD-1 blockade response) の先駆的研究として位置付けられる。免疫療法効果メカニズムの理解は Hodi et al. NEnglJMed 2010 以降の ICI 臨床開発とMellman et al. Nature 2011 が概説した cancer immunotherapy framework と統合された。
③ 臨床応用: 本データは臨床応用において、(a) 個別化 cancer immunotherapy における neoantigen vaccine 開発の合理性、(b) 腫瘍 WES と T 細胞 reactivity profiling を組み合わせた companion diagnostic、(c) 末梢血 neoantigen-specific T 細胞動態を ICI 治療モニタリング bio-marker として活用する可能性、を提示した。臨床的意義は immune checkpoint inhibitor の効果メカニズムの解明と、tumor mutational burden (TMB) や neoantigen load が予測バイオマーカーとして臨床応用可能であることを支持する点で大きい。Bench-to-bedside の translational evidence としては、本研究の pipeline が後年の neoantigen-targeted personalized vaccine (Sahin 2017 Nature RNA vaccine、Ott 2017 Nature peptide vaccine) や TIL-based adoptive cell therapy 開発の基盤となり、現代の precision immunotherapy 開発の出発点となった。
④ 残された課題: 今後の課題として、(a) 単一症例のため一般化可能性が限定的で、より大規模 cohort での neoantigen 同定率・治療奏効との相関の検証 (後の Snyder 2014 et al. が追跡)、(b) NetMHC3.2 等の HLA binding predictor の精度限界 (false positive・false negative rate の評価)、(c) MHC class II restricted CD4 T 細胞 neoantigen の同定 (本研究は class I のみ)、(d) 治療抵抗例 (non-responder) の neoantigen 反応性プロファイル比較、(e) 末梢血 vs 腫瘍内 T 細胞動態の乖離評価、(f) ATR mutation 自体が DNA damage response 制御因子であることの biological 意義 (DNA repair impairment と neoantigen 生成の関係)、limitation として今後の検討と future research direction としては、cancer exome-guided neoantigen pipeline の標準化・clinical-grade implementation、neoantigen-targeted vaccine の phase 2/3 試験、TIL adoptive transfer での neoantigen-enrichment 戦略、anti-PD-1 治療との combination での neoantigen 動態解析、TMB high/low での neoantigen quality assessment が待たれる。
方法
症例: 56 歳男性、2003 年に左上腕の nodular melanoma (Breslow thickness 1.5 mm) と診断。2009 年 4 月に両腋窩リンパ節転移発症、右側郭清。PET 検査で両腋窩・右肩甲下軟部組織・肝左葉・横行結腸頭側腸間膜に [¹⁸F]fluorodeoxyglucose 集積。Dacarbazine 6 コース後に明らかな progression。2009 年 10 月に左腋窩リンパ節を palliative 郭清。2010 年 6 月に頭部 MRI で 3 病変 (1 切除 + 2 stereotactic radiotherapy)。2010 年 8 月から ipilimumab Expanded Access Program で 3 mg/kg 静注 × 4 サイクル、Grade 1 dermatitis のみで完遂。治療後 CT で tumor load -25% の marked regression、S100b 腫瘍 marker が正常化 (upper limit 0.10 μg/L 以下)。
Whole-exome sequencing (WES): 2009 年切除リンパ節転移巣から腫瘍細胞と TIL を分離。腫瘍細胞と autologous 健常組織 (control) の whole-exome を Illumina で sequencing。Somatic mutation calling は false discovery rate (FDR) 0.07 で実施。RNAseq による gene expression filtering を併用し expressed mutations のみ neoantigen prediction に使用。
Neoantigen prediction pipeline: NetChop Cterm3.0 (proteasomal processing 予測) と NetMHC3.2 (HLA class I binding affinity 予測、9-11 amino acid 長) を組み合わせ、患者 HLA allele (HLA-A03:01、HLA-A32:01、HLA-B13:02、HLA-B27:02) に対する medium-to-high affinity 結合候補を抽出。合成 peptide を化学合成。
MHC multimer staining: Multiplexed peptide-MHC (pMHC) multimer は micro-scale parallel UV-induced peptide exchange reaction で大規模並列調製。Fluorophore-coupled multimer (cytochrome 7、R-Phycoerythrin-Cy7、Qdot 625 等) で TIL を染色し、Flow cytometry で neoantigen-specific CD8+ T 細胞を identify。陽性 hit は独立 batch で確認。
機能的検証: Sorted ATR S→L MHC multimer-positive T 細胞を HLA-A*03:01-matched melanoma cell line (526 cells) と coculture、mutant peptide vs wild-type peptide pulsed target cells に対する T 細胞反応性 (IFN-γ production、target killing) を測定。
縦断モニタリング: Ipilimumab 開始前 (-341 日、-216 日、-28 日) と治療後 (+33 日) の末梢血単核細胞 (PBMC) を ATR S→L MHC multimer で染色し、neoantigen-specific T 細胞頻度を CD8+ 中の % として時系列で測定。Statistical analysis は descriptive (case report のため group comparison なし)。