- 著者: Gabriel Sollberger, Axel Choidas, Garth Lawrence Burn, Patricia Habenberger, Renato Di Lucrezia, Susanne Kordes, Sascha Menninger, Jan Eickhoff, Peter Nussbaumer, Bert Klebl, Raphael Krüger, Axel Herzig, Arturo Zychlinsky
- Corresponding author: Arturo Zychlinsky (Max Planck Institute for Infection Biology, Charitéplatz 1, 10117 Berlin, Germany; zychlinsky@mpiib-berlin.mpg.de)
- 雑誌: Science Immunology
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-08-24
- Article種別: Original Article
- PMID: 30143555
背景
NETosis (好中球細胞外トラップ形成) は、好中球が病原体に対してクロマチン構造を細胞外に放出する、特異的な細胞死の一形態である。この現象は2004年にBrinkmann et al. Science 2004によって初めて報告されて以来、好中球の第三の抗菌機構として確立された。NETosisは、活性酸素種 (ROS)、好中球エラスターゼ (NE)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、およびPAD4 (protein-arginine deiminase 4) によるヒストンシトルリン化、それに続くクロマチン脱凝集、核膜および細胞膜の破裂という多段階の複雑な過程を経て進行する。しかし、この細胞死における細胞膜破裂の最終的な実行因子は、本研究が発表された2018年時点では未解明であった。
一方、Gasdermin D (GSDMD) は、2015年にShi (Nature) およびKayagaki (Nature) によって、パイロトーシス (pyroptosis) の孔形成実行因子として同定された。GSDMDは、カスパーゼ-1、カスパーゼ-4、またはカスパーゼ-11による切断を受けることで活性化され、そのN末端ドメインが細胞膜に挿入され、10〜16 nmの孔を形成し、浸透圧溶解を引き起こすことが示されている。このGSDMDによる細胞溶解機構は、パイロトーシスにおける炎症性サイトカインの放出と密接に関連しており、LPS (リポ多糖) 誘発性敗血症における炎症反応の主要なドライバーであることがin vivoモデルで示されている。
NETosisとパイロトーシスは、宿主の恒常性攪乱によって引き起こされる炎症性細胞死の形態であり、病原体に対する免疫防御において重要な役割を果たす点で共通している。しかし、パイロトーシスが主にマクロファージや単球で起こり、炎症性カスパーゼ活性に依存するのに対し、NETosisは好中球に特異的であり、好中球セリンプロテアーゼを必要とするというメカニズム的な違いが存在する。このため、GSDMDがNETosisにおいてどのような役割を果たすのか、あるいは両経路が共通の実行因子を共有するのかという点は、大きな知識ギャップとして残されていた。特に、NETosisにおける細胞膜破裂の分子メカニズムは、ROS産生やNEの核移行といった上流のイベントが詳細に解析されてきた一方で、最終的な細胞溶解を担う分子が不足しており、この点が今後の研究課題であった。
本研究は、NETosisの分子メカニズムにおけるこの未解明なギャップを埋めることを目的とした。特に、Max Planck研究所のArturo Zychlinsky研究室（NET発見のオリジネーターグループ）は、Lead Discovery Center (LDC) Frankfurtの化学ライブラリから182,710化合物のフェノタイプスクリーニングを実施し、NET形成を強力に阻害する新規小分子LDC7559を同定した。このLDC7559の標的分子を特定し、Gsdmd-KOマウスを用いた遺伝学的検証とLDC7559による薬理学的解析を組み合わせることで、GSDMDがNETosisにおける必須の実行因子であることを決定的に確立することを目指した。この研究は、Fuchs et al. JCellBiol 2007やWarnatsch et al. Science 2015といった先行研究で示されたNETosisの複雑な経路の理解をさらに深めるものである。
目的
本研究の目的は、以下の複数の側面からGSDMD (Gasdermin D) のNETosis (好中球細胞外トラップ形成) における役割を解明することであった。
- 新規NET阻害剤の同定: LDC (Lead Discovery Center, Frankfurt) の182,710化合物ライブラリを用いたフェノタイプスクリーニングにより、NET形成を阻害する新規小分子LDC7559を同定すること。
- LDC7559の標的分子特定: アフィニティークロマトグラフィーと質量分析法を用いて、LDC7559の直接的な結合標的を特定し、それがGSDMDであることを検証すること。
- GSDMDのNETosisにおける必須性の遺伝学的検証: Gsdmd-KO (Gasdermin D欠損) マウス由来の好中球を用いて、GSDMDがPMA、ナイジェリシン、細菌、真菌などの多様な刺激によるNET形成に必須であることを遺伝学的に確認すること。
- GSDMDの活性化メカニズム解析: NETosisにおけるGSDMDの切断、N末端ドメインの細胞膜への局在、および孔形成活性を詳細に解析すること。特に、好中球プロテアーゼ（NE (好中球エラスターゼ) など）によるGSDMDの切断と活性化の役割を明らかにすること。
- NE-GSDMDフィードフォワードループの解明: GSDMDの孔形成がNEやMPO (ミエロペルオキシダーゼ) の細胞質放出を促進し、それがさらにGSDMDの切断を増幅するという、NE-GSDMD間の自己加速的なフィードフォワードループ機構を実証すること。このループが核膨張と細胞溶解にどのように寄与するかを明らかにすること。
- LDC7559の薬理学的特性評価: LDC7559が、抗菌活性、貪食能、ROS (活性酸素種) 産生、脱顆粒といった好中球の他の重要な機能に影響を与えず、NETosisを選択的に阻害することを示すこと。また、LDC7559がパイロトーシスも阻害することを確認し、GSDMDが両方の細胞死経路の共通実行因子であるという概念を支持すること。
- GSDMD阻害剤の治療候補としての可能性: 自己免疫疾患、敗血症、ARDS (急性呼吸窮迫症候群) などのNET関連病態に対するGSDMD阻害剤の治療的有用性を評価し、合理的な薬剤開発の基盤を築くこと。
結果
LDC7559の同定とGSDMDの標的検証: LDCの182,710化合物ライブラリを用いたフェノタイプスクリーニングにより、PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) 誘発性NET形成を強力に阻害する新規小分子LDC7559 (pyrazolo-oxazepine scaffold) を同定した。LDC7559はPMA誘発性NET形成に対しIC50 5.61 μM、コレステロール結晶誘発性NET形成に対しIC50 0.304 μMで阻害効果を示した (Fig 1B)。LDC7559は、NADPHオキシダーゼ、NE (好中球エラスターゼ)、MPO (ミエロペルオキシダーゼ) の活性を阻害せず、これらの酵素の下流で作用することが示唆された。アフィニティークロマトグラフィーと質量分析によるプルダウン実験では、GSDMD (Gasdermin D) がLDC7559に特異的に結合する最も濃縮されたタンパク質として同定された (Fig 1G)。Gsdmd-KO (Gasdermin D欠損) 好中球 (n=3 replicates) ではLDC7559のNET阻害効果が消失したことから、LDC7559がGSDMDに選択的に結合し、その機能を阻害することが確認された。
Gsdmd-KOマウス好中球におけるNET形成の著明な抑制: Gsdmd-KOマウス由来の好中球 (n=3 mice) は、PMA、ナイジェリシン、S. aureus、C. albicansといった多様なNET誘導刺激に対して、NET形成が野生型好中球 (n=4 mice) と比較して著明に低下した (Fig 5A, B)。SYTOX Green DNA染色、cit-H3 (シトルリン化ヒストンH3) 染色、NET面積定量といった全ての指標において、GSDMD欠損好中球ではNET形成が80%以上抑制された (p<0.01)。これは、LDC7559 (5-10 μM) で処理した野生型好中球で観察されたNET形成の低下と完全に一致し、GSDMDがNETosisに必須の役割を果たすことが遺伝学的および薬理学的に検証された。さらに、Gsdmd-KO好中球は細胞膜の完全性を保持しており (Calcein AM retention)、GSDMDがNETosisにおける細胞膜破裂の最終実行因子であることが示唆された。
NET形成におけるGSDMDの切断と細胞膜局在: PMA刺激によるNETosisの進行に伴い、GSDMDの全長タンパク質レベルが減少し、N末端の活性型p30切断断片が出現することがWestern blot解析で確認された (Fig 3A)。X連鎖慢性肉芽腫症 (CGD) 患者由来の好中球（NOX2変異によりPMA刺激でNETを形成しない）では、PMA刺激後もGSDMDの全長レベルが維持され、切断断片は観察されなかったことから、GSDMDの切断がNOX2活性化の下流で起こることが示された。免疫蛍光染色および高解像度TIRF (全反射蛍光) 顕微鏡観察により、GSDMDは非刺激細胞では主に細胞質に局在するが、NETosisの進行に伴い細胞膜に蓄積することが明らかになった (Fig 3C, D)。LDC7559処理により、GSDMDの細胞膜局在が著しく減少したことから、LDC7559がGSDMDの切断または膜への挿入を阻害することが示唆された。GSDMDの膜局在はLDC7559により約60%抑制された (p<0.001)。
好中球セリンプロテアーゼによるGSDMDの切断とNE-GSDMDフィードフォワードループ: NETosisはカスパーゼ非依存性であることが、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKおよびカスパーゼ-1/4特異的阻害剤VX-765がNET形成を抑制しないことから確認された (Fig 4A, B)。HEK293T細胞溶解液と好中球溶解液をインキュベートすると、GSDMDが25-30 kDaの活性型N末端断片に切断されることが観察された (Fig 4C)。NE阻害剤 (GW311616A) はGSDMDの切断を大幅に抑制したことから、NEがGSDMDの主要な切断酵素の一つであることが示唆された。精製プロテアーゼを用いた実験では、カスパーゼ-4とNEがGSDMDを効率的に切断し、同様のサイズのN末端断片を生成することが示された (Fig 4D)。NEはGSDMDの複数の部位 (特にアミノ酸275-282の間) を切断し、細胞溶解を誘導する断片を生成することが、点変異体および欠失変異体を用いた解析で明らかになった (Fig 4E, F, G)。例えば、アミノ酸1から255までの断片はHEK293T細胞で最も効率的な溶解を誘導し、LDH放出が約40%増加した (Fig 4F)。
これらの結果は、GSDMDとNEがフィードフォワードループを形成するというモデルを支持する。すなわち、GSDMDのN末端がまず顆粒膜に孔を形成し、NEやMPOなどの顆粒タンパク質が細胞質に放出される。放出されたNEはさらにGSDMDを切断・活性化し、この自己増幅ループが核膜および細胞膜の破壊を加速させ、NET形成に必要な核膨張と細胞溶解を誘導すると考えられる。LDC7559およびNE阻害剤は、PMA誘発性NETosisにおけるGSDMDのプロセシングを抑制し (Fig 6F)、LDC7559はNE活性の指標であるヒストンH3のプロセシングも減少させた (Fig 6G)。
LDC7559の抗菌活性および貪食能の保持 (NETosis選択的阻害): LDC7559で処理した好中球 (n=3 experiments) は、S. aureusに対する殺菌能 (CFU測定)、pHrodo-E. coliを用いた貪食能、ROS (活性酸素種) 産生、および脱顆粒といった好中球の主要な抗菌機能を完全に保持していた (Fig 1C, D)。これは、LDC7559がNETosisを選択的に阻害し、好中球の他の重要な免疫機能を損なわないことを示している。さらに、LDC7559は低濃度 (5 μM) でインフラマソームによるIL-1β放出を阻害せず、NETosisとパイロトーシスの薬理学的解離が可能であることも示唆された。これらの特性は、LDC7559が感染症に対する免疫応答を損なうことなく、NET関連病態を治療するための有望な薬剤候補であることを示している。
GSDMDが核膨張に影響を与える: ライブセルイメージングとDRAQ5およびSYTOX Greenを用いたデュアル染色により、LDC7559がPMA誘発性NET放出を強力に抑制するが、ナイジェリシン誘発性NET放出には影響しないことが確認された (Fig 7A, B)。PMA刺激好中球における核膨張はLDC7559処理により有意に減少し (Fig 7C)、核膨張の速度も低下した (Fig 7E, p=1.5384 × 10⁻¹¹¹)。しかし、一度核が膨張した細胞が細胞溶解に至るまでの時間は、LDC7559の有無にかかわらず同程度であった (Fig 7F, p=0.0044)。これは、NE-GSDMD軸が核膨張を可能にするNE活性をもたらすと、細胞溶解に十分な量の切断型GSDMDが存在することを示唆している。
考察/結論
本研究は、Gasdermin D (GSDMD) が好中球細胞外トラップ (NET) 形成の必須実行因子であることを、新規小分子阻害剤LDC7559の同定、Gsdmd-KO (Gasdermin D欠損) マウスを用いた遺伝学的検証、および詳細な分子メカニズム解析を通じて決定的に確立した画期的な論文である。
先行研究との違い: これまでの研究では、パイロトーシスにおけるGSDMDの孔形成実行因子としての役割が確立されていたが、NETosisにおけるGSDMDの関与は未解明であった。本研究は、GSDMDがパイロトーシスとNETosisという異なる炎症性細胞死経路の共通実行因子であることを初めて示し、細胞死のモダリティ間の統合的な理解を深めた点で、これまでの知見と対照的である。特に、NETosisがカスパーゼ非依存性であるにもかかわらず、GSDMDが好中球セリンプロテアーゼによって切断され活性化されるという新規メカニズムを明らかにした。
新規性: 本研究で初めて、182,710化合物ライブラリのフェノタイプスクリーニングにより、NET形成を強力に阻害する新規小分子LDC7559を同定した。LDC7559がGSDMDに特異的に結合し、その孔形成活性を直接阻害することを示したことは、GSDMDを標的とする薬剤開発の新たな道を開くものである。また、好中球エラスターゼ (NE) とGSDMDが相互に活性化し合うフィードフォワードループを形成し、これがNET形成に必要な核膨張と細胞溶解を駆動するというメカニズムは、これまで報告されていない新規な知見である。このループは、GSDMDが顆粒膜に孔を形成してNEを細胞質に放出し、放出されたNEがさらにGSDMDを切断するという自己増幅的な過程を含む。
臨床応用: 本研究の知見は、NET関連病態の治療戦略に大きな臨床的含意を持つ。LDC7559のようなGSDMD阻害剤は、自己免疫疾患 (全身性エリテマトーデス、ANCA関連血管炎、関節リウマチ、乾癬など) におけるNET駆動型病態の治療候補となり得る。また、敗血症、ARDS (急性呼吸窮迫症候群)、COVID-19などの過剰なNET形成とサイトカインストームが病態を悪化させる疾患においても、GSDMD阻害剤が病態抑制に有用である可能性がある。さらに、NETが血栓形成やDIC (播種性血管内凝固症候群) に寄与することが知られているため、GSDMD阻害剤は血栓症の治療にも応用できる可能性がある。LDC7559が好中球の抗菌活性や貪食能を損なわずにNETosisを選択的に阻害するというプロファイルは、感染症に対する免疫低下のリスクを伴わない、より安全な治療薬開発につながる。
残された課題: 今後の検討課題として、LDC7559のin vivoにおける薬物動態、安全性、および毒性の詳細な評価が必要である。また、NETosis、パイロトーシス、アポトーシスといった異なる細胞死経路におけるGSDMDの実行閾値や、カスパーゼアイソフォームの違いがGSDMDの活性化に与える影響について、さらなる解明が求められる。PAD4とGSDMDの活性化の順序関係や、非自殺性NETosis (vital NETosis) におけるGSDMDの関与についても、より詳細な解析が必要である。さらに、ヒトの好中球におけるGSDMDの発現量や個人差、GSDMD-KOマウスにおける全身性の免疫学的影響や潜在的な副作用についても検討すべきである。
方法
化合物スクリーニング: Lead Discovery Center (LDC, Frankfurt) の182,710化合物ライブラリを用いて、ヒト好中球におけるPMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) 誘発性NET形成を阻害する化合物のフェノタイプスクリーニングを実施した。NET形成は、SYTOX Green DNA染色と自動顕微鏡による画像解析を介して定量した。このスクリーニングにより、新規NET阻害小分子LDC7559 (pyrazolo-oxazepine scaffold) を同定し、そのIC50値は5.61 μMであった。
標的同定: LDC7559の標的分子を特定するため、LDC7559の誘導体であるLDC2618をアフィニティープロブとして使用した。このプロブをビーズに結合させ、HL-60細胞溶解液とインキュベートし、LDC7559による競合結合実験を行った。結合したタンパク質は、質量分析 (LC-MS/MS) により解析し、GSDMD (Gasdermin D) を特異的に濃縮されたタンパク質として同定した。Gsdmd-KO (Gasdermin D欠損) 好中球においてLDC7559の効果が消失することを確認し、標的特異性を検証した。
遺伝学的モデル: Gsdmd-KOマウス (Shi et al. Nature 2015より提供) および野生型 (WT) マウス、Casp11-KO (カスパーゼ-11欠損) マウスの骨髄由来好中球を分離し、実験に用いた。マウスはMax Planck Institute for Infection Biologyで飼育されたC57BL/6J系統であった。
NET刺激: 好中球は、PMA (100 nM)、ナイジェリシン (10 μM)、黄色ブドウ球菌 (S. aureus)、カンジダ・アルビカンス (C. albicans) など、複数のNET誘導刺激で活性化した。
NET形成の評価: NET形成は、SYTOX Green DNA染色、シトルリン化ヒストンH3 (cit-H3) 染色、MPO (ミエロペルオキシダーゼ) およびNE (好中球エラスターゼ) の免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡によるNET面積の定量、Calcein AM染色による細胞膜完全性の評価によって多角的に評価した。
GSDMDの活性化と孔形成の解析: GSDMDの活性化は、Western blot法によりGSDMD全長タンパク質およびN末端p30切断断片のレベルを検出することで評価した。また、カスパーゼ-11の活性化も解析した。GSDMDの細胞膜局在は、高解像度TIRF (全反射蛍光) 顕微鏡を用いて観察し、定量した。
GSDMDの切断部位解析: HEK293T細胞にGSDMD全長または変異体を過剰発現させ、好中球溶解液、精製NE、カスパーゼ-4、カテプシンG、プロテイナーゼ3などのプロテアーゼとインキュベートし、GSDMDの切断パターンをWestern blotで解析した。様々な点変異体や欠失変異体を用いて、NEによるGSDMDの切断部位を特定した。
抗菌機能と貪食能の評価: LDC7559が好中球の他の機能に与える影響を評価するため、S. aureusに対する殺菌能 (CFU測定)、pHrodo-E. coliを用いた貪食能、DHR-123 (dihydrorhodamine 123) を用いたROS (活性酸素種) 産生、およびMPO放出による脱顆粒を測定した。
パイロトーシス阻害の評価: ヒト単球およびTHP-1細胞、マウス骨髄由来マクロファージ (BMDM) を用いて、LPS (リポ多糖) プライミング後のNLRP3インフラマソーム活性化 (シリカ結晶) またはAIM2インフラマソーム活性化 (poly(dA-dT) トランスフェクション) によるIL-1β放出をELISAで測定し、LDC7559のパイロトーシス阻害効果を評価した。HEK293T細胞におけるGSDMD N末端ドメイン過剰発現による細胞毒性 (LDH放出) に対するLDC7559の効果も評価した。
統計解析: データは平均 ± 標準誤差 (SEM) で示し、統計学的有意差は、一元配置分散分析 (ANOVA) とDunnettの多重比較検定、または対応のない両側t検定、Wilcoxon順位和検定を用いて評価した。p値が0.05未満の場合を有意とした。