- 著者: Aria Vaishnavi, Ashley M. Doak, Michelle H. Le, Anh T. Le, et al.
- Corresponding author: Robert C. Doebele (University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO)
- 雑誌: Cancer Research
- 発行年: 2017
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 28428274
背景
非小細胞肺がん (NSCLC) の約15〜20%は、ALK、ROS1、RET、NTRK1などの融合キナーゼをドライバー遺伝子として持つ。これらの融合キナーゼは、がん細胞の増殖と生存に不可欠な「がん遺伝子依存性 (oncogene addiction)」を示すことが知られており (Weinstein et al. Science 2002)、各融合キナーゼに対する選択的チロシンキナーゼ阻害薬 (TKI) が臨床的に承認され、高い奏効率と無増悪生存期間 (PFS) の延長をもたらしている (Shaw et al. NEnglJMed 2013、Solomon et al. NEnglJMed 2014、Shaw et al. NEnglJMed 2014)。しかし、これらのTKIによる治療は、完全な腫瘍退縮を達成することは稀であり、ほとんどの患者で最終的に薬剤耐性による病勢進行を経験する。この耐性メカニズムの解明は、治療効果の改善と耐性発現の遅延のために喫緊の課題である。
従来の薬剤耐性研究は、病勢進行後の腫瘍サンプルや長期的な薬剤選択圧下で樹立された細胞株を用いて、獲得耐性メカニズムに焦点を当ててきた。これにより、キナーゼドメイン変異などの獲得耐性メカニズムを克服する次世代TKIの開発が進んだが、初期治療における併用療法の改善や、薬剤耐性発現を未然に防ぐ戦略に関する知見は不足していた。特に、TKI治療開始直後から観察される不完全な腫瘍応答の根底にあるメカニズム、すなわち「早期適応的シグナル伝達メカニズム」については未解明な点が多かった。
野生型EGFRは、NSCLCの約80%で高発現しているが、EGFR変異を持たない融合キナーゼ陽性NSCLCにおけるその役割は十分に検討されていなかった。先行研究では、EGFRがROS1阻害薬に対する部分的な内在性耐性や獲得耐性に関与することが報告されている (Doebele et al. ClinCancerRes 2012)。また、ALK阻害薬に対する獲得耐性メカニズムとしてEGFRシグナルの関与も示唆されている (Sasaki et al. CancerRes 2011)。もし融合キナーゼとEGFRが同一細胞内で相互作用し、EGFRシグナルが融合キナーゼ阻害薬の有効性を制限する「内在的な救済経路」として機能し得るならば、EGFR阻害薬との組み合わせが融合キナーゼ陽性NSCLCの治療効果を増強できる可能性が考えられる。この仮説を検証することは、臨床的に重要な課題であり、薬剤耐性発現を遅延させる新たな治療戦略の開発に繋がる可能性がある。本研究は、薬剤未治療の融合キナーゼ陽性NSCLC細胞におけるEGFRシグナルの役割を詳細に解析し、早期適応的な生存メカニズムとしてのEGFRの関与を明らかにすることを目指した。この領域における知識のギャップを埋めることが本研究の重要な目的である。
目的
本研究の目的は、ALK、ROS1、RET、NTRK1融合陽性NSCLC細胞において、野生型EGFRが融合キナーゼ阻害薬に対する応答にどのように影響するかを包括的に解明することである。具体的には、以下の点を明らかにすることを目指した。
- 融合キナーゼ阻害薬処理下におけるEGFRと融合キナーゼ間のシグナルクロストークの分子メカニズムを特定する。特に、EGFRが融合キナーゼ活性を増強し、下流シグナルを維持するメカニズムを解明する。
- EGFR阻害薬が融合キナーゼ阻害薬の感受性に与える影響をin vitroおよびin vivoで定量的に評価し、併用療法の有効性を検証する。
- 外因性EGFリガンドによるEGFR活性化が融合キナーゼ阻害薬感受性に与える影響を評価し、その臨床的意義を考察する。これにより、EGFR活性化が薬剤効果を減弱させるメカニズムを明らかにする。
- 融合キナーゼ陽性NSCLC患者由来の腫瘍サンプルにおけるEGFRシグナル活性化の有無を検証し、in vitroおよびin vivoの知見が臨床的に関連することを示す。
これらの目的を達成することで、融合キナーゼ陽性NSCLCにおけるEGFRシグナルの新規な役割を定義し、融合キナーゼ阻害薬とEGFR阻害薬の併用療法の理論的根拠を提供することを目指した。
結果
野生型EGFRによる融合キナーゼ活性の増強と下流シグナルの維持: ALK、ROS1、RET、NTRK1融合陽性NSCLC細胞株において、融合キナーゼ阻害薬 (FKI) 単剤処理では、MAPKやAKTなどの下流シグナル経路の完全な抑制は観察されなかった (Figure 1A)。この不完全な抑制は、EGFRが関与している可能性を示唆した。実際に、EGFR阻害薬ゲフィチニブの追加により、下流シグナル経路の抑制が有意に増強された (Figure 1A)。逆に、外因性EGF (100 ng/mL) 刺激は、TRKA、RET、ROS1、ALK融合陽性肺がん細胞株において、ERK1/2およびAKTのリン酸化を回復させた (Supplementary Figure S1)。さらに、EGF刺激は、EGFRの迅速かつ最大活性化 (5分で最大) に加え、融合キナーゼのリン酸化レベルを構成的活性化レベル以上に増加させ、下流シグナルをさらに増幅させた (Figure 1B)。これらのデータは、EGFRシグナルが、FKI未処理状態およびFKI処理状態の両方において、がん原性融合キナーゼの活性とシグナル伝達を修飾できることを示唆する。
EGFR阻害薬による融合キナーゼ阻害薬感受性の大幅な増強: 9種類の異なる融合キナーゼ陽性細胞株 (EML4-ALK、CD74-ROS1、KIF5B-RET、NTRK1融合など) を用いた増殖アッセイにより、EGFR阻害薬ゲフィチニブ (低濃度・非毒性域) と各FKIの組み合わせ効果を評価した。ゲフィチニブの添加は、全細胞株においてFKIに対する感受性を平均12.7倍 (p=0.01) 有意に増強した (Figure 1C、Supplementary Table S1)。これは、EGFRシグナルが持続することで、FKI単剤治療における下流効果が減弱していることを定量的に示した。特にEML4-ALK陽性H3122細胞、CD74-ROS1陽性HCC78細胞、KIF5B-RET陽性LC-2/ad細胞、NTRK1融合陽性CUTO-3細胞株で一貫した感受性増強が認められた。また、EGFRのRNAiによる枯渇もFKIの阻害効果を増強した (Supplementary Figure S2)。
外因性EGFによる融合キナーゼ阻害薬感受性の低下とEGFRによるFKI結合阻害: 外因性EGF (100 ng/mL) を培地に添加してEGFRを活性化すると、FKIに対する細胞の感受性が平均5.9倍 (p=0.004) 低下した (IC50値が上昇)。これは、EGFRの活性化がFKIによる遮断にもかかわらず下流シグナルを維持することで、感受性を低下させることを直接的に示した (Figure 1C)。さらに、EGF刺激は、FKIによって阻害された融合キナーゼの再リン酸化を誘導した (Figure 2A、Supplementary Figure S1)。この再リン酸化は、触媒活性を失ったキナーゼドメイン変異型NTRK1 (K544N) でも観察され、EGFRによる融合キナーゼのトランスアクティベーションを示唆した (Figure 2B)。ビオチン標識クリゾチニブを用いたプルダウンアッセイでは、EGF刺激がビオチン標識FKIとROS1またはALKの結合を阻害することが示され、EGFR活性化がFKIの融合キナーゼへの結合を不安定化させるメカニズムが明らかになった (Figure 2C)。
EGFRと融合キナーゼ間のアダプタータンパク質を介したシグナルクロストーク: PLAを用いて、融合キナーゼとアダプタータンパク質 (TRKA-SHC1、RET-GRB7、ROS1-GRB2、ALK-GRB2) の複合体形成を検出した。各FKIはこれらの複合体を阻害したが、EGF刺激下では複合体形成が回復した (Figure 3A、Supplementary Figure S3C)。FKIとゲフィチニブの併用により、EGF存在下でも複合体形成は完全に阻害された。また、EGFR-GRB2 PLAにより、ALKおよびTRKA融合細胞株では未処理細胞でもEGFRシグナル複合体が検出された一方、ROS1およびRET融合細胞株ではFKI処理後にEGFRシグナル複合体が増加することが観察された (Figure 3B、C、Supplementary Figure S3D)。これは、FKI処理後にGRB2やSHC1などのアダプタータンパク質が融合キナーゼからEGFRへと結合を切り替える「アダプタータンパク質スイッチング」が起こることを示唆する (Figure 4A、B、C)。このスイッチングは迅速かつ可逆的であり、FKI除去後にはGRB2がROS1への結合に戻る傾向が認められた (Figure 4D、E)。Co-IP実験でも、HCC78細胞においてFKI処理後にGRB2がROS1からEGFRへ結合を切り替えることが確認された (Figure 4C)。さらに、全ての融合キナーゼ (TRKA、ALK、RET、ROS1) がEGFRと物理的に複合体を形成することがCo-IPおよびPLAにより示された (Supplementary Figure S7)。
In vivo異種移植モデルにおける併用療法の有効性: EML4-ALK陽性H3122細胞のヌードマウス皮下異種移植モデルにおいて、クリゾチニブ単剤、ゲフィチニブ単剤、および両剤の併用療法を比較した。クリゾチニブ単剤では有意な腫瘍増殖抑制が認められたが、治療終了後に再増殖傾向が示された。ゲフィチニブ単剤はALK陽性腫瘍に対しては効果が限定的であった。一方、クリゾチニブとゲフィチニブの併用群では、単剤の効果を上回る相乗的な腫瘍増殖抑制が達成され、治療期間中の腫瘍容積がより持続的に低値を維持した (Figure 5A)。具体的には、クリゾチニブ単剤群と比較して、併用群では腫瘍増殖が有意に抑制された (p<0.05)。併用群では、ALK-GRB2およびEGFR-GRB2シグナル複合体の有意な減少が認められ、in vitroでの分子機序がin vivoでも作動することが示された (Figure 5B、C)。
ヒト肺がん患者サンプルにおけるEGFRシグナルの検出: NTRK1融合陽性PDXモデルの腫瘍組織では、FISHによるNTRK1再構成の陽性、IHCによるEGFRの高発現とリン酸化が確認された (Supplementary Figure S8A-C)。PLAにより、TRKA-SHC1、EGFR-GRB2、およびTRK-EGFR複合体が検出された (Supplementary Figure S8D-I)。また、ALKまたはROS1陽性患者26例のコホートでは、21例 (81%) でEGFRのIHCスコアが200以上と高発現を示した (Supplementary Figure S9A)。ROS1陽性患者のFKI治療前後の腫瘍サンプルでは、治療前には最小限のEGFR-GRB2シグナルしか検出されなかったが、FKI治療後の病勢進行時 (耐性発現時) にはEGFR-GRB2シグナルが有意に増加した (p<0.01) (Figure 5D、E)。同様に、耐性を示したALK陽性またはRET陽性肺がん患者の腫瘍サンプルでも、EGFR-GRB2シグナル複合体が豊富に検出された (Supplementary Figure S9)。これらの患者サンプルでは、融合キナーゼの活性化を説明するキナーゼドメイン変異は検出されず、EGFRによる融合キナーゼのトランスアクティベーションが示唆された (Figure 5D、Supplementary Figure S9B-F)。
考察/結論
本研究は、ALK、ROS1、RET、NTRK1融合陽性NSCLC細胞において、野生型EGFRが融合キナーゼ阻害薬に対する早期適応的な生存メカニズムとして機能することを新規に明らかにした。この知見は、EGFRが融合キナーゼ阻害薬応答の重要な「mediator」として働くことを示しており、異なる融合キナーゼに共通する普遍的な原理であると示唆される。
先行研究との違い: これまでの研究では、EGFRシグナルがALK阻害薬に対する獲得耐性メカニズムとして機能することが報告されていた (Sasaki et al. CancerRes 2011)。しかし、本研究は、薬剤未治療の細胞において、EGFRが初期から存在する「内在的な応答調節因子」として、融合キナーゼ阻害薬に対する不完全な応答や早期適応的な生存を可能にすることを示した点で、これまでの報告とは異なる新規性を持つ。特に、EGFRがFKIの結合を阻害し、融合キナーゼを再リン酸化するメカニズムや、アダプタータンパク質 (GRB2, SHC1) が融合キナーゼからEGFRへ結合を切り替える「シグナルスイッチング」という動的なシグナル再配線メカニズムは、これまで報告されていない。
新規性: 本研究で初めて、EGFRが以下の3つの異なる役割を果たすことを示した。第一に、EGFを介したEGFR活性化がFKIの融合キナーゼへの結合を阻害し、融合キナーゼシグナル複合体を回復させること。第二に、FKI処理によりアダプタータンパク質 (GRB2, SHC1) の結合が融合キナーゼからEGFRへ切り替わること。第三に、EGFRがMAPKなどの重要な下流経路へのバイパスシグナルを維持すること。これらのメカニズムは、ALK、ROS1、RET、NTRK1という4種類の異なる融合キナーゼで共通して観察され、融合キナーゼ陽性NSCLCにおけるEGFRの普遍的な役割を示唆する。
臨床応用: 本研究の知見は、融合キナーゼ陽性NSCLC患者におけるEGFR阻害薬と融合キナーゼ阻害薬の併用療法の評価を強く支持する。in vivoマウスモデルにおいて、クリゾチニブとゲフィチニブの併用がクリゾチニブ単剤療法と比較して腫瘍増殖を有意に減少させた (p<0.05) ことは、この併用療法の臨床的有用性を示唆する。また、患者腫瘍サンプルにおいて、FKI治療後の病勢進行時にEGFRシグナル複合体が増加していたことは、EGFRが薬剤耐性発現の一因となる可能性を示唆しており、初期治療からEGFRを標的とすることで、耐性発現を遅延させ、治療効果を深化・延長できる可能性がある。このアプローチは、現在のTKI治療で観察される不完全な腫瘍応答を克服し、患者の長期予後を改善する上で重要な臨床的意義を持つ。
残された課題: 今後の検討課題として、野生型EGFRを標的とする最適なEGFR阻害薬の選択、および併用療法の投与量とスケジュールを最適化するための臨床試験が必要である。また、本研究で示されたEGFRの役割が、他の融合キナーゼや他のがん種にも適用されるかどうかの検証も重要である。Limitationとしては、in vitroおよびin vivoモデルでの結果がヒト患者に完全に外挿可能であるか、さらなる臨床データによる検証が必要である点が挙げられる。また、EGFR以外のHERファミリーメンバー (HER2, HER3) の関与も完全に排除されたわけではなく、今後の研究で詳細な解析が求められる。ゲフィチニブはHER2に対する効力がEGFRよりも低いことが知られており (Karaman et al. NatBiotechnol 2008)、本研究ではEGFR特異的な効果を評価しているが、他のHERファミリーメンバーの役割を完全に除外するためにはさらなる検証が必要である。
方法
細胞株と試薬: H3122、H2228、HCC78、H1650、H520、H1993、CUTO-3、CUTO-2、DFCI-032、STE-1、KM12、LC-2/ad、293T細胞株を使用した。これらの細胞株は2008年から2014年の間にPaul A. Bunn博士、Pasi A. Jänne博士、Christine M. Lovly博士などから入手された。LC-2/ad細胞はSigma-Aldrichから、293T細胞はATCCから購入した。全ての細胞株はDNAフィンガープリント分析による認証とマイコプラズマ検査を定期的に実施した。ゲフィチニブ、クリゾチニブ、TAE-684はSelleck Chemicalsから購入した。ARRY-470はArray Biopharmaから、フォレチニブ (XL880) はGlaxoSmithKlineから提供された。EGFはR&D Systemsから購入した。
増殖アッセイ: 9種類の融合キナーゼ陽性NSCLC細胞株を対象に、CellTiter 96 MTS (Promega) を用いて72時間薬剤処理後の細胞増殖を評価した。細胞は750、1,000、または2,000 cells/wellで播種され、5% FBSを含む培地で培養された。各アッセイは3連で行い、少なくとも3回の独立した生物学的繰り返しを実施した。IC50値はGraphPad Prismソフトウェアを用いて算出した。統計解析には対応のあるStudent t検定を用いた。
免疫沈降 (Co-IP) およびウエスタンブロット: 変性RIPA (radioimmunoprecipitation assay) 溶解バッファーを用いて細胞ライセートを調製し、指定抗体または抗体-ビーズ複合体と共に4℃で一晩インキュベートした。その後、プロテインG結合アガロースビーズを加えて2時間インキュベートし、免疫沈降物を回収した。ウエスタンブロットには4%-20%グラジエントゲル (Bio-Rad) を使用し、各種リン酸化および総タンパク質抗体 (Cell Signaling Technologyなど) で検出した。
ビオチン標識クリゾチニブプルダウン: HCC78またはH3122細胞をビオチン標識クリゾチニブまたはカボザンチニブと共にインキュベートし、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ (Millipore) を用いてプルダウンした。その後、ウエスタンブロットによりROS1またはALKの結合を評価した。
近接ライゲーションアッセイ (PLA): 細胞をチャンバースライドに播種し、薬剤処理後に4%パラホルムアルデヒドで固定した。Duolink In Situ PLAキット (Sigma Aldrich) を用いて、融合キナーゼ-アダプタータンパク質およびEGFR-GRB2複合体の形成を検出した。CellProfilerソフトウェアを用いて、各画像フィールドの核数で正規化した赤色蛍光強度を定量した。少なくとも3回の独立した実験と300以上の核を解析対象とした。統計解析には対応のあるStudent t検定を用いた。
RNAiによるEGFRノックダウン: Mission Non-Target shRNA Controlおよび2種類のEGFR shRNA (TRCN0000010329, TRCN0000039634) を293T細胞にトランスフェクトし、CUTO-3およびLC-2/ad細胞に安定的に導入した。
In vivo異種移植モデル: ヌードマウス (n=40) の両脇にH3122細胞 (10^6個) を皮下注射した。腫瘍が約250 mm^3に達した後、マウスを4群 (n=20腫瘍/群) にランダムに分け、溶媒、クリゾチニブ (50 mg/kg)、ゲフィチニブ (25 mg/kg)、または両剤の併用を17日間経口投与した。腫瘍サイズは週2回キャリパーで測定し、腫瘍体積を算出した。最終的な腫瘍体積変化の統計比較にはANOVAとGraphPad Prismソフトウェアを用いた。研究終了時に、各治療群の腫瘍からFFPE組織を調製し、PLAを用いてALK-GRB2およびEGFR-GRB2シグナル複合体を評価した。
患者由来異種移植 (PDX) および患者腫瘍サンプル: NTRK1融合陽性PDXモデル (CULC001, CULC002) を用いて、EGFR発現とリン酸化をIHCで評価した。また、ROS1陽性、ALK陽性、RET陽性患者のFFPE腫瘍サンプル (n=26) を用いて、融合キナーゼ-アダプターおよびEGFR-GRB2複合体のPLA解析を実施した。EGFR IHCのH-score解析も行った。患者の腫瘍サンプル使用には、Colorado Multiple Institutional Review Boardの承認を得て書面によるインフォームドコンセントを取得した。