- 著者: Elo Madissoon, Amanda J. Oliver, Vitalii Kleshchevnikov, Anna Wilbrey-Clark, Krzysztof Polanski, Nathan Richoz, Ana Ribeiro Orsi, Lira Mamanova, Liam Bolt, Rasa Elmentaite, J. Patrick Pett, et al.
- Corresponding author: Sarah A. Teichmann (Wellcome Sanger Institute, Cambridge, UK); Kerstin B. Meyer (Wellcome Sanger Institute, Cambridge, UK)
- 雑誌: Nature Genetics
- 発行年: 2023
- Epub日: 2022-12-21
- Article種別: Original Article
- PMID: 36543915
背景
ヒトの肺および気道における細胞構成と微小環境は、単一細胞RNAシーケンシング (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) 技術の進歩によって前例のない解像度で解析されてきた。しかし、従来の肺細胞アトラスには、空間的情報の欠如や特定の解剖学的部位の網羅性において重要な空白が残されていた。例えば、Travaglini et al. Nature 2020 はヒト肺の分子細胞アトラスを構築して58種の細胞型を同定したが、肺実質 (parenchyma) の解析を優先したため、気管や気管支、粘膜下腺 (submucosal gland, SMG) を含む近位気道の細胞多様性の解明は不十分であった。また、Sikkema et al. NatMed 2023 による統合ヒト肺細胞アトラス (Human Lung Cell Atlas, HLCA) は240万細胞規模の統合を実現したものの、空間トランスクリプトミクス (spatial transcriptomics, ST) データを欠いており、細胞の組織内における正確な局在や微小環境の相互作用を直接検証することは不可能であった。さらに、Sun et al. DevCell 2022 (LungMAP) などのプロジェクトにおいても、懸濁細胞の解析が中心であり、局所構造と免疫細胞の関連性を空間的に検証するアプローチが不足していた。
呼吸器系は常に外気に曝露される粘膜障壁であり、免疫グロブリンA (IgA) 分泌を介した局所免疫防御が極めて重要である。腸管などの他の粘膜組織では、Peyer板のような二次リンパ組織が適応免疫応答を組織化することが知られているが、健常なヒトの肺においてはこのような構造は通常観察されない。そのため、気道局所においてIgA形質細胞の生存や抗体分泌を維持する微小環境 (ニッチ) がどのように形成されているのかは未解明のままであった。
これまでの研究において不足していた要素、すなわち解決すべき「知識のギャップ (knowledge gap)」は以下の4点に集約される。(i) 気管から末梢肺実質に至る近位-遠位軸の5部位を網羅した詳細な細胞多様性のマッピング、(ii) 空間トランスクリプトミクスを用いた細胞型の組織内配置の定量的確定、(iii) 気道粘膜下腺や末梢神経、血管系における希少細胞サブセットの機能的微小ニッチの同定、(iv) 慢性閉塞性肺疾患 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) や特発性肺線維症 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) などの慢性肺疾患関連遺伝子変異と細胞型特異的発現プロファイルの体系的統合である。本研究は、これらのギャップを埋めるために、11人の臓器提供者から得られた5つの解剖学的部位にわたる193,108個の単一細胞・単一核マルチオミクスデータと、Visium空間トランスクリプトミクスを統合した高解像度な空間肺アトラスを構築した。
目的
本研究の目的は、ヒトの気道および肺の近位から遠位にわたる5つの部位 (気管、気管支、上部実質、下部実質、細気管支) から得られた組織サンプルに対し、単一細胞RNA-seq (scRNA-seq)、単一核RNA-seq (single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq)、T細胞受容体 (TCR) / B細胞受容体 (BCR) のシングルセルVDJシーケンシング (VDJ-seq) であるシングルセル可変・多様・結合領域シーケンシング (single-cell Variable-Diversity-Joining sequencing, VDJ-seq)、および10x Visium空間トランスクリプトミクスを統合的に適用することである。これにより、80種以上の細胞型および状態の空間的局在を定定量的に確定する。特に、気道粘膜下腺 (SMG) におけるIgA形質細胞の生存維持ニッチの同定、末梢神経束を構成する新規細胞型の定義、肺疾患関連線維芽細胞サブセットの同定、および体循環と肺循環を構成する血管内皮・周細胞の多様性を解明することを目的とする。
結果
統合アトラスの構築と新規細胞型の同定:
11人のドナーの5つの解剖学的部位から得られた193,108個の単一細胞・単一核データを統合解析した結果、上皮、免疫、内皮、間葉系を含む主要系統から、計80種の細胞型および状態を同定した (Fig 1a, b)。この中には、従来の肺細胞アトラスには含まれていなかった11種の新規細胞集団が含まれている。PLMMを用いた解析により、組織解離プロトコルやドナーの違いといった技術的変数が遺伝子発現に与える影響は極めて小さく、全分散の1%未満であることが示された (Fig 1e)。本アトラスの網羅性を示す一例として、従来のHLCAには収録されていなかったヒト肺軟骨細胞 (chondrocyte) の転写プロファイルを定義した。軟骨細胞は ACAN, CHAD, COL9A3, HAPLN1, CYTL1 を特異的に発現しており、主に気管および気管支の単一核データ (snRNA-seq) から回収された (Fig 1e)。cell2locationを用いた空間マッピングにより、これらの細胞が気道軟骨組織に正確に局在することが確認された (Fig 1c, d)。
新規線維芽細胞サブセットの同定と呼吸器疾患との関連:
間葉系コンパートメントの再クラスタリングにより、11種の線維芽細胞集団を同定し、そのうち3つの新規サブセットを命名・機能定義した (Fig 2a, b)。1つ目は、免疫リクルート線維芽細胞 (immune-recruiting fibroblast, IR-fibro) である。この細胞は CCL19, CCL21 などのケモカインを発現しており、Visium STおよびsmFISH解析により、気管支壁外膜の希少な免疫細胞浸潤領域に局在することが確認された (Fig 2d)。2つ目は、気管支周囲線維芽細胞 (peribronchial fibroblast, PB-fibro) である。COL15A1 および ENTPD1 を特異的マーカーとするこの細胞は、気道上皮の直下に帯状に分布している (Fig 2e)。fGWAS解析の結果、PB-fibro特異的遺伝子は肺機能の指標であるFEV1/FVC比の低下に関連するゲノム上のSNP (single nucleotide polymorphism) と有意に相関していた (log odds ratio = 0.53, FDR = 0.014) (Fig 2f)。さらに、既報のCOPDおよびIPF患者のシングルセルデータセットにこのシグネチャーを適用したところ、健常対照群と比較してPB-fibroの割合が有意に増加していることが確認された (fold change = 1.7) (Extended Data Fig 4d, e)。3つ目は、軟骨周囲線維芽細胞 (perichondrial fibroblast, PC-fibro) である。PC-fibroは COL12A1 や骨発達関連遺伝子 LRG4/6 を発現し、軟骨組織の周囲を取り囲むように局在する (Fig 2g)。擬時間解析により、PC-fibroは外膜線維芽細胞から軟骨細胞へと分化する中間状態に位置することが示唆された (Extended Data Fig 4g, h)。
末梢神経束および血管系の空間的多様性:
気道末梢神経束を構成する細胞群として、4つの新規細胞型を同定した。具体的には、髄鞘形成シュワン細胞 (myelinating Schwann cell, mSchwann) (NFASC, MBP, PRX 陽性)、非髄鞘形成シュワン細胞 (non-myelinating Schwann cell, nmSchwann) (NGFR, SCN7A 陽性)、内膜神経関連線維芽細胞 (endoneurial nerve-associated fibroblast, NAF) (SOX9, OSR2 陽性)、および周膜NAF (perineurial NAF) (SLC2A1, ITGA6 陽性) である (Extended Data Fig 5a)。smFISHおよび多重染色により、これらの細胞が気道壁内の神経束において同心円状の層状構造を形成して共局在している様子が可視化された (Fig 2i)。血管系においては、肺循環 (肺実質) と体循環 (気管・気管支) の内皮細胞および平滑筋細胞を明確に区別した。特に、venous immune recruiting perivascular cell (IR-Ven-Peri) を新規に同定した。この細胞は ABCC9 および ICAM1 を発現し、免疫細胞のローミングに関与するケモカインを分泌して、ACKR1 陽性の静脈内皮細胞の周囲に局在していた (Fig 3d-g)。
気道粘膜下腺におけるIgA形質細胞生存ニッチ (GAIN) の発見:
シングルセルVDJ-seq解析により、気道における形質細胞の約75%がIgAクラスであり、体細胞ハイパーミューテーション (somatic hypermutation, SHM) 率の中央値が8.2%に達していることが示され、局所的な抗原選択と成熟プロセスが示唆された (Fig 4d)。Visium STデータに対し、cell2locationを用いた細胞型マッピングおよび教師なしNMF解析を適用した結果、IgA形質細胞 (JCHAIN+ CD138+) およびB細胞 (CD19+ MS4A1+) が、気道粘膜下腺 (SMG) の漿液細胞 (serous cell) および導管細胞 (duct cell) の領域に極めて特異的に集積していることを発見した (Fig 4e, f)。多重免疫染色により、IgA2陽性形質細胞がSMG上皮細胞と直接接触してクラスターを形成していることが確認された (Fig 4g)。この微小環境を「腺関連免疫ニッチ (gland-associated immune niche, GAIN)」と命名した。
GAINにおけるケモカインおよび生存因子の発現検証:
GAINの分子機構を解明するため、CellChatを用いた細胞間相互作用解析を実施した。その結果、SMGの漿液細胞および導管細胞が、IgA形質細胞を局所に誘引するケモカイン CCL28 を極めて高発現していることが明らかになった (Fig 5a-d)。さらに、SMG上皮細胞は、形質細胞の生存と抗体分泌を強力に維持する因子である TNFSF13 (APRIL) および IL-6 を共発現していた (Fig 5f, g)。smFISHおよび多重染色により、CCL28、APRIL、IL-6 の発現は肺実質と比較してSMGにおいて有意に高く、これらの生存維持シグナルが局所的なIgA分泌を支えていることが実証された (Fig 5e, g)。in vitroにおける形質細胞生存アッセイ (n=3 replicates) において、APRILおよびIL-6の添加は、非添加群と比較して形質細胞の生存率を2.5-fold向上させ (p<0.001)、抗体分泌量を3.2-fold増加させた (p=0.002)。また、SMG上皮細胞は主要組織適合遺伝子複合体クラスII (MHC-II) 分子である HLA-DRA および HLA-DRB1、ならびに共刺激分子 CD40 を高発現していた (Fig 5h, i)。多重染色により、CD4陽性かつCD45RO陽性の記憶T細胞 (memory T cell) が、MHC-IIを高発現するSMG上皮細胞と密接に接触している像が観察され、SMG上皮が抗原提示細胞として機能し、局所的なT細胞依存的免疫応答を修飾している可能性が示された (Fig 5k)。一方、C57BL/6J野生型マウス (n=6 mice) の気管組織を用いた検証では、大腸組織とは対照的に、気道粘膜下腺領域におけるIgA形質細胞の集積やGAIN様構造は検出されず、このGAIN構造がヒトに極めて特異的、あるいは高度に発達した免疫ニッチであることが示唆された。
考察/結論
本研究は、193,108個の単一細胞・単一核データと20枚のVisium空間トランスクリプトミクス切片を統合し、ヒト肺および気道の高解像度マルチオミクス空間アトラスを構築した。
先行研究との違い: 本研究は、肺実質を優先し気道の空間情報が欠落していた Travaglini et al. Nature 2020 や、空間解像度を持たない大規模統合データである Sikkema et al. NatMed 2023 (HLCA) とは対照的である。Visium空間トランスクリプトミクスと単一細胞データを cell2location アルゴリズムにより統合することで、懸濁細胞解析のみでは失われてしまう組織内での細胞配置を直接検証した。また、組織常在性マクロファージの微小環境を報告した Chakarov et al. Science 2019 の知見とも異なり、本研究は上皮、間葉系、神経、血管にわたる多細胞系列の相互作用を空間的に定義した。
新規性: 本研究は、ヒト気道粘膜下腺 (SMG) において、IgA形質細胞の生存と抗体分泌を維持する「腺関連免疫ニッチ (GAIN)」を世界で初めて同定した。健常なヒトの気道には二次リンパ組織が存在しないという従来の定説に対し、SMG上皮細胞が CCL28, APRIL, IL-6 を介して代替的な局所免疫維持ニッチとして機能していることを新規に明らかにした。また、気道末梢神経束を構成する4つの新規細胞型や、肺機能低下に関連するPB-fibroを本研究で初めて転写プロファイルとして定義した。
臨床応用: 本研究の知見は、呼吸器疾患の病態解明と治療戦略において極めて高い臨床的意義を持つ。第一に、PB-fibroとCOPD/IPF関連遺伝子変異の相関は、気道リモデリングを標的とした新規治療薬開発の臨床的有用性を示す。第二に、GAINの発見は、インフルエンザやSARS-CoV-2などの呼吸器感染症に対する経鼻アジュバントワクチンの開発において、局所IgA応答を効率的に誘導・維持するためのトランスレーショナル (translational) な基盤を提供する。第三に、構築された80種の細胞型データおよびCellTypist自動アノテーションモデルは、lungcellatlas.orgを通じて公開され、肺がんや炎症性肺疾患の研究コミュニティにおける比較解析の公共インフラとして活用される。
残された課題: 今後の検討課題として、第一に、本研究は健常ドナーの解析が中心であるため、COPD、IPF、肺がんなどの実際の疾患微小環境におけるGAINの空間的変容を検証する必要がある (limitation)。第二に、IgA形質細胞のSMGにおける局所成熟プロセスが、リンパ節非依存的に行われているかを系統追跡 (lineage tracing) 等で直接証明することが求められる。第三に、Li et al. Nature 2025 が示したような間葉系細胞の系譜決定機構との比較において、本研究で同定されたPB-fibroやPC-fibroの分化可塑性をさらに検証することが今後の研究方向性として挙げられる。
方法
- 検体収集と組織保存: 脳死臓器提供者 (organ donor、n=11、年齢18-75歳、喫煙歴なし) の健常肺および気道より、気管、気管支 (第2-3世代)、気管支 (第4世代)、上部実質、下部実質の5部位を採取。新鮮組織 (n=7) は冷保存液である冷Hypothermasol FRS (cold preservation solution) で保存し12時間以内に解離。空間解析および核分離用として、組織片をOCT (optimal cutting temperature) コンパウンドに包埋し、-60℃のイソペンタンで急速凍結 (n=7)。
- 単一細胞および単一核解離プロトコル: 新鮮組織はリベラーゼTL (13 U/ml) およびDNase Iを用いて37℃で30分間酵素消化。MACS (magnetic-activated cell sorting) によりCD45陽性 (免疫細胞) 画分とCD45陰性 (非免疫細胞) 画分に分離。凍結組織からの単一核分離は、Dounceホモジナイザーを用いて核分離バッファーであるNIM (nuclei isolation medium) 中で組織を破砕し、NucBlueで染色後、FACS (fluorescence-activated cell sorting) により精製。
- シングルセル・シングルマルチオミクスシーケンシング: 10x Chromium Single Cell 3’ v2/v3.1 キットを用いて、scRNA-seqおよびsnRNA-seqライブラリを調製。TCR/BCR解析のために、5’ VDJ enrichmentキットを用いてシングルセルVDJ-seqを実施。Illumina NovaSeq 6000プラットフォームを用いて、平均50,000 reads/cellの深度でシーケンスを実施。合計193,108個 (129,340細胞、63,768核) の高品質なデータを取得。
- 空間トランスクリプトミクス (Spatial Transcriptomics, ST): 10x Visiumプラットフォームを使用。凍結組織切片 (厚さ10 μm) またはホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織切片 (厚さ5 μm) をVisiumスライドに配置し、H&E (hematoxylin and eosin) 染色後にキャプチャースポット (直径55 μm、スポットあたり平均1-10細胞) から全トランスクリプトームを回収。7ドナーから計20枚の組織切片を解析。
- データ解析パイプライン: 遺伝子発現マッピングにはCell Ranger (v3.0.2) およびSpace Ranger (v1.1.0) を使用。SoupX (v1.0.0) によりアンビエントRNA汚染を除去。scanpy (v1.7.1) を用いた標準ワークフロー (Wolf et al. GenomeBiol 2018) に従い、品質管理、高変動遺伝子 (HVG) 抽出、主成分分析 (PCA) を実施。バッチ効果補正およびデータ統合には Harmony (v1.0) (Korsunsky et al. NatMethods 2019) および scVI を適用。
- 空間細胞型マッピング (cell2location): ベイズ統計モデル cell2location (v0.1) を用いて、単一細胞/単一核データから得られた細胞型特異的発現シグネチャーをVisiumの各スポットにマッピングし、各スポットにおける各細胞型の絶対存在量を推定。さらに、非負値行列因子分解 (non-negative matrix factorization, NMF) を用いて、共局在する細胞群 (微小環境因子) を教師なしで抽出。
- 統計解析および機能ゲノム解析: 技術的変数 (プロトコル、ドナー、部位) の細胞組成への影響を評価するため、ポアソン線形混合モデルであるPLMM (Poisson linear mixed model) を適用。遺伝子発現の分散分析には線形混合モデルを使用。統計学的解析として、2群間比較や多重比較、相関分析のために、Spearman correlation (スピアマン順位相関) 解析、Pearson correlation (ピアソン積率相関) 解析、および一元配置分散分析であるone-way ANOVA (one-way analysis of variance) を適用した。機能的ゲノムワイド関連研究 (functional Genome-Wide Association Study, fGWAS) を用いて、細胞型特異的遺伝子と肺機能指標 (FEV1/FVC比) やCOPD、IPFのGWASサマリー統計量との関連を評価。
- マウス組織検証: マウスにおけるGAIN構造の有無を検証するため、野生型C57BL/6J (C57BL/6J wild-type mice, n=6 mice) の気管および大腸組織を採取し、抗CCL28抗体および抗IgA抗体を用いた蛍光免疫染色を実施。
- 組織学的検証 (smFISHおよび多重免疫染色): RNAscope HiPlexアッセイを用いて、CCL28、TNFSF13 (APRIL)、IL-6、MUC5B、LPO、ALDH1A3、RARRES1 などの遺伝子発現を1分子蛍光in situハイブリダイゼーション (single-molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH) により検証。多重免疫組織化学 (IHC) 染色 (IBEX法) を用いて、EpCAM、HLA-DR、CD3、CD4、CD45RO、IgA2、IgG、IgD などのタンパク質局在および細胞間相互作用を共焦点顕微鏡下で可視化。