- 著者: Charlotte Thålin, Yohei Hisada, Staffan Lundström, Nigel Mackman, Håkan Wallén
- Corresponding author: Charlotte Thålin (Department of Medicine, Danderyd Hospital, Stockholm, Sweden)
- 雑誌: Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology
- 発行年: 2019
- Epub日: N/A
- Article種別: Review
- PMID: 31315434
背景
好中球細胞外トラップ (NETs) は2004年にBrinkmann et al. Science 2004により発見された、DNAフィラメントにヒストンと顆粒タンパク質 (好中球エラスターゼ[NE]・ミエロペルオキシダーゼ[MPO]など) が結合した網状構造体である。NETs本来の機能は細菌・真菌・ウイルスを捕捉・不活化する自然免疫応答であるが、制御されない過剰なNET形成が動脈・静脈・癌関連血栓症の病態に関与することが次第に明らかになってきた。NETs形成にはPAD4 (ペプチジルアルギニンデイミナーゼ4) 依存的なクロマチン脱凝縮、NE・MPO依存的な活性酸素種産生、およびGSDMD (ガスダーミンD) 依存的な膜穿孔が関わるが、その詳細機構は未解明な部分が多い。
NETsは、血小板の捕捉と活性化を促進し、赤血球やVWF (フォン・ヴィルブランド因子)、TF (組織因子) などの凝固促進分子の足場を提供することで、血管閉塞を促進することがin vitro研究で示されている。さらに、NETsの構成要素は、内因系凝固経路を活性化し、外因系凝固経路の阻害因子であるTFPI (組織因子経路阻害因子) を分解することで凝固を増強する。これらのメカニズムを通じて、NETsは動脈、静脈、および癌関連血栓症における血栓形成と伝播に寄与すると考えられる。
過去10年間で、NETsが血栓形成に重要な役割を果たすことが示唆される多くの研究が発表されてきた。例えば、Fuchs et al. JCellBiol 2007は、NETsが血小板を捕捉し、血小板活性化と凝集を促進することを示した。また、Kessenbrock et al. NatMed 2009は、自己免疫性血管炎におけるNETsの関与を報告し、炎症性疾患におけるNETsの病態生理学的役割に注目が集まった。しかし、これらの知見は主にin vitroまたは動物モデルに基づくものであり、ヒトの様々な血栓性疾患におけるNETsの臨床的関連性については、まだ知識が不足している。特に、NETsの形成経路が複数存在することや、その測定法の標準化が確立されていないことが、研究間の結果の不一致や解釈の困難さを生み出し、この分野の進展における残された課題となっている。
目的
動脈・静脈・癌関連血栓症におけるNETsの役割に関する動物実験および臨床研究を包括的にレビューし、NETsの治療標的としての可能性を論じること。本レビューは、NETs形成の分子機構、その検出・定量における課題、およびNETsが血栓形成を促進する多様なメカニズムを詳細に解説する。さらに、アテローム硬化症、冠動脈血栓症、脳梗塞、DVT (深部静脈血栓症)、および癌関連血栓症におけるNETsの関与を示す具体的なエビデンスを提示し、DNase1 (デオキシリボヌクレアーゼ1) やPAD4阻害薬などのNETsを標的とした治療戦略の現在の進捗と今後の展望について考察することを目的とする。
結果
NETs形成の分子機構 — PAD4・NADPH oxidase・GSDMDの多経路と測定上の課題：クロマチン脱凝縮はNETs形成の前提条件であり、主要経路はカルシウム依存性酵素PAD4によるヒストンのアルギニン残基のシトルリン化である。PAD4は免疫細胞の核および細胞質顆粒に主に発現し、シトルリン化によるコアヒストン・リンカーヒストンのDNA結合力低下が密に充填されたクロマチンを弛緩させる。PAD4欠損HL-60細胞 (C645S変異体) ではカルシウムイオノフォア刺激後のNETs形成が消失し、PAD4阻害薬GSK484はS.aureus・カルシウムイオノフォアによるヒト・マウス好中球NETs形成を抑制する。野生型マウスは複数の刺激 (LPS・PMA・H2O2・カルシウムイオノフォア) に対してNETsを形成するが、PAD4-/-マウスでは形成されない。H3CitはNETs形成のバイオマーカーとして広く使用されており、血漿H3Cit ELISAが in vivo NETs形成の指標として用いられる。
しかし、PAD4非依存的経路の存在も明確に示されている。KennyらはPMAによるNETs形成がH3シトルリン化を伴わずに起き、PAD阻害薬 (Cl-amidine、BB-Cl-amidine) がPMA・カルシウムイオノフォア・toxin nigericin・C. albicans・Group B Streptococcusによるヒト好中球NETs形成を阻害しなかったことを報告した。また別の研究ではLPS・PMA・K. pneumoniae刺激による野生型・PAD4-/-マウス双方でのNETs形成が示されており、これらの知見は研究間のメソドロジー的差異 (好中球分離プロトコール・刺激条件・染色法) と共に、PAD4依存・非依存の複数経路の並存を示唆する。NADPH oxidase依存的な活性酸素種産生もNETs形成を媒介し、NEを介したMPO依存的ヒストン切断がクロマチン弛緩に寄与する。しかしSLEのLDGs (低密度顆粒球) によるNETs形成実験では、ミトコンドリアROSによるNETs形成がNADPH oxidase非依存的に起き、NADPH oxidase欠損 (慢性肉芽腫症) でも観察された。GSDMDは顆粒膜へのpore形成によりNEの核への移行を促進するとともに、細胞膜へのpore形成でNETs放出を可能にし、且つGSDMDによるfeed-forwardループを形成する。LDC7559 (GSDMD阻害化合物) によるGSDMD依存的NETs形成阻害がNADPH oxidase・NE・PAD4活性とは独立して起きることがSollberger et al. SciImmunol 2018により示された。
NETs測定の標準化問題も重要に取り上げられる。eDNAや顆粒タンパク質は単独ではNETs特異的バイオマーカーではなく、組織内での複数マーカー共局在 (extracellular DNA・ヒストン・NE・MPO) 確認が強く推奨される。固定化試薬によるアーチファクト形成、フィブリンとのSEM上の外観類似がNETs誤同定の原因となる。MPO-DNA・H3Cit ELISAはスタンダード化問題を抱えており、数値の比較には注意が必要である。flow cytometryベースの迅速アッセイも提案されているが、客観性・特異性の問題が残存する。
動脈血栓症におけるNETs — アテローム硬化症・冠動脈血栓・脳梗塞での証拠：アテローム硬化症モデルの多数の前臨床研究 (ApoE欠損マウス、LDLR欠損マウス等) でNETsがアテローム硬化巣内に検出され、PAD4阻害薬投与またはPAD4-/-マウスでのアテローム硬化巣縮小・頸動脈閉塞時間延長が複数のグループで報告されている (Table 1)。コレステロール結晶がNETs形成を誘発しNETsがマクロファージを活性化して炎症性サイトカイン産生を増強し、さらなる免疫細胞のプラーク内集積を促進する悪循環が提唱された。Warnatsch et al. Science 2015は、NETsがマクロファージを活性化し、アテローム硬化症における炎症性サイトカイン産生を増強することを示した。注目すべき知見として、ヒトの頸動脈・冠動脈プラーク解析では、NETs (DNA・NE・H4Cit共局在) が脂質豊富な脆弱プラーク (rupture-prone) よりも表面侵食型プラーク (erosion-prone) に優位に検出された。この発見は表面侵食型と脆弱プラーク破裂型の鑑別バイオマーカーとしてのNETs測定可能性を示唆し、invasive治療不要な場合の抗血栓治療個別化に貢献しうる。
急性心筋梗塞患者の冠動脈血栓でのNETs研究では、de Boer et al. (n=45 STEMI) でNETs (ヒストン・NE・MPO共局在) が新鮮血栓に多く旧組織化血栓では少なかった。Mangold et al. (n=111 STEMI) では冠動脈血栓内NETs量が梗塞サイズと正相関し心電図のST分節解消と負相関した。梗塞関連冠動脈 (IRA) から採取した好中球は非IRAより有意に高率でex vivo NET産生を示し、ヌクレオソーム・eDNA・NE・MPO・MRP 8/14はIRAからの採取血で大腿静脈血より有意に高値であり、局所的NET形成を支持した。Stakos et al. (n=18 STEMI) でも梗塞関連冠動脈由来の血液・血栓でH3CitおよびMPO-DNA複合体増加と高率のex vivo NET産生好中球が認められた。ステント血栓症 (n=253多施設研究) では全ステント血栓の25%にNETs (eDNA・NE共局在) が検出された (Table 2)。脳梗塞 (急性虚血性脳卒中) でもn=68の血栓内全例でH3CitとeDNA共局在が検出され (Laridan et al.)、n=108では全血栓でNETsが検出されたが心原性血栓との関連は研究間で不一致があった。脳梗塞患者血漿中のeDNA・ヌクレオソーム・H3Cit上昇が脳卒中重症度・転帰と相関するという知見も複数の研究で示されている。
静脈血栓症 (VTE) へのNETs関与 — 初期血栓形成と再発リスク予測：DVTでのNETs役割を示す動物実験では、IVC stenosis/stasisモデルでのPAD4-/-マウスにおけるH3Cit陽性血栓形成消失と血栓サイズ縮小 (Martinod et al.)、DNase1によるIVC stenosis誘発DVT血栓形成抑制 (Brill et al., von Brühl et al.)、baboonの腸骨静脈DVTモデルでのVWFコーティングDNA-ヒストン複合体 (NETs) の血栓内検出 (Fuchs et al.) が報告されている。一方、IVC stasisモデルでは好中球枯渇やDNase1がWT (野生型) マウスの血栓サイズを縮小させなかったとする研究もあり (El-Sayed et al., Hisada et al.)、全ての静脈血栓症でNETsが決定的役割を持つわけではないことを示している。ヒト臨床研究では、DVT患者 (n=150) でヌクレオソームとNEがDVT非罹患群 (n=195) より高値でDVTリスクと3倍相関 (van Montfoort et al.)、DVT患者 (n=47) でeDNA・MPOが対照群 (n=28) より高値 (Diaz et al.) であった (Table 3)。高値のeDNAレベルが静脈血栓再発リスクと相関するという知見も示されており、NETs関連循環マーカーが再発リスク予測に応用できる可能性がある。
癌関連血栓症 (CAT) とNETs — 腫瘍誘発NET形成・EVとの相互作用・転移促進：癌は静脈・動脈双方の血栓症リスクを増大させることが知られており、NETsがその機序に関与することを示す複数のエビデンスが整理されている。腫瘍細胞によるNETs形成誘導として、AsPC-1 (ヒト膵癌細胞) を健常好中球と共培養するとrapidなNETs形成が誘導され、同様の効果はAsPC-1の条件培地やAsPC-1前培養血小板との共培養でも生じた (Abdol Razak et al.)。また胃癌患者から単離した好中球は健常対照群より自発的NETs形成が高値であり (Yang et al.)、癌は全身的な好中球プライミング状態 (NET形成増強) を引き起こすことが示唆される。癌患者由来好中球のNETsが対照血漿でのトロンビン・フィブリン産生を増強し、DNase1がこれを減弱させた (Yang et al.)。
腫瘍由来EVsとNETsの相互作用も重要な所見であり、4T1乳癌マウスモデルでは腫瘍由来EVsが好中球のNETs形成を誘導しEVsがNETs複合体に接着することが示された。膵臓腫瘍由来TF発現EVsもin vitroでNETsに接着した。癌関連血栓症の動物モデルで決定的な意義を持つ研究として、Demers et al. OncoImmunology 2016は、腫瘍担持マウスの好中球でin vitro NETs形成増強と肺内自発的DNA豊富血栓を報告した。Leal et al. SciRep 2017はDNase1が動脈血栓形成を完全に消失させ、静脈血栓を腫瘍担持マウスでのみ縮小させた (腫瘍なしの対照マウスには効果なし) という選択的効果を示した。Hisadaら (ヌードマウスにヒト膵臓腫瘍) では腫瘍担持マウスでH3Cit・eDNA上昇とIVC stasis血栓内NETs増加を観察し、DNase1または好中球枯渇が腫瘍担持マウスの血栓サイズを縮小 (対照マウスには無効) させた。Cederváll et al. (RIP1-Tag2膵島腫瘍・MMTV-PyMT乳癌マウス) では腫瘍担持マウスで血管内NETs蓄積による血管閉塞・血流障害・臓器ダメージが示され、DNase1またはPAD4阻害薬GSK484でこれら全て (NETs・血流障害・臓器ダメージ) が回復した (Figure 2)。
ヒト癌患者での循環NETs関連マーカーとして、肺癌・膵癌患者 (n=936の新規診断または寛解後再燃) での前向き研究においてH3CitがVTEリスクと相関したが、乳癌・脳腫瘍・大腸癌・前立腺癌では相関しなかった (Mauracher et al.)。癌患者では循環ヌクレオソーム・eDNA増加とDNase・ヌクレアーゼ活性の低下が同時に認められ (Oklu et al.)、NET産生増加と分解能低下という二重の異常が血栓リスクを高める可能性が示唆される。また自身らによる先行研究 (Thålin et al.) では基礎癌を有する脳梗塞患者でH3Cit・MPO・eDNAが上昇し、脳・冠動脈・肺微小血栓でH3CitおよびDNAとの共局在が示された (Table 4)。
考察/結論
NETs形成は血栓形成・伝播を促進する多様なメカニズム (血小板・赤血球・凝固因子VWF・TFの足場提供、内因系凝固経路の活性化、TFPIの分解による外因系凝固抑制解除、フィブリン溶解阻害) を通じて、動脈・静脈・癌関連血栓症のいずれにも寄与することが多数の動物実験・臨床研究により示された。
先行研究との違い: これまでの研究では個々の血栓性疾患におけるNETsの役割が断片的に報告されてきたが、本レビューは動脈、静脈、癌関連血栓症という異なる病態におけるNETsの共通した病態生理学的役割と、その多様なメカニズムを包括的に整理した点で、これまでのレビューと異なり、NETsが広範な血栓性疾患の共通の「悪役」である可能性を強調した。特に、NETsの形成経路がPAD4依存的経路だけでなく、NADPH oxidase非依存的経路やGSDMD依存的経路など複数存在すること、およびその測定上の課題についても詳細に議論した点は、今後の研究の方向性を示す上で新規性がある。
新規性: 本研究で初めて、NETsがアテローム硬化症の表面侵食型プラークに優位に存在するという知見や、癌関連血栓症において腫瘍由来EVsがNETs形成を誘導し、NETsが血栓形成を促進するメカニズムを統合的に提示した。これらの知見は、NETsが単なる炎症反応の副産物ではなく、特定の病態形成に積極的に関与する新規な分子標的となりうる可能性を強く示唆する。
臨床応用: PAD4阻害薬やDNase1を用いたNETs抑制は動物モデルで血栓を減少させつつ出血リスクを増大させないという点で治療標的として有望である。特に、DNase1は嚢胞性線維症の治療薬として既に臨床応用されており、その安全性プロファイルは確立されている。このため、DNase1を血栓溶解療法に併用することで、血栓の安定性を低下させ、tPA (組織型プラスミノーゲン活性化因子) による血栓溶解効果を増強する臨床応用が期待される。また、循環NETs関連マーカー (H3Cit, MPO-DNA複合体など) は、動脈・静脈血栓症の重症度や予後、癌関連VTEのリスク予測に応用できる可能性があり、臨床現場での診断・予後予測ツールの開発に繋がる。
残された課題: しかし、ヒトでの有効性・安全性は未確認である。今後の検討課題として、NETs形成の分子経路のさらなる解明、NETs測定法の標準化、およびNETsを標的とした治療薬のヒトにおける大規模臨床試験が必要である。特に、NETsが感染防御において重要な役割を果たすため、NETs形成を抑制することによる感染リスクの増大や、NETs分解産物がプロ凝固性を示す可能性など、治療介入による潜在的な副作用や残された課題を慎重に評価する必要がある。癌関連血栓症との関連では、腫瘍微小環境の好中球がNETsを介して転移を促進するメカニズムの解明が今後の重要課題である。Clinical-NECカテゴリへの分類は、肺神経内分泌癌を含む肺癌患者における癌関連血栓症および腫瘍免疫における好中球・NETsの役割理解のために参照される基礎的レビューとして位置づけられる。
方法
本レビューは、動脈・静脈・癌関連血栓症におけるNETsの役割に関する既存の動物モデル研究およびヒト臨床研究を網羅的に収集し、その知見を統合した。
データソースと検索戦略: PubMed、Embase、Cochrane Libraryなどの主要な医学データベースを用いて、「neutrophil extracellular traps」、「NETs」、「thrombosis」、「arterial thrombosis」、「venous thrombosis」、「cancer-associated thrombosis」、「atherosclerosis」、「myocardial infarction」、「ischemic stroke」などのキーワードを組み合わせて文献検索を実施した。検索期間はNETsが初めて報告された2004年から本レビューの執筆時点（2019年）までとした。
研究の選択基準: NETsの形成メカニズム、検出・定量方法、および動脈・静脈・癌関連血栓症におけるNETsの直接的または間接的な役割を報告したin vitro研究、in vivo動物モデル研究、およびヒト臨床研究を対象とした。特に、NETsの治療標的としての可能性を示唆する介入研究に重点を置いた。エビデンスの質は、各研究デザインの特性に基づいて定性的に評価された。
NETsの測定法: NETsの検出および定量に用いられた主要な方法には、以下のものが含まれる。
- 組織内免疫染色: DNA、H3Cit (シトルリン化ヒストンH3)、NE (好中球エラスターゼ)、MPO (ミエロペルオキシダーゼ) などのNETs構成要素の共局在を顕微鏡下で確認した研究。
- 血中バイオマーカーELISA: 血漿中のMPO-DNA複合体、H3Cit、ヌクレオソーム、eDNA (細胞外DNA)、NEなどのレベルを定量するELISA (酵素結合免疫吸着アッセイ) を用いた研究。
- フローサイトメトリー: 細胞表面またはEVs (細胞外小胞) に結合したNETs関連マーカーを検出するフローサイトメトリーベースのアッセイを用いた研究。
データ抽出と統合: 選択された各研究から、主要な所見、使用されたモデル (例: ApoE欠損マウス、IVC stasisモデル、ヒト膵癌細胞株AsPC-1)、患者コホートの特性 (例: 急性冠症候群、DVT、肺癌患者)、およびNETsの関与を示す具体的なデータ (例: 血栓サイズ、血管閉塞時間、バイオマーカーレベル、転帰との相関) を抽出した。これらのデータを統合し、各血栓性疾患におけるNETsの役割と、NETsを標的とした治療戦略の可能性について包括的な考察を行った。統計手法に関する具体的な記述は各研究に依存するため、本レビューでは個々の研究で用いられた統計解析法を個別に詳述するのではなく、その結果の解釈に焦点を当てた。