- 著者: Xinxin Li, Wei Zhou, Liangliang Zhou, Yingbin Li, Xufeng Wu, Jianjun Chen
- Corresponding author: Jianjun Chen (The First People’s Hospital of Yancheng, Yancheng First Hospital Affiliated Nanjing University Medical College, China)
- 雑誌: Molecular Immunology
- 発行年: 2025
- Epub日: 2025-03-08
- Article種別: Original Article
- PMID: 40056630
背景
敗血症は、感染に対する宿主の不均衡な応答に起因する多臓器機能不全であり、ICU入院患者の死亡率は30〜45%に達する重篤な疾患である Singer et al. Jama 2016。肺は敗血症において最も早期かつ重篤な臓器障害を受けやすく、敗血症関連急性肺障害 (ALI) および急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) として顕在化する。ALI/ARDSは肺水腫、肺好中球浸潤、および「サイトカインストーム」を特徴とするが、その複雑な病態生理のため、現在有効な薬物療法が乏しい状況にある Gorman et al. Lancet 2022。したがって、敗血症性ALIの分子メカニズムをさらに解明することは、早期診断、治療効果評価、および予後予測の向上に極めて重要である。
好中球は敗血症の病態進行において中心的役割を果たす。LPS (リポポリサッカライド) 刺激を受けると好中球は過剰活性化され、有害物質を産生して臓器傷害を促進することが知られている Zhang et al. ClinTranslMed 2023。過去の研究から、敗血症などの炎症プロセスにおいて好中球由来細胞外小胞 (EV) が増加することが報告されている Kolonics et al. Cells 2020。当初、好中球由来EVは抗炎症的性質を持つと考えられていたが、近年では免疫調節および炎症促進機能も確認されている Allen et al. FrontImmunol 2022。LPS刺激好中球由来エクソソームのmiR-122-5pが脳微小血管内皮細胞を障害する例など、好中球エクソソームカーゴの多様な生理活性が報告されているが、その詳細なメカニズムは未解明な部分が多い。
S100A8はカルシウム結合タンパクファミリーに属し、好中球や単球に高発現するDAMP (Damage-Associated Molecular Pattern) タンパクである。S100A8/A9ヘテロ二量体 (カルプロテクチン) は、TLR4などのパターン認識受容体を介して強力な炎症シグナルを誘起する。先行研究では、S100A8が敗血症患者で高発現し、その発現レベルが死亡予測に有用であることが示されていた。また、S100A9由来のパイロトーシス誘導機序も報告されていたが、好中球由来エクソソームを介したS100A8の気道上皮細胞への輸送と肺障害増悪機序はこれまで体系的に解明されておらず、この点に知識のギャップが残されている。
パイロトーシスは、NLRP3インフラマソームを介したカスパーゼ-1依存性の炎症性細胞死様式であり、アポトーシスとは異なり、細胞死とともに大量の炎症性サイトカイン (IL-1β、IL-18) を放出して炎症カスケードをさらに増幅する特徴を持つ He et al. Trends Biochem. Sci. 2016。ガスダーミンD (GSDMD) のN末端断片が細胞膜に孔を形成することがパイロトーシスの実行機構として知られ、敗血症性ALIにおけるパイロトーシスの関与が示唆されていた。GEOデータセット (GSE232753、GSE154918、GSE243127) のバイオインフォマティクス解析により、S100A8が敗血症患者血液で顕著に過剰発現することが示され、本研究の着想となった。この背景から、好中球由来エクソソームを介したS100A8の作用機序の解明が、敗血症性ALIの治療戦略開発において不足している知見を補完すると考えられる。
目的
本研究の目的は、敗血症条件下でLPS (リポポリサッカライド) 刺激を受けた好中球由来エクソソーム (LPS-N-Ex) に高濃度に搭載されるS100A8が、気道上皮細胞のパイロトーシスを誘導し、敗血症性ALIを増悪させる分子メカニズムをin vitroおよびin vivoで詳細に解明することである。具体的には、S100A8がTLR4/NLRP3インフラマソーム経路を介してパイロトーシスを活性化する機序を検証し、S100A8が敗血症性ALIの新たな治療標的となり得るかを評価する。この目的を達成するため、バイオインフォマティクス解析、臨床検体を用いた検証、LPS誘発ALIマウスモデル、およびヒト気道上皮細胞株BEAS-2Bを用いたin vitro実験を組み合わせ、S100A8の役割とシグナル経路の同定を目指す。
結果
S100A8の敗血症患者血清・BALFでの高発現: バイオインフォマティクス解析 (GEOデータセットGSE232753) において、敗血症患者の血液ではS100A8が最も上方制御された遺伝子の一つとして同定された (log2FC 4.484、-log10P値 27.641) (Fig. 1A-B)。独立したコホートであるGSE154918およびGSE243127の解析でも、同様のS100A8過剰発現が確認された (Fig. S1)。臨床サンプルのELISA解析では、敗血症患者20例の血清S100A8濃度 (約1,000 ng/mL以上) は健常対照 (約200 ng/mL未満) に比して有意に高く (P<0.01)、BALF中S100A8も同様に有意な増加を示した (P<00.001) (Fig. 1C, E)。S100A9も血清およびBALFの両方で健常対照より有意に高値であった (P<0.01, P<0.001) (Fig. 1D, F)。これらの結果は、S100A8が敗血症性ALIの病態生理において重要な役割を果たすことを強く示唆している。
LPS誘発ALIマウスモデルにおける好中球エクソソームS100A8の高発現: LPS腹腔内投与により作製したALIマウスモデルでは、H&E染色により肺組織傷害 (肺胞壁傷害、間質性浮腫、好中球浸潤) が顕著に観察され、肺障害スコアが有意に増加した (P<0.001) (Fig. 2A-B)。肺水腫の指標であるW/D比もLPS群で有意に上昇した (P<0.001) (Fig. 2C)。BALF中総細胞数および好中球数もLPS群で有意に増加した (P<0.001) (Fig. 2D-E)。マウス血清およびBALF中のS100A8およびS100A9濃度もLPS群で有意に上昇した (P<0.001) (Fig. 2F-I)。さらに、マウス好中球の培養上清中S100A8およびS100A9分泌量もLPS群で有意に高値であった (P<0.001) (Fig. 2J-K)。単離した好中球由来エクソソームはTEMにより直径30-150 nmの球状小胞として確認され (Fig. 2L)、WBによりエクソソームマーカーCD9およびTSG101が陽性であることが確認された (Fig. 2M)。WB解析の結果、LPS処理好中球由来エクソソームはコントロール群と比較して有意に高いS100A8およびS100A9タンパク含量を示した (P<0.001) (Fig. 2N)。これらのデータは、LPS刺激好中球がS100A8を高濃度に搭載したエクソソームを放出することを示している (n=3 mice/group)。
LPS-N-ExによるBEAS-2B細胞のパイロトーシス誘導: in vitro実験において、LPS-N-Ex処理BEAS-2B細胞はN-Ex処理細胞と比較して細胞増殖活性が有意に低下した (P<0.001) (Fig. 3A)。PI染色では、LPS-N-Ex処理群の死細胞率が有意に増加した (P<0.001) (Fig. 3B)。WB解析により、LPS-N-Ex処理群ではNLRP3、ASC、Cleaved caspase-1 (p20)、Cleaved GSDMD (N末端断片) の発現が有意に増加し、パイロトーシスシグナルカスケードが活性化されていることが確認された (P<0.001) (Fig. 3C)。ELISAによるIL-1βおよびIL-18の測定でも、LPS-N-Ex処理群で有意な増加が認められた (P<0.001) (Fig. 3D)。これらの結果は、LPS刺激好中球由来エクソソームが気道上皮細胞のパイロトーシスを直接的に誘導することを示唆している (n=3 cells/group)。
S100A8が主要なエクソソームカーゴとしてパイロトーシスを誘導: S100A8組換えタンパク (100 ng/mL) 単独添加でも、BEAS-2B細胞のコロニー形成能低下 (P<0.001)、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18 mRNAの増加 (P<0.001)、およびカスパーゼ-1/PI二重陽性率 (パイロトーシス率) の増加 (P<0.001) が確認された (Fig. 4A-E)。さらに、抗S100A8抗体 (1.25 ng/mL) の事前添加は、LPS-N-Exによる増殖抑制、NLRP3/pro-IL-1β/pro-IL-18 mRNA増加、およびパイロトーシス誘導を有意に逆転させた (P<0.001) (Fig. 4A-E)。これらの結果は、S100A8がLPS-N-Exの機能における主要なメディエーターであり、気道上皮細胞のパイロトーシス誘導に不可欠であることを明確に示している (n=3 replicates)。
TLR4シグナル経路の同定: BEAS-2B細胞のTLR4をsiRNAでノックダウン (KD-TLR4) した後にS100A8組換えタンパクを添加すると、S100A8単独刺激で観察された増殖抑制 (P<0.001)、PI陽性率増加 (P<0.001)、NLRP3/ASC/Cleaved caspase-1/Cleaved GSDMD発現増加 (P<0.01〜0.001)、IL-1β/IL-18産生増加 (P<0.001) がいずれも有意に抑制された (Fig. 6A-D)。この結果は、S100A8がTLR4シグナル経路を介してNLRP3インフラマソームを活性化し、カスパーゼ-1およびGSDMDの切断を促進することで、IL-1βおよびIL-18の成熟分泌を誘導するというシグナルカスケードが機能していることを強く示唆している (n=3 cells/group)。
In vivoにおける好中球エクソソームの肺障害増悪とS100A8ノックダウンによる救済: LPSによるALIモデルマウスにLPS-N-Exを追加投与すると、H&E染色による肺障害スコアがLPS単独群よりさらに有意に悪化し (P<0.001)、W/D比も増大した (P<0.001) (Fig. 5A-C)。肺組織ではNLRP3、ASC、Cleaved caspase-1、Cleaved GSDMDの発現が有意に増加し (P<0.001)、IL-1βおよびIL-18のELISA値も上昇した (P<0.001) (Fig. 5D-F)。S100A8ノックダウン (shRNA-S100A8) 処理のLPS-N-Ex投与群では、これらの変化が有意に部分的に逆転し、肺障害スコアの改善 (P<0.01)、W/D比の低下 (P<0.01)、パイロトーシスマーカーの減少 (P<0.05〜0.001) が認められた (shRNA-NC群との比較) (Fig. 5A-F)。この結果はin vivoにおいても、好中球エクソソームS100A8が敗血症性ALIにおけるパイロトーシス依存性肺障害増悪の鍵因子であることを実証した (n=3 mice/group)。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、敗血症条件下でLPS (リポポリサッカライド) 刺激を受けた好中球がS100A8を高濃度搭載したエクソソームを放出し、これが気道上皮細胞のTLR4→NLRP3→カスパーゼ-1→GSDMDパイロトーシス経路を活性化して肺障害を増悪させるという新規機序を初めて明示した。これまでの研究では、好中球エクソソームの炎症促進機能としてmiR-30d-5pによるM1マクロファージ極性化とマクロファージパイロトーシス誘導 Jiao et al. Crit. Care 2021、あるいはlncRNA HCG18によるマクロファージ極性化などが報告されていたが、肺上皮細胞 (BEAS-2B細胞) に対する直接のS100A8依存性パイロトーシス誘導という本研究の知見はこれらと相補的であり、異なる細胞種への影響を明らかにした点で対照的である。S100A8はマクロファージ由来でもNLRP3インフラマソーム依存性パイロトーシスを促進することが示されていたが Liu et al. Cells 2022、好中球エクソソームというベクターを介した上皮細胞への作用は本研究が初めて体系的に示した経路である。また、S100A8/A9がTLR4/ROS/NLRP3/カスパーゼ-1経路を介してGSDMD依存性血小板パイロトーシスを誘導することが報告されているが Su et al. NatCardiovascRes 2022、本研究は好中球由来エクソソームがS100A8を介して気道上皮細胞のパイロトーシスを誘導するという点で異なるアプローチと細胞種に焦点を当てている。
新規性: 本研究で初めて、S100A8が好中球エクソソームの主要なカーゴとして機能し、気道上皮細胞のTLR4を介してNLRP3インフラマソームを活性化し、カスパーゼ-1およびガスダーミンDの切断を促進することでパイロトーシスを誘導するという新規の分子メカニズムを同定した。この経路は、敗血症における「炎症の嵐」増幅の具体的分子機序として重要な意義を持つ。S100A8は好中球内に大量貯蔵されており、活性化された好中球からエクソソームを介して効率的に標的細胞へ送達されるという知見は、エクソソームの細胞間コミュニケーションにおける役割をさらに深く理解する上で新規性がある。
臨床応用: 本研究の知見は、敗血症性ALIの治療戦略開発に重要な臨床的意義を持つ。in vitroおよびin vivo双方で抗S100A8抗体による効果が確認されたことは、S100A8中和を標的とした治療介入の可能性を示唆する。S100A8は敗血症患者の予後予測能 (死亡患者で生存患者より高値、診断精度も高いという先行研究) と合わせて、バイオマーカーおよび治療標的の両面で有望な候補分子である。S100A8の血清およびBALF中の高発現は、敗血症性ALIの早期診断や病態モニタリングに利用できる可能性も示唆される。
残された課題: 本研究にはいくつかの限界が残されている。第一に、臨床コホートがICU患者20例と小規模であり、より大規模なコホートでの検証が必要である。第二に、S100A8は好中球以外にも単球、マクロファージ、MDSC (骨髄由来抑制細胞) などから産生されるため、敗血症におけるエクソソームS100A8の主要な供給源が好中球であるかどうかの相対的寄与は未解明である。第三に、エクソソームのS100A8搭載メカニズム (微小管依存的分泌か小胞体経路かなど) が詳細に解明されていない。第四に、TLR4ノックダウン細胞にLPS-N-Exを直接添加するレスキュー実験が未実施であり、TLR4がエクソソームS100A8の作用に直接関与するかをさらに明確にする必要がある。また、本実験系は不死化気道上皮細胞株BEAS-2B細胞を使用しており、一次培養肺胞上皮細胞や肺血管内皮細胞との相互作用は未検討である。今後の検討課題として、シングルセルシーケンシングやプロテオミクスを活用したS100A8の細胞種別寄与の解析、および他のエクソソームカーゴ分子との相互作用の解明が挙げられる。これらの課題を解決することで、S100A8を標的とした敗血症性ALIの治療法開発がさらに進展すると考えられる。
方法
バイオインフォマティクス解析: GEO2Rプラットフォームを用いてGEOデータベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) のGSE232753、GSE154918、GSE243127データセットを解析した。敗血症患者と健常人の末梢血における差異発現遺伝子を同定し、|log2FC|>1かつadj.P<0.05を有意差基準とした。また、Vesiclepediaデータベース (http://microvesicles.org/query) を利用し、エクソソーム内S100A8の既知情報を確認した。
臨床検体: Sepsis-3診断基準に基づき、ICUに入院した敗血症患者20例と、肺感染症のない単発肺結節評価患者20例 (健常対照) を対象とした。末梢血を採取し、気管支肺胞洗浄 (BAL) でBALFを回収した。全てのサンプルは液体窒素で凍結後、-80℃で保存した。ELISA (Solarbio, SEKH-0421, SEKH-0422) を用いてS100A8およびS100A9の血清およびBALF中の濃度を定量した。
エクソソーム単離と同定: 健常ドナー末梢血からPercoll密度勾配法により好中球を単離した (純度>95%、生存率>97%)。好中球をRPMI 1640培地 (10^6 cells/mL) で培養し、LPS 300 ng/mLで15時間刺激した後に培養上清からexoEasy Maxi Kit (QIAGEN) を用いてエクソソームを単離した (LPS-N-Ex)。対照として非刺激好中球由来エクソソーム (N-Ex) を使用した。単離したエクソソームは透過型電子顕微鏡 (TEM, HITACHI, HT7700) で形態を観察し、ウエスタンブロット (WB) によりエクソソーム特異的マーカーであるCD9 (Abcam, ab223052) およびTSG101 (Abcam, ab30871) の発現を確認した。
In vitro実験: ヒト気道上皮細胞株BEAS-2B (ATCC, CRL-3588) を用いた。BEAS-2B細胞にLPS-N-ExまたはN-Ex (2.5%、600 μL) を24時間共培養した。CCK-8アッセイ (Beyotime, C0038) で細胞増殖活性を評価し、コロニー形成アッセイで増殖能を評価した。PI染色 (2 μg/mL) とDAPI染色 (5 μg/mL) により細胞死を蛍光顕微鏡 (Olympus) で可視化し、PI陽性細胞の割合を算出した。WBによりNLRP3 (Abcam, ab263899)、ASC (Abcam, ab309497)、Cleaved caspase-1 (CST, 9661S)、Cleaved GSDMD (Abcam, ab215203, ab255603) の発現を定量した。ELISA (Abcam, ab214025, ab215539) によりIL-1βおよびIL-18を測定した。RT-qPCRによりNLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18 mRNAを定量した。フローサイトメトリー (BIO-RAD, ICT097) でカスパーゼ-1/PI二重染色によりパイロトーシス率を算出した。機序解析として、S100A8組換えタンパク (Abcam, ab167749, 100 ng/mL) 単独添加、抗S100A8抗体 (Abcam, ab92331, 1.25 ng/mL) 追加実験、およびTLR4 siRNAノックダウン (KD-TLR4) 細胞でのS100A8刺激実験を実施した。TLR4 siRNA配列はGenepharma社製 (フォワード: 5’-GAAAUGAGCUGGUAAAGAATT-3’、リバース: 5’-UUCUUUACCAGCUCAUUUCTT-3’) を使用した。
In vivo実験: C57BL/6雄性マウス (8週齢、20-25 g、GemPharmatech) にLPS腹腔内投与 (20 mg/kg、2時間) でALIモデルを作製した。実験群はControl、LPS単独、LPS+LPS-N-Ex (300 μg/マウス腹腔内)、LPS+LPS-N-Ex+shRNA-NC、LPS+LPS-N-Ex+shRNA-S100A8 (lentivirusベクターによりS100A8をノックダウン) とした。shRNA-S100A8配列はGenomedtech社製 (フォワード: GATCCGTCAACACTGATGGTGCAGTTACTCGAGTAACTGCACCATCAGTGTTGATTTTTT; リバース: AATTCAAAAAATCAACACTGATGGTGCAGTTACTCGAGTAACTGCACCATCAGTGTTGACG) を使用した。H&E染色 (Beyotime, C0105M) および肺障害スコアリング (6視野盲検評価) で肺組織傷害を評価した。肺湿乾重量比 (W/D ratio) で肺水腫を評価した。BALF中総細胞数および好中球数を計測した。WBで肺組織のパイロトーシスマーカー発現を解析した。ELISA (Abcam, ab197742, ab216165) でBALFおよび肺組織のIL-1β、IL-18を測定した。
統計解析: GraphPad Prism (v9.0.0.121) を用いてデータを解析した。全ての実験は少なくとも3回繰り返した (臨床サンプル: n=20/group; 細胞および動物実験: n=3/group)。データは平均±SDで示し、2群間比較には対応のないStudentのt検定を、多群間比較には一元配置ANOVA後にTukeyのpost hoc検定を用いた。P<0.05を有意差ありと判断した。