- 著者: Lydia Meder, Philipp Schuldt, Martin Thelen, Anna Schmitt, Felix Dietlein, Sebastian Klein, Sven Borchmann, Kerstin Wennhold, Ignacija Vlasic, Sebastian Oberbeck, Richard Riedel, Alexandra Florin, Kristina Golfmann, Hans A. Schlosser, Margarete Odenthal, Reinhard Buettner, Juergen Wolf, Michael Hallek, Marco Herling, Michael von Bergwelt-Baildon, H. Christian Reinhardt, Roland T. Ullrich
- Corresponding author: Roland T. Ullrich (University of Cologne)
- 雑誌: Cancer Research
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-05-18
- Article種別: Original Article
- PMID: 29776963
背景
小細胞肺癌 (SCLC) は全肺癌の 13%～18% を占める最も攻撃的な肺腫瘍であり、患者の大多数は進行した状態で診断され、全身転移を伴うことが多い。従来の化学療法は初期段階では有効性を示すものの、反応は一時的であり、患者は診断後数ヶ月以内に疾患に苦しむことが一般的である。したがって、治療反応を持続的な寛解に変換し、SCLC 患者の予後を改善するための新たな治療戦略が緊急の課題である。
免疫チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、PD-1、PD-L1 を標的とするモノクローナル抗体を用いた治療として、メラノーマを含むいくつかの癌種において臨床的活性を示している。しかし、SCLC における PD-1/PD-L1 阻害の効果は限定的である。例えば、Borghaei et al. NEnglJMed 2015 の報告によれば、ニボルマブ (抗PD-1) 単独療法は SCLC 患者において約 11% の奏効率 (ORR) しか示さず、イピリムマブ (抗CTLA-4) との併用でも 25% の ORR に留まることが CheckMate032 試験で示されている (Antonia et al. LancetOncol 2016)。さらに、非小細胞肺癌 (NSCLC) では腫瘍細胞膜上の PD-L1 発現が PD-1 標的療法への反応を予測するが、SCLC ではこの予測マーカーが機能しないことが報告されている。実際、SCLC 患者の 80% 以上がニボルマブに反応しないことが報告されており、この現象は未解明である。
LAG-3 (lymphocyte-activation gene 3)、TIM-3 (T-cell immunoglobulin and mucin domain 3)、TIGIT (T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM) などの阻害性免疫チェックポイント受容体は、T細胞の効果機能を阻害し、腫瘍細胞の排除を妨げることが知られている (Anderson et al. Immunity 2016)。これらの受容体の発現は SCLC 患者の予後因子として報告されているが、PD-1/PD-L1 阻害に対する耐性メカニズムにおけるこれら受容体の役割は十分に解明されていない。
腫瘍微小環境における免疫抑制メカニズムの活性化は、免疫チェックポイント阻害の効果を減弱させる主要な要因である。特に、制御性T細胞 (Treg)、骨髄由来抑制細胞 (MDSC)、腫瘍関連マクロファージ (TAM) の浸潤は、免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍活性を低下させ、新規併用療法の有効な標的となる可能性がある。
血管内皮成長因子 (VEGF) を標的とした抗血管新生療法は、腫瘍免疫微小環境を免疫支持的な表現型へと変換することが複数の研究で示唆されている。VEGF は樹状細胞 (DC) の成熟を抑制し、制御性T細胞の増殖を促進し、未分化骨髄細胞の拡大を引き起こす。高い腫瘍内 VEGF レベルは異常な血管新生をもたらし、低酸素環境と高い間質液圧を形成し、効果T細胞の腫瘍内浸潤を妨げ、腫瘍関連マクロファージを免疫抑制的な M2 様表現型へシフトさせる。抗VEGF治療は腫瘍微小環境の内皮細胞上の E-セレクチンと ICAM-1 などの接着分子の発現を回復させ、効果T細胞の腫瘍組織への遊走を可能にする。さらに、VEGF/VEGFR シグナル伝達の阻害は、腫瘍教育T細胞上の阻害性免疫チェックポイント受容体の発現を直接調節することが報告されている (Voron et al. JExpMed 2015)。メラノーマ患者では、低い VEGFA レベルが抗PD-1治療への反応と関連しており、VEGFA 発現が PD-1/PD-L1 阻害への反応に関連している可能性が示唆されている。
VEGFA、VEGF受容体 (VEGFR)、PD-L1 は SCLC 患者で高く発現している。しかし、SCLC における抗VEGF療法と抗PD-L1療法の併用効果、特にそのメカニズムは未確立である。本研究では、Cre誘導性 Rb1 および Tp53 (tumor protein p53) ノックアウトマウスの自発的 SCLC モデルを用いて、抗PD-L1および抗VEGF標的療法の併用が治療効果を相乗的に改善するかどうかを検証することを目指した。この領域には、SCLC における免疫チェックポイント阻害の限定的な効果を克服するための新たな戦略が不足しているという知識ギャップが存在する。
目的
本研究の主要な目的は、SCLC の自発的マウスモデルを用いて、抗VEGF抗体と抗PD-L1抗体の併用療法が、各単独療法と比較して無増悪生存期間 (PFS) および全生存期間 (OS) を相乗的に改善するかどうかを評価することである。
次に、PD-L1 単独療法に対する適応的耐性メカニズムを明らかにすることを目指した。特に、腫瘍内浸潤T細胞における PD-1 および TIM-3 の共発現が、PD-L1 阻害に対する耐性表現型を形成するかどうかを検討することが重要である。
さらに、VEGF が腫瘍関連T細胞上の TIM-3 発現に与える影響を in vitro および in vivo で検証することを目的とした。特に、VEGF 刺激が CD4+ および CD8+ T細胞の TIM-3 発現を増加させるかどうか、またこの現象が PD-1/PD-L1 阻害耐性の分子メカニズムに関与しているかどうかを明らかにすることが目標である。
最後に、マウスモデルで得られた知見をヒト SCLC 患者の末梢血単核細胞 (PBMC) で検証し、ニボルマブ (抗PD-1) 治療に対する適応的耐性を示す患者において、VEGF 刺激が TIM-3 発現を増加させるかどうかを確認することを目指した。これにより、VEGF と PD-L1 の併用療法が SCLC 治療において有効である可能性を臨床的観点から支持することが期待される。
結果
併用療法による PFS および OS の相乗的改善: Rb1 および Tp53 の二対立遺伝子欠失により腫瘍が誘導される自発的 SCLC マウスモデル (n=12-14 mice/group) で治療研究を実施した。抗VEGF単独療法は SCLC 保有マウスにおいて PFS (中央値 1 週) および OS (中央値 3 週) をビークル処理マウス (PFS 中央値 1 週、OS 中央値 3 週) および IgG 処理マウス (PFS 中央値 1.5 週、OS 中央値 2.5 週) と比較して改善しなかった。抗PD-L1単独療法はビークル群と比較して PFS (中央値 2 週、p = 0.0061) および OS (中央値 4 週、p = 0.0008) を有意に改善した。最も顕著なことに、抗VEGF/抗PD-L1併用阻害は、抗PD-L1単独療法と比較して、中央値 PFS (3 週、p = 0.0166) および OS (6 週、p = 0.0231) を大幅に改善した。抗VEGF/抗PD-L1併用療法の相乗効果を解明するため、予測加算的 PFS および OS 曲線を計算し、Prism Mantel-Cox 検定を用いて、予測加算曲線と抗VEGF/抗PD-L1併用療法群の観察された生存曲線を比較したところ、有意な差が認められた (PFS: p = 0.0119、OS: p = 0.0316)。この有意な差により、同時に投与された抗VEGF および抗PD-L1 標的療法の生存に対する治療効果は相乗効果として定義された。さらに、抗VEGF/抗PD-L1併用治療の OS データ (中央値 6 週) を標準的な併用シスプラチン/エトポシド化学療法 (中央値 5 週) と比較したところ、併用療法が良好な傾向を示した (p = 0.1312)。(Fig 1A-D)
標的病変の形態学的変化: 治療 1 週後、抗VEGF単独で処理された SCLC 保有マウスでは SD が 1 例 (20.0%、n=2/10) 認められたが、抗PD-L1単独療法では 78.6% (n=11/14)、抗VEGF/抗PD-L1併用では 92.3% (n=12/13) に認められた。PR は抗PD-L1処理マウスの 7.1% (n=1/14) および抗VEGF/抗PD-L1併用処理マウスの 7.7% (n=1/13) に認められた。しかし、1 週後には、抗VEGF単独療法を受けたマウスの 80.0% (n=8/10)、IgG 対照の 50% (n=3/6)、ビークル処理マウスの 100% (n=12/12) が PD を示した。治療 2 週後、SD は抗PD-L1単独療法で 42.9% (n=6/14)、抗VEGF/抗PD-L1併用で 46.2% (n=6/13) に検出された。注目すべきことに、PR は抗VEGF/抗PD-L1併用で処理された SCLC 保有マウスでのみ決定された (15.4%、n=2/13)。PD は全ビークル処理マウス (n=12/12)、全 IgG 処理マウス (n=6/6)、全抗VEGF処理マウス (n=10/10) で決定された。抗PD-L1単独療法処理マウスの 42.9% (n=6/14) が PD を示したのに対し、抗VEGF/抗PD-L1併用処理マウスの 23.1% (n=3/13) のみが進行性腫瘍を示した。代表的な連続マイクロCT 測定は、抗VEGF/抗PD-L1併用療法による PR、その後 4 週での SD、最終的に 7 週後の PD を示した。(Fig 1E-G)
抗PD-L1療法に誘導される消耗T細胞表現型と併用療法による改善: 抗PD-L1、抗VEGF、および抗VEGF/抗PD-L1併用治療の腫瘍浸潤T細胞への影響を解析した。IHC を用いて CD4+、CD8+、FOXP3+ T細胞の局在を検査したところ、ビークル処理 SCLC マウスでは T細胞は腫瘍周囲に蓄積せず、腫瘍組織に浸潤しなかった。抗VEGF処理マウスでは、腫瘍は少数の CD4+ T細胞で浸潤されたが、CD8+ および FOXP3+ T細胞は腫瘍辺縁に留まった。抗PD-L1処理マウスでは、CD4+ および FOXP3+ T細胞は腫瘍辺縁に蓄積したが、腫瘍組織に侵入しなかった。抗VEGF/抗PD-L1併用で処理された SCLC 保有マウスでは、CD4+ T細胞および少数の FOXP3+ および CD8+ T細胞が腫瘍組織に浸潤した。一次腫瘍から単一細胞懸濁液を生成し、腫瘍細胞および免疫細胞 (CD45+ CD3+ T細胞を含む) を免疫検出したところ、抗PD-L1および抗VEGF/抗PD-L1標的療法はビークルと比較して、汎免疫細胞 (CD45+) と腫瘍細胞 (CD45- CD56+) の比率を有意に増加させたが、免疫細胞区画内の T細胞の分画、CD4/CD8 比、および IFNγ 発現は有意に変化しなかった。しかし、抗VEGF/抗PD-L1併用療法中に進行した腫瘍内の Treg (CD4+ FOXP3+) の分画が有意に増加した。
PD-1/TIM-3共発現消耗T細胞表現型の同定と救済: 適応的耐性のメカニズムを解明するため、腫瘍浸潤リンパ球における免疫チェックポイント発現を解析した。消耗T細胞表現型は、PD-1 および TIM-3 などの少なくとも 2 つの阻害性受容体の同時上方制御によって示される。抗PD-L1療法に対する適応的獲得耐性を示す腫瘍では、CD4+ および CD8+ T細胞上の免疫チェックポイント TIM-3、LAG-3、および PD-1 の上方制御が認められた (PD-1/TIM-3: CD4+ p = 0.0081 および CD8+ p = 0.0071; PD-1/LAG-3: CD4+ p = 0.0082 および CD8+ p = 0.0395)。CTLA-4 および PD-1 二重陽性T細胞分画は、獲得抗PD-L1耐性時に増加しなかった。この消耗T細胞表現型は、抗PD-L1治療中に進行した腫瘍では、PR および SD を示す抗PD-L1処理マウスと比較して有意に増加し、真の表現型獲得を表す (CD4+ p = 0.0310 および CD8+ p = 0.0062)。さらに、消耗T細胞表現型は局所的に腫瘍細胞の存在と関連していた。興味深いことに、PD-1/TIM-3 消耗T細胞表現型は、抗PD-L1標的療法を抗VEGF療法と組み合わせることで有意に救済された (CD4+ p = 0.0389; CD8+ p = 0.0411)。一方、PD-1/LAG-3 消耗表現型は救済されなかった。消耗T細胞表現型は IFNγ に依存しないことも示された。さらに、SCLC 腫瘍での VEGF ノックアウトは aPD-L1 治療への反応を増強しなかった。(Fig 2B-E)
VEGF による TIM-3 発現の制御: TIM-3 は抗PD-L1標的治療中の進行時に上方制御され、抗VEGF療法の追加により再び廃止されたため、VEGF/VEGFR シグナル伝達が腫瘍関連T細胞上の TIM-3 発現を誘導すると仮説を立てた。腫瘍関連 CD8+ T細胞上で VEGFR1 が上方制御されていることが判明した。これらのデータは TIM-3 発現が CD8 T細胞で VEGF-VEGFR1 によって調節されることを示唆しているが、CD8 細胞で TIM-3 発現を調節する VEGF 誘導シグナル伝達経路は依然として不明である。
腫瘍関連マクロファージにおけるガレクチン-9発現の増加: PD-L1 (PD-1 の主要リガンド)、PD-L2、およびガレクチン-9 (TIM-3 の主要リガンド) の腫瘍微小環境における発現をさらに調査した。ガレクチン-9 の発現は、抗PD-L1および抗VEGF/抗PD-L1療法中に進行した SCLC の TAM 上で有意に増加した (ビークルと比較した平均蛍光強度で測定、抗PD-L1: p = 0.0069、抗PD-L1/抗VEGF: p = 0.0212)。しかし、TADC (tumor-associated dendritic cells) および腫瘍細胞では有意に変化しなかった。抗PD-1/抗PD-L1治療を受けていないヒト SCLC 患者サンプル (n=18) では、ガレクチン-9 は腫瘍細胞 (n=3/18)、TAM およびリンパ球 (n=8/18) で検出され、TIM-3 と頻繁に共発現した (n=7/8) が、PD-L1 とは共発現しなかった。PD-L1 は腫瘍細胞および SCLC の腫瘍微小環境内で有意に発現することが示されているが、抗PD-L1治療時に TADC (抗PD-L1: p > 0.001、抗PD-L1/抗VEGF: p = 0.002)、腫瘍細胞 (抗PD-L1: p = 0.0111、抗PD-L1/抗VEGF: p = 0.0220)、および TAM (抗PD-L1: p = 0.0002、抗PD-L1/抗VEGF: p = 0.0009) 上で有意に低下した。PD-L2 は TADC および TAM 上で発現せず、腫瘍細胞上で低レベルでのみ発現したが、適用された治療レジメン後の SCLC では差別的に発現しなかった。また、免疫細胞内の TAM および TADC の比率を解析したが、異なる治療レジメンの適用時に有意な変化は同定されなかった。免疫チェックポイント受容体は最近 TAM 上で発見され、それらの抗腫瘍機能を廃止し、免疫チェックポイント阻害への反応に直接寄与しているため、SCLC を有するマウスの TAM 上の PD-1、TIM-3、LAG-3、および CTLA-4 の発現を調査した。PD-L1 阻害への獲得耐性時に TAM 上で免疫チェックポイント受容体発現が誘導されることが判明した (PD-1 p < 0.0001; TIM-3 p = 0.1053; LAG-3 p = 0.0064; CTLA-4 p = 0.0015)。抗PD-L1/抗VEGF標的療法の併用は、抗PD-L1単独療法と比較して LAG-3 および CTLA-4 発現を有意に低下させた (p = 0.0012; p = 0.0003)。
ヒト PBMC における VEGF による TIM-3 上方制御: 本研究の臨床的妥当性を検証するため、ニボルマブ (抗PD-1) 治療中に進行した SCLC 患者から PBMC を分離した。SCLC 患者の 2 つのコホートの PBMC を調査した: 放射線療法と化学療法単独 (RC) で処理されたもの、または RC の後に免疫チェックポイント阻害剤ニボルマブ (RCI) で処理されたもの。マウスの自発的 SCLC から得られた前臨床データを確認し、TIM-3 は、ニボルマブへの反応後に進行した SCLC の末梢血の CD8+ および CD4+ T細胞上で有意に上方制御された。予想通り、これらの末梢血T細胞上の PD-1 は抗PD-1治療により下方制御された (Fig 4A-C)。VEGF が腫瘍関連T細胞上の TIM-3 発現を誘導するという仮説に従い、上記の患者コホートの PBMC 由来 T細胞に対する VEGF 刺激の効果を調査した。仮説と一致して、ニボルマブへの初期反応後に進行した患者の末梢血T細胞の VEGF 共刺激 24 時間後、PD-1/TIM-3 二重陽性 CD8+ T細胞の分画が有意に増加した (Fig 4D-F)。RC 治療患者の CD8+ T細胞でも同様の効果が認められたが、RCI コホートでより顕著であった。CD4+ T細胞でも同様の結果が得られた。
考察/結論
本研究は、VEGF と PD-L1 の併用阻害が、SCLC の自発的マウスモデルにおいて PFS および OS を相乗的に改善することを示した。抗PD-L1単独療法に対する限定的かつ短期的な反応は、SCLC 患者における抗PD-1治療の限定的な有効性と一致する。
新規性: 本研究で初めて、PD-1/PD-L1 阻害に対する耐性を獲得した SCLC の CD8+ および CD4+ T細胞において、負の制御性消耗マーカーである TIM-3 および PD-1 の発現が上方制御されることを同定した。さらに、この TIM-3 関連消耗表現型が VEGF シグナル伝達によって調節されることを in vitro で再現的に示した。
先行研究との違い: 以前の報告では、PD-1 阻害に対する耐性時に VEGF/VEGFR 依存性の TIM-3 発現が記述されているが、本研究は SCLC における VEGF と PD-L1 の併用阻害が OS を相乗的に改善するという点でこれまでと異なり、そのメカニズムとして T細胞の消耗を軽減することを示した。Allen et al. SciTranslMed 2017 は、抗血管新生/抗PD-L1併用治療が T細胞の活性化と腫瘍組織への浸潤を促進することを示したが、本研究では特に CD4+ T細胞の浸潤改善を観察した。
臨床応用: 本知見は、SCLC 患者の治療において VEGF と PD-L1 の同時阻害が有効な治療戦略となり得ることを強く示唆しており、臨床応用に向けた重要な根拠を提供する。ニボルマブ治療中に進行した SCLC 患者の PBMC においても TIM-3 陽性 T細胞表現型が確認されたことは、本前臨床データの臨床的妥当性を支持する。
残された課題: 今後の検討課題として、VEGF 誘導性シグナル伝達経路が CD8+ T細胞における TIM-3 発現をどのように調節するかをさらに解明する必要がある。また、SCLC 患者の腫瘍微小環境における TAM の消耗表現型が、併用療法の効果にどのように寄与しているかを詳細に調査することも重要である。本研究のマウスモデルはヒト SCLC と比較して変異負荷が低い可能性があり、この点が免疫療法の反応性に与える影響を考慮する必要がある。
方法
動物実験と治療プロトコル: 本研究は FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Associations) 推奨に従い、地域倫理委員会の承認を得て実施された。Cre誘導性条件付き Rb1 および Tp53 (tumor protein p53) ノックアウトマウスモデルを使用した。Tp53 の exon 2-10、Rb1 の exon 19 を flox out している。6～8週齢の C57BL/6J × FVB/NJ × 129/Sv マウス (雌雄混合) にケタミン/キシラジン (100 mg/kg/体重 i.p./0.5 mg/kg/体重 i.p.) で麻酔し、2.5 × 10⁷ pfu のアデノ-Cre を気管内投与した。ウイルスベクターはアイオワ大学ウイルスベクターコアから提供された。初期コホートを用いて吸入後の生存期間を決定し、治療群の監視開始時期を推定した。マイクロCT (LaTheta mCT, Hitachi Alcoa Medical Ltd) による腫瘍誘導の監視は Cre 投与後 22 週から開始し、マウスは 2.5% イソフルランで麻酔した。組織学的に、SCLC 一次腫瘍はヘマトキシリン・エオシン (H&E) 染色による細胞形態、Ki-67 染色による増殖、CD56 神経内分泌マーカー発現においてヒト SCLC と類似していた。さらに、SCLC 腫瘍は PD-L1 および VEGF を発現していた。
測定可能な標的病変が同定されたマウスは無作為に 5 つの治療群に割り当てられ、全ての治療は 3 日ごとに同時投与された: (i) ビークル (PBS)、(ii) IgG (対応するモノセラピー IgG、Southern Biotech、PBS に希釈)、(iii) 抗マウス VEGFA モノクローナル抗体 (aVEGF, B20-4.1.1-PHAGE, Genentech 提供) (5 mg/kg/体重 i.p.)、(iv) 抗マウス PD-L1 モノクローナル抗体 (aPD-L1, clone 6E11, Genentech 提供) (5 mg/kg/体重 i.p.)、(v) 抗VEGF/抗PD-L1 併用 (5 mg/kg/体重/5 mg/kg/体重 i.p.)。参照群として、SCLC 保有マウスはシスプラチン (5 mg/kg/体重、週 1 回) とエトポシド (10 mg/kg/体重、週 3 回) からなる標準的な併用化学療法サイクルで治療され、毒性と体重減少に応じて 2～3 週間の回復期間が設けられた。腫瘍増殖は連続マイクロCT で監視され、Eisenhauer et al. EurJCancer 2009 を SCLC モデルに適応させた。マイクロCT で測定可能な最小標的病変は 1 mm に適応させ、スライス厚は 0.3 mm に適応させた。最初の投与は標的病変同定と基線評価時に、最大 1 日前に行われた。反応基準は直径の折変に関して維持された: 完全奏効 (CR) は 100% の減少、部分奏効 (PR) は 30% 以上の減少、進行性疾患 (PD) は 20% 以上の増加および/または新規肺病変、安定病 (SD) は PR または PD に適合しない直径変化と定義された。マイクロCT データは OsiriX-DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) ビューアで解析された。
生存解析: PFS および OS は各治療群について Kaplan-Meier 法で算出された。抗VEGF単独療法と抗PD-L1単独療法の生存曲線から、加算的効果を仮定した予測生存曲線を計算した。この予測曲線と観察された併用療法の生存曲線を Mantel-Cox 検定で比較し、相乗効果の有無を判定した。
フローサイトメトリー: マウス臓器を採取し、40 μm セルストレーナーで機械的に解離した。赤血球を ACK (ammonium-chloride-potassium) 溶解液で溶解し、PBS で洗浄した。精製された一次細胞とT細胞を 4°C で 30 分間、以下の標的に対する抗体で染色した: LAG-3 (FITC, C9B7W, Thermo Scientific)、CTLA-4 (PE, UC10-4B9)、CXCR3 (FITC, CXCR3-173)、CCR4 (PE-Cy7, 2G12)、FOXP3 (PE, MF14)、IFNγ (Alexa Fluor 700, XMG1.2)、TIM-3 (PE, RMT3-23; PerCP-Cy5.5, B8.2C12)、CD4 (PE-Dazzle594, GK1.5)、CD45 (PerCP-Cy5.5, Alexa Fluor 700, APC-Cy7, 30-F11)、CD3 (PE-Cy7, Alexa Fluor 700, 17A2)、PD-1 (APC, 29F.1A12)、CD8a (FITC, Pacific Blue, 53-6.7)、CD11c (PE-Dazzle594, N418)、F4/80 (Alexa Fluor 700, BM8)、PD-L1 (PE-Cy7, 10F.9G2)、PD-L2 (eBioscience, FITC, 122)、H-2Kb (Pacific Blue, AF6-88.5)、ガレクチン-9 (PE, 108A2)、CD56 (R&D Systems, APC, 809220)。加えて、APC-Cy7 結合可固定生存率色素または Zombie Aqua 固定生存率キットを使用した。フローサイトメトリーは Gallios 10/3 (Beckman Coulter) で実施し、データは FlowJo (TreeStar v7.6.1) で解析された。
ヒトT細胞刺激: SCLC 患者の末梢血単核細胞 (PBMC) を密度勾配遠心分離 (Pancoll、密度 1.077 g/L) で分離した。T細胞を MojoSort ヒト CD3 T細胞分離キットで精製した。T細胞を 96 穴平底プレートで培養し、24 時間および 72 時間、固定化抗CD3 (5 μg/mL)、可溶性抗CD28 (2 μg/mL)、ヒト VEGF165 (50 ng/mL) で刺激した。
免疫組織化学 (IHC): マウス臓器を 4% PBS 緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。3 μm 組織切片を脱パラフィン化し、LabVision Autostainer-480S (Thermo Scientific) で H&E、KI-67 (Cell Marque, SP6)、CD31 (BD Pharmingen, MEC13.3)、CD56 (Abcam, polyclonal, ab95153)、PD-L1 (proteintech, polyclonal, 17952-1-AP)、VEGF (Santa Cruz Biotechnology, A-20)、CD4 (Abcam, EPR19514)、CD8 (Abcam polyclonal, ab203035)、FOXP3 (Novus Biologicals, polyclonal, NB100-39002) に対する一次抗体で染色した。スライドは Panoramic-250 スライドスキャナで走査された。CD31 染色は微小血管密度を決定するために使用され、各スライドから 5 つの代表的な 20 倍拡大視野を抽出し、ImageJ カスタムスクリプトで CD31 陽性構造を同定した。
統計解析: 統計解析は Prism (GraphPad V5.0) と SPSS (IBM, V24.0) を用いて実施された。エラーバーは平均の標準誤差 (SEM) を示した。P 値 < 0.05 を有意と見なした。