- 著者: Vaishnavi A, Capelletti M, Le AT, Kako S, Butaney M, Ercan D, Mahale S, Davies KD, Aisner DL, Pilling AB, Berge EM, Kim J, Sasaki H, Park S, Kryukov G, Garraway LA, Hammerman PS, Haas J, Andrews SW, Lipson D, Stephens PJ, Miller VA, Varella-Garcia M, Janne PA, Doebele RC
- Corresponding author: Robert C. Doebele, MD, PhD (Division of Medical Oncology, University of Colorado School of Medicine, Aurora, Colorado, USA); Pasi A. Janne, MD, PhD (Lowe Center for Thoracic Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, Massachusetts, USA)
- 雑誌: Nature Medicine
- 発行年: 2013
- Epub日: 2013-10-27
- Article種別: Brief Communication (Translational genomics + preclinical drug discovery + index patient case)
- PMID: 24162815
背景
肺癌における経口活性型kinase inhibitor (crizotinib・erlotinib・gefitinib) は ALK fusion (Kwak et al. NEnglJMed 2010) または EGFR mutation陽性NSCLCで標準化学療法を超える効果を示し、precision medicineの patternが確立されつつあった。これまでの研究では、ROS1・RET・FGFR1・FGFR2 (Fibroblast Growth Factor Receptor 2)・FGFR3 (Fibroblast Growth Factor Receptor 3) を含む追加oncogenic fusionsが肺癌で同定され、各々therapeutic intervention potentialを示している (Davies 2012 Davies et al. ClinCancerRes 2012、Takeuchi 2012)。
これまでの研究で、NTRK1 (Neurotrophic Tyrosine Receptor Kinase 1、TRKA [Tropomyosin Receptor Kinase A] protein encoding gene、high-affinity Nerve Growth Factor [NGF] receptor) の fusionは大腸癌 (TPM3-NTRK1) や甲状腺癌 (TFG-NTRK1、TPR-NTRK1) で報告されていたが、肺癌での同定は欠如していた。EGFR・KRAS・ALK・ROS1・RET・HER2等の既知ドライバー陰性 lung adenocarcinoma が一定割合存在し、これら「driver-negative」症例に潜む新規therapeutic targetの探索が精力的に進められていた。
これまでの研究 (earlier work) では、targeted next-generation sequencing (NGS) を含む comprehensive genomic profiling がdriver-negative NSCLCに対する有用なtool として確立されつつあったが、何が足りなかったかは「NTRK1 fusion が肺癌のoncogenic driver として存在するかどうかの直接的evidenceの完全な欠如」と「lung-cancer-specific NTRK1 fusion partnersの同定およびそれらに対応するTRK kinase inhibitor sensitivity解析の欠如」であり、未解明の重要なギャップであった。本Brief Communication はこのギャップを埋め、肺癌におけるNTRK1 fusion の oncogenic role を世界で初めて系統的に実証した。
目的
既知oncogenic alterations陰性のlung adenocarcinoma 患者を対象に、(1) targeted DNA NGSによる NTRK1 fusion同定、(2) 同定されたfusion (MPRIP-NTRK1、CD74-NTRK1) の構造解析と機能評価 (293T・NIH3T3・Ba/F3細胞)、(3) NTRK1 fusion-positive細胞のtumourigenicity (nude mouse xenograft・anchorage-independent growth・IL-3非依存性増殖)、(4) TRK kinase inhibitor (ARRY-470・lestaurtinib・crizotinib) に対する感受性評価、(5) FISH-basedスクリーニングによる頻度確定、(6) Index patient (MPRIP-NTRK1) のcrizotinib臨床投与結果の報告を目的とした。
結果
MPRIP-NTRK1融合の同定と機能的活性化 (Fig 1)：36例NGSスクリーニングで female never-smoker lung adenocarcinoma 1例でMPRIP (myosin phosphatase-Rho-interacting protein、actin cytoskeleton regulation関与) 5’ end + NTRK1 3’ endのin-frame fusionを同定 (MPRIP-NTRK1)。MPRIPは3 coiled-coil domains (CCDs) を含み、ALK・ROS1・RET fusion partners (EML4・CD74・KIF5B等) と同様 CCD-mediated dimerization → kinase domain activationを担う設計と考えられた。RT-PCRでexon junction + mRNA expression確認、患者由来 early-passage cells CUTO-3でも fusion protein RIP-TRKA発現確認。Immunoblot解析で n=3 replicates、CUTO-3 cells および293T cellsに MPRIP-NTRK1 cDNA exogenous expression時に TRKA autophosphorylation (Y496・Y680・Y681) 確認、kinase-dead variant では消失。
CD74-NTRK1融合の同定 (Fig 1)：第2症例も female never-smoker lung adenocarcinomaで、CD74 (Major Histocompatibility Complex [MHC] class II invariant chain encoding、CD74-ROS1 fusion既知partner) + NTRK1のin-frame fusionを同定 (CD74-NTRK1)。CD74-TRKA proteinはplasma membrane局在予測。293T cell実験で同様の TRKA autophosphorylation + ERK1/2 activation確認、kinase-dead variantで消失。
Tumourigenicity実証—Ba/F3・NIH3T3 models (Fig 1d-e)：Ba/F3 cellsへのMPRIP-NTRK1またはCD74-NTRK1 expressionで IL-3非依存性 proliferation (n=3、EML4-ALK positive controlと同等) 達成、empty vector またはkinase-dead variantは proliferation不能。NIH3T3 cellsで anchorage-independent growth + nude mouse xenograft (5 mice/group) で tumour formation確認、empty vector + kinase-dead variantsは形成せず。Knockdown of TPM3-NTRK1 in KM12 cells (colorectal control) もproliferation抑制、NTRK1 fusion oncogene roleをcorroborate。
頻度: 3/91例 (3.3%) — driver-negative lung adenocarcinomaのminor subset：追加56例にFISH適用 (break-apart probe) で1例 additional positive (third NTRK1 rearrangement)、合計91例の既知driver mutation陰性肺癌中 3例 (3.3%) NTRK1 fusion確認 vs 88例 negative (96.7%)。TCGA (The Cancer Genome Atlas) 230 lung adenocarcinomas transcriptome解析ではNTRK1 fusion検出されず、Korean 87 lung adenocarcinoma transcriptome (Seo 2012、personal communication) でも oncogenic NTRK1 fusion含まず、本研究のFISH/NGS combo screening uniqueness示唆。
TRK kinase inhibitor sensitivity (Fig 2)：ARRY-470 (selective TRKA/B/C inhibitor、後のentrectinib・larotrectinib前身)・lestaurtinib (CEP-701) ・crizotinibでMPRIP-NTRK1+ CD74-NTRK1 expressing cellsを処理、ARRY-470・CEP-701が顕著にTRKA autophosphorylation抑制 (vs DMSO control)、crizotinibは弱め抑制。MAPK + AKT downstream pathways も Ba/F3 cells (exogenous MPRIP-NTRK1 + CD74-NTRK1) で抑制。CUTO-3 (endogenous RIP-TRKA) + KM12 (endogenous TPM3-TRKA) でも 3 drugs全て同様抑制。Ba/F3 proliferation抑制はCEP-701 + ARRY-470で最大、crizotinibは less potent (but EML4-ALK・SDC4-ROS1 inhibitionと同等range)、ARRY-470は other oncogene Ba/F3 (EGFR・ALK・ROS1) は抑制せず selectivity示した。3 drugs全てが KM12 cellsで G1 cell cycle arrest + apoptosis誘導。
Index patient crizotinib clinical activity：MPRIP-NTRK1 index patient が standard therapies + 利用可能 TRKA inhibitor trials欠如のため、clinical trial外 crizotinib (250 mg twice daily) を consent後投与。Minor radiographic response + serum CA125 (cancer antigen 125) 低下を観察したが、約3ヶ月後 disease progression。Modest clinical activity は in vitro crizotinib weak TRKA inhibitionと整合、non-TRKA kinase effects (ALK・ROS1・MET) による限定的活性と解釈。
考察/結論
本Brief Communication は、肺癌における初の NTRK1 fusion 報告として、MPRIP-NTRK1 と CD74-NTRK1 という2つの新規fusionが既知driver mutation陰性 lung adenocarcinoma の3.3% (3/91例) に存在し、constitutive TRKA kinase activity (autophosphorylation Y496/Y680/Y681 + downstream ERK1/2 activation) を介して oncogenic potential を発揮、TRK kinase inhibitor (ARRY-470・lestaurtinib・crizotinib) で sensitiveであることを系統的に実証した歴史的論文である。Index patient における crizotinib minor radiographic response は、より selective TRK inhibitor (ARRY-470 type) の臨床開発正当性を支持した。
これまでの研究との違いとして、NTRK1 fusionは TPM3-NTRK1 (colorectal cancer、Martin-Zanca 1986)、TFG-NTRK1 + TPR-NTRK1 (thyroid cancer、Greco 1992) として先行研究で報告されていたが、肺癌での同定は欠如していた (これとは異なる本研究の lung-cancer-specific findings)。Davies 2012の先行研究 (Davies et al. ClinCancerRes 2012) のCD74-ROS1 fusion報告と並行し、CD74が NTRK1 fusion partnerとしても機能することを実証した点で対照的に新しい。新規な貢献として本研究で初めて (1) 肺癌でのNTRK1 fusion存在を実証、(2) MPRIP (新規fusion partner) + CD74 (multi-oncogene partner) の同定、(3) ARRY-470 (selective TRK inhibitor) の preclinical proof-of-concept提供、(4) targeted NGS + FISHのcombo screening pipelineをdriver-negative NSCLCで確立、を達成した。
臨床応用として、(1) lung cancer患者全例 (特にdriver-negative) に対する comprehensive genomic profiling (NTRK1/2/3含む) の必要性提唱、(2) 本研究を端緒として開発された tumor-agnostic TRK inhibitor (larotrectinib FDA 2018承認、entrectinib FDA 2019承認) は あらゆる固形腫瘍 NTRK fusion陽性例に対し約75%のORR・mPFS 25+ヶ月を達成し精密医療の代表例となった、(3) RIP-TRKA + CD74-TRKA fusion partners 同定により、CCD-containing fusion partnersが kinase activation universal mechanismとして機能する設計原理を確立、(4) bench-to-bedside としては最も成功したprecision oncology paradigmの1例、(5) NCCN guidelines等で NTRK 検査が NSCLC初診時 panel に組み込まれる根拠を提供。
残された課題とlimitationとして、(1) Brief Communicationの limited cohort (n=91 driver-negative) で頻度3.3%の確定値解像度不足 (後の大規模解析でNSCLC全体~0.2-1%とより低頻度)、(2) selective TRK inhibitor (ARRY-470等) のlung cancer患者 phase 1/2試験の検証が必要、(3) NTRK fusion acquired resistance機構 (G595R/G667C/G623R等のsolvent-front + gatekeeper mutations) の解明、(4) brain metastases penetration profile (larotrectinib・entrectinibはCNS active、第2世代 selitrectinib・repotrectinib開発で resistance overcome)、(5) co-mutation profileとresponse predictive markers、(6) NTRK fusion検出方法の standardization (NGS・FISH・IHC・RT-PCR)、(7) pediatric固形腫瘍 (infantile fibrosarcoma) との clinical management差異、が今後の検討課題である。今後の研究としては、selective TRK inhibitor (larotrectinib、entrectinib、selitrectinib、repotrectinib) のlung cancer specific clinical trial、acquired resistance landscape pan-cancer解析、tumor-agnostic basket trial design optimizationが必要である。本研究は precision oncology における biology-first / tumor-agnostic approachの paradigm-shifting representative work として、その後の TRK inhibitor 臨床開発の科学的基盤を提供した (Kwak et al. NEnglJMed 2010、Davies et al. ClinCancerRes 2012)。
方法
患者コホートとNGSスクリーニング: 標準臨床アッセイで既知oncogenic alteration検出されなかった lung adenocarcinoma n=36例にtargeted DNA NGS実施 (Foundation Medicine assay)。検出 fusion candidate はRT-PCRで exon junction sequence + mRNA expression確認、entire cDNAを cloning + sanger sequencing。追加スクリーニング: NTRK1 fusion検出用 break-apart FISH probe開発、56 additional lung adenocarcinoma (driver-negative) にFISH適用、合計 n=91評価。
Fusion機能解析 (n=3 biological replicates): 293T cells (human embryonic kidney) にMPRIP-NTRK1またはCD74-NTRK1 cDNA constructをexogenous expression、parallel kinase-dead variant (control) と比較。Immunoblot (CUTO-3 patient-derived early-passage lung cancer cells含む) でTRKA autophosphorylation (Y496・Y680・Y681 tyrosine residues) + ERK1/2 activation (T202/Y204 phosphorylation) を評価。Ba/F3 (murine pro-B cell line、cytokine-dependent) でIL-3 (Interleukin-3) 非依存性 proliferationを MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] assayで測定 (n=3、各 fusion・EML4-ALK [positive control]・full-length TRKA + NGF・empty vector・kinase-dead variant)。NIH3T3 (mouse fibroblast、anchorage-dependent immortalized cell line) で anchorage-independent growth + nude mouse xenograft (5 mice/cell line、Day 12 tumor formation observation) で tumourigenicity評価。
FISH validation: Break-apart FISH probe (5’ green + 3’ red、NTRK1 gene 1q21-22 region) で chromosomal rearrangement検出。Control: KM12 colorectal cancer cell line (TPM3-NTRK1 fusion + carrier)、non-tumor cells。
TRK inhibitor: ARRY-470 (Array BioPharma化合物、selective TRKA/TRKB/TRKC inhibitor with nanomolar activity、no other notable kinase inhibition < 1,000 nM; これがentrectinib・larotrectinib開発の前身)、lestaurtinib (CEP-701)、crizotinib (multi-kinase ALK/ROS1/MET inhibitor)。Treatment後にTRKA autophosphorylation + downstream MAPK/AKT signaling + Ba/F3 proliferation + cell cycle arrest + apoptosis評価。
Index patient clinical follow-up: MPRIP-NTRK1陽性患者にcrizotinib (250 mg twice daily) を clinical trial外で投与 (no standard therapies + no available TRKA inhibitor trials)、CT response評価・serum CA125 monitoring。
統計: n=3 biological replicates ± SEM (standard error of mean) で in vitro実験、5 mice/cell line for xenograft、Fisher exact test (group比較)、Student’s t-test (n=3 mean比較)、Kaplan-Meier生存曲線・log-rank検定 (Ba/F3 IL-3独立増殖プロット)、IC50 nonlinear regressionで dose-response解析。