- 著者: Marco Antonio Cassatella, Nataliya K. Ostberg, Nicola Tamassia, Oliver Soehnlein
- Corresponding author: Oliver Soehnlein (Karolinska Institutet, Stockholm / LMU Munich, Germany)
- 雑誌: Trends in Immunology
- 発行年: 2019
- Epub日: N/A
- Article種別: Review
- PMID: 31155315
背景
好中球はヒト循環血中において最も豊富な白血球であり、全白血球の約50-70%を占め、細菌や真菌感染に対する生体防御の第一線として機能する。かつては「粗雑で非制御的な炎症細胞」と見なされてきたが、近年の研究により、その役割は微生物排除に留まらないことが明らかになってきた。例えば、好中球の循環寿命は以前考えられていたよりも長く、炎症環境下ではさらに延長される可能性が示唆されている (Meuret et al. 1973)。これにより、好中球が組織内で他の免疫細胞サブセット（樹状細胞、単球、マクロファージ、NK細胞、T細胞、B細胞）や非免疫細胞（血小板、間葉系幹細胞）と複雑な双方向性クロストークを形成し、免疫応答のオーケストレーションに積極的に関与することが示されている (Mantovani et al. 2011; Scapini and Cassatella 2014)。また、急性炎症の解消への積極的な関与、創傷治癒や組織修復への貢献も報告されている (Jones et al. 2016; Ferraro et al. 2019)。さらに、動脈硬化、神経変性疾患、肥満などの慢性炎症や腫瘍発生といった病態生理にも深く関与することが明らかになっており (Soehnlein et al. 2017; Coffelt et al. NatRevCancer 2016; Talukdar et al. 2012; Zenaro et al. 2015)、その多機能性が注目されている。
好中球は、骨髄での顆粒球造血 (granulopoiesis) の過程で顆粒タンパク質を産生・蓄積し（「ready-made」の武器庫）、炎症組織に動員された後にはde novoでサイトカインも合成するという二層の分子コミュニケーション機能を持つ。しかしながら、好中球のプロテオームの詳細な組成、顆粒下区画（サブコンパートメント）の特異性、骨髄での造血段階における顆粒タンパク質産生の制御機序、そして炎症組織におけるde novoサイトカイン合成の好中球特異的な転写・後転写調節機序については、プロテオミクスおよびエピゲノム解析技術の発展に伴い解明が進んでいるものの、これらの知見を統合的にレビューし、好中球の全体像を捉える試みは不足していた。特に、好中球が単なる破壊細胞ではなく、精緻な免疫調整器として機能するメカニズムについては、まだ多くの点が未解明である。本総説は、これらの知識ギャップを埋めることを目的としている。
目的
本総説の目的は、哺乳類好中球における顆粒タンパク質産生の骨髄での制御機序、de novoサイトカイン合成の特徴と分子制御、好中球由来プロテアーゼによるサイトカイン/ケモカインの機能的修飾、そして炎症および腫瘍発生における顆粒タンパク質とサイトカインの相乗機序を包括的にレビューし、これらの分子間相互作用を「好中球インタラクトーム」として概念化することである。さらに、このインタラクトームの解読が、炎症を抑制するための個々のタンパク質の治療的標的化、あるいは宿主防御を強化するための修飾された好中球由来タンパク質の送達といった治療的応用可能性を示唆することも目的とする。
結果
好中球プロテオームの多層解析と種間比較: プロテオミクスは、好中球の全細胞、細胞内区画（形質膜、細胞骨格、顆粒サブセット）、および細胞外通信構造体（サイコネーム、セクレトーム、NETs（NETome）、細胞外小胞）に広く適用されている。最大規模のヒト好中球プロテオーム研究では、安静状態の好中球で4,000タンパク質超が同定され、68人の健常人好中球ライブラリーとして疾患診断への応用が試みられた (Grabowski et al. 2019)。ヒトとマウスの代表的な上位50タンパク質を比較すると、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、ラクトフェリン（LTF）、リポカリン2（NGAL）、S100A8/A9、Annexin A1、カテプシンG（CTSG）、好中球エラスターゼ（ELANE）、ミエロブラスチン（PRTN3）、カテリシジン（CAMP）が両種共通の高存在顆粒タンパク質として同定された（Table 2）。一方、ヒト特異的にはα-defensin 3、アズロシジン、Bactericidal/Permeability-Increasing Protein (BPI) が豊富で、マウス特異的には顆粒球タンパク質、Serpin B1a、Chitinase-like protein 3、HSP A8が上位に位置した。サイトカインの代表格であるMacrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) の細胞当たりコピー数はラクトフェリンの約1/3（5.2百万 vs. 16.6百万コピー/細胞）にとどまり、顆粒タンパク質が量的に圧倒的に優位であることが示された (Grabowski et al. 2019)。慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者の血液好中球は健常人と比べてS100A12、S100A8、Superoxide Dismutase (SOD)、ELANE、Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) が上昇し、炎症・酸化ストレス関連タンパク質の発現増加が確認された (Shahriary et al. 2015)。
顆粒タンパク質産生のgranulopoiesisによるプログラミングと顆粒放出機序: 好中球顆粒は骨髄での成熟順序に依存して4種類に分類される: (1) アズール顆粒（MPO、CD63を含む一次顆粒）、(2) 特殊（二次）顆粒（リポカリン2、CD66b）、(3) 三次（ゼラチナーゼ）顆粒（MMP9、CD11b）、(4) 分泌小胞（アルブミン、CD45、CD16b）。顆粒形成は造血段階と連動し、「formed-first-released-last」モデルに従い、活性化時には一次顆粒が最後に放出される (Lacy 2006)。顆粒タンパク質産生の主要転写因子はC/EBPα、GFI1であり、後続成熟段階ではC/EBPε、ELF-1が制御する。骨髄芽球→前骨髄球（一次顆粒形成）→骨髄球/後骨髄球（二次・三次顆粒形成）→桿状核球→分葉核球の順序で成熟が進み、各ステップで特異的転写因子濃度が顆粒タンパク質の組成を決定する (Bjerregaard et al. 2003)。顆粒放出はSNARE複合体（v-SNARE VAMP-2/7、t-SNARE）、Rab27タンパク質、Munc13-14によって媒介される (Martín-Martín et al. 2000; Herrero-Turrión et al. 2008)。LPS、S100A9はゼラチナーゼ顆粒と特殊顆粒を誘導するが一次顆粒は誘導しない一方、fMLPは一次顆粒放出を誘導するなど、放出刺激の種類も顆粒選択的である (Almkvist et al. 2001; Simard et al. 2010; Niessen et al. 1991)。
好中球de novoサイトカイン合成の特性と分子制御: 好中球は炎症組織でde novoに多彩なサイトカインを合成する（Table 4）: 炎症促進性（IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-16、IL-18、MIF）、抗炎症性（IL-1ra、TGFβ1/2）、ケモカイン（CXCL1/2/8/9/10/11、CCL2/3/4/17/18/19/20/22/23）、免疫調節性（IL-22、IL-23）、TNFファミリー（TNF、FasL、TRAIL、APRIL、BAFF、RANKL）、コロニー刺激因子（G-CSF）、血管新生・線維化促進因子（VEGF、FGF2、HGF、Angiopoietin1）など。同数の好中球と単球をTLR8で刺激した場合のTNFα、IL-6、IL-12p40、IL-23、CXCL8産生量を比較すると、好中球はおおよそ2桁（pg/ml vs. ng/ml）少量であった (Tamassia et al. 2019)。ただしBAFF、IL-1ra、VEGF、CCL19、CCL23については好中球とPBMCでの産生量がほぼ同等という注目すべき例外が存在する (Scapini et al. 1999; Arruda-Silva et al. 2017)。好中球は他の免疫細胞に比べ総RNA量が少なくとも10-20倍低いため、per cell cytokine産生量は制限される (Cassatella 1999)。しかし循環中の好中球数はマクロファージの10-100倍に達するため、体内の総サイトカイン産生への貢献は無視できない (Puga et al. 2011)。IL-33で刺激されたマウス好中球（N(IL-33)）はIL-5、IL-4、IL-9、IL-13を産生し、これらを卵白アルブミン誘導アレルギー性喘息モデルに養子移入すると対照と比べて重篤な肺病変を誘発した (Sun et al. 2018)。CXCR2+好中球は出血性ショック・組織外傷モデルでIL-5を産生することも確認されている (Xu et al. 2017)。
好中球特異的サイトカイン転写・エピゲノム制御: 好中球と単球は共通のLineage-Determining Transcription Factors (LDTF) としてPU.1とCEBPβを共有しながら、好中球特異的にCEBPε、GFI-1、単球特異的にIRF8、KLF4を発現する (Ostuni et al. 2016)。Chromatin Immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) スナップショットでは、CXCL8遺伝子座はresting好中球・単球ともにPU.1・H3K27Ac修飾が既に存在し構成的に開いている（rapid transcription可能）（Figure 2）。IL6遺伝子座は好中球では安静時は閉じており（PU.1・H3K27Ac不在）、TLR4/TLR8刺激後にPU.1がchromatin accessibilityを開く（誘導性、単球より遅延）; 一方単球は構成的にopenで素早くIL6を転写する (Zimmermann et al. 2015)。IL10遺伝子座は好中球では刺激後もPU.1・H3K27Ac不在のままであり転写が生じない（refractory）; 単球では構成的にopenでIL10を迅速産生する (Tamassia et al. 2013)。TNF mRNAはGSK3α阻害で翻訳が増幅され (Giambelluca et al. 2014)、IL6 mRNAはmiR-142-3pおよびlet-7gで翻訳調節される (Huang et al. 2017)。BAFFとTRAILはG-CSFまたはIFNα/βで転写・翻訳されるが分泌小胞内に留まり、fMLF・免疫複合体・C5a・LTB4などのsecretagogueで放出が誘導される (Scapini et al. 2005; Cassatella et al. 2006)。同数の細胞でのTLR8刺激では、好中球のIL-6・TNFα産生はpg/mlオーダーであるのに対し、CD14+単球はng/mlオーダーと約2桁の差があることが複数のin vitro実験で実証されている (Tamassia et al. 2019)。
好中球プロテアーゼによるサイトカイン・ケモカイン機能修飾: 好中球由来中性セリンプロテアーゼ（NSPs: エラスターゼ [ELANE]、カテプシンG [CTSG]、プロテイナーゼ3 [PRTN3]）はNETs上に濃縮されて細胞外プロテオリシスを実行し、内因性・外因性サイトカイン（IL-1β、IL-6、TNF）およびケモカイン（CXCL8、CXCL9、CCL2）を切断して機能を修飾する (Hahn et al. 2019)。in vitro・in vivo実験（尿酸ナトリウム結晶誘導足浮腫モデル）で、NSP阻害によりIL-1β・CXCL8の切断が抑制されることが確認された (Hahn et al. 2019)。さらにMMP9（ゼラチナーゼ顆粒）はCXCL5のNH2末端を切断して走化活性を増強するなど、ケモカインのNH2末端プロセッシングにより受容体親和性・シグナル伝達特性を質的に変換する。この「局所炎症の質的制御」は、好中球が炎症微小環境を能動的にモデリングする機能を持つことを示す。NETs内に濃縮した顆粒タンパク質（NSPs、ヒストン、抗菌ペプチド）は、IL-8/CXCL8・GM-CSFとも協調して炎症の正のフィードバックループを形成し、慢性炎症（動脈硬化プラーク不安定化、血栓形成）や腫瘍形成（休眠がん細胞の覚醒、転移促進）に寄与することが動物モデル・ヒト検体研究で示されている (Silvestre-Roig et al. 2019; Albrengues et al. Science 2018; Park et al. SciTranslMed 2016)。
炎症・腫瘍発生における顆粒タンパク質とサイトカインの相乗機序: 慢性炎症（動脈硬化等）では好中球カテプシン・エラスターゼとTNFα・IL-1βが相乗的に組織損傷・プラーク不安定化を促進する (Ortega-Gomez et al. 2016)。腫瘍発生においてはMMP9がVEGFを基底膜から放出して血管新生スイッチをオン化し、エラスターゼが骨髄ニッチ形成・腫瘍細胞浸潤を支援し、VEGF・Oncostatin M・HGFなどの腫瘍促進サイトカインが相乗的に機能する (Houghton et al. 2010)。NETs構成タンパク質はIL-8/CXCL8・GM-CSFと協調して免疫細胞の正フィードバックループを形成し腫瘍進行を加速させる (Grégoire et al. 2015)。例えば、マウス肺がんモデルにおいて、NET結合型好中球エラスターゼとMMP9がラミニンを連続的に切断し、休眠がん細胞の増殖を誘発するエピトープを露出させることが示された (Albrengues et al. 2018)。一方、腫瘍形成における好中球特異的なgermline-knockout実験の欠如が、in vivo機能の確定的な解明を困難にしている。
考察/結論
先行研究との違い: 本総説は、好中球プロテオームの多層解析を統合し、顆粒タンパク質とサイトカインの相互作用を「好中球インタラクトーム」として概念化した点に新規性がある。特に重要な貢献は以下の3点である。第一に、「ready-made顆粒タンパク質」と「de novoサイトカイン合成」という二層システムが好中球を真の「免疫調整器」として機能させるという視点であり、好中球を単純な破壊細胞と見てきた従来の概念からの根本的転換を示す。顆粒タンパク質はgranulopoiesisによりプログラムされた即時放出システムとして機能し、de novoサイトカインは炎症局所の状況依存的シグナルに対応した精緻な応答として機能する。このダブルシステムが好中球を短命エフェクターでありながら多機能な免疫調整器として位置づける点は、これまでの好中球研究と対照的である。
新規性: 第二に、NSPsによるケモカイン修飾という機序は、局所炎症の「量的変化」のみならず「シグナルの種類・強度の質的変換」において好中球が能動的な役割を持つことを示す。例えばMMP9によるCXCL5 NH2末端切断による走化活性増強、IL-1βの切断活性化、CXCL8/CXCL9/CCL2の機能改変は、好中球が自らの産生物だけでなく周囲のサイトカインネットワーク全体を能動的にリモデリングすることを意味し、本研究で初めてその包括的なメカニズムが提示された。
臨床応用: 第三に、好中球の細胞数的優位性（循環血中最多、マクロファージの10-100倍）が、少量のper cell産生サイトカインでも体内総産生への無視できない貢献をもたらすという「数の論理」は、個別タンパク質の治療標的としての重要性を支持する。治療応用として、個々の顆粒タンパク質・プロテアーゼの選択的阻害（慢性炎症・動脈硬化・腫瘍発生の抑制）と、修飾された好中球由来タンパク質の送達による宿主防御増強の二方向アプローチが提唱された。特にNET上に濃縮されたNSPsのプロテオリシス活性が慢性炎症（動脈硬化プラーク不安定化）や腫瘍（休眠がん細胞の覚醒・転移）に貢献するという新概念は、NET-NSP複合体を標的とした治療薬開発の臨床応用への論拠となる。
残された課題: 今後の検討課題として、顆粒タンパク質産生の疾患別・好中球サブセット別プロファイルの詳細解析、in vivoでの好中球インタラクトームの完全解明、de novoサイトカイン合成に関わる代謝経路・細胞内貯蔵機序の解明、ならびに好中球特異的Creドライバー（Ly6G-Cre等）を用いた個別タンパク質の機能実証が挙げられる。また、好中球純度の担保（混入単球・MDSCによる偽陽性シグナル排除）が定量的サイトカイン研究の再現性確保に不可欠であることが本総説で強調されており、標準化プロトコルの普及が今後の研究基盤となる。これらのlimitationを克服することで、好中球の生物学的役割のさらなる理解と、新たな治療戦略の開発が期待される。
方法
本論文はレビュー論文であるため、特定の実験方法論は該当しない。しかし、本総説の作成にあたっては、好中球のプロテオーム、顆粒タンパク質の産生と放出、サイトカイン合成、およびそれらの生物学的役割に関する最新の知見を網羅的に収集し、分析した。具体的には、PubMed検索に基づき、好中球のプロテオミクス解析、顆粒タンパク質の産生と放出、サイトカイン産生と調節メカニズム、および顆粒タンパク質とサイトカインの相乗作用について、2019年までの研究を網羅的に評価した。本レビューでは、ヒトおよびマウスの好中球プロテオームに関する大規模な定量的プロテオミクス研究、顆粒球造血における転写因子と顆粒形成の関連を解析した研究、好中球におけるde novoサイトカイン合成の転写・後転写調節メカニズムを解明した研究、好中球由来プロテアーゼによるサイトカイン・ケモカインの機能修飾に関するin vitroおよびin vivo研究、そして炎症および腫瘍発生における好中球顆粒タンパク質とサイトカインの相乗作用を検討した動物モデルおよびヒト検体研究が対象となった。
特に、好中球のプロテオーム解析では、全細胞、細胞内区画（形質膜、細胞骨格、顆粒サブセット）、および細胞外通信構造体（サイコネーム、セクレトーム、Neutrophil Extracellular Traps (NETs)（NETome）、細胞外小胞）に適用された質量分析ベースのデータが統合された。顆粒タンパク質産生については、C/EBPα、GFI1 (Growth Factor Independence-1)、C/EBPε、ELF-1 (E74-like factor 1) などの主要な転写因子が顆粒球造血の各段階でどのように顆粒タンパク質の組成を決定するか、またSNARE複合体やRab27タンパク質が顆粒放出をどのように媒介するかについて詳細に検討された。サイトカイン合成に関しては、Toll-like Receptor (TLR) アゴニストなどの刺激に応答したde novo合成の特性、Interleukin (IL)-6、Tumor Necrosis Factor (TNF)α、IL-10などのサイトカイン遺伝子座における好中球と単球間のエピゲノム制御の違い（PU.1やH3K27Ac (Histone H3 Lysine 27 Acetylation) 修飾の有無）、およびmRNAの翻訳調節（GSK3α阻害、miRNAによる調節）に関する報告が分析された。
さらに、好中球由来プロテアーゼ（エラスターゼ、カテプシンG、プロテイナーゼ3、Matrix Metalloproteinase (MMP) 9）がIL-1β、IL-6、TNF、CXCL8、CXCL9、CCL2などのサイトカインやケモカインを切断し、その機能を修飾するメカニズムについて、in vitro酵素アッセイや尿酸ナトリウム結晶誘導足浮腫モデルなどのin vivo実験結果が評価された。最終的に、これらの分子が慢性炎症（動脈硬化、血栓形成）や腫瘍発生（休眠がん細胞の覚醒、転移促進）においてどのように相乗的に作用するかについて、動物モデルやヒト検体を用いた研究結果が統合され、「好中球インタラクトーム」という概念が構築された。本総説では、好中球研究における純度確保の重要性（Box 1）やRNA分解防止のためのプロトコル（Tamassia et al. 2014）など、方法論的な課題についても言及している。