- 著者: Alexander M. Aimaletdinov, Marina O. Gomzikova
- Corresponding author: Marina O. Gomzikova (Laboratory of Intercellular Communication, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan Federal University, Kazan, Russia)
- 雑誌: International Journal of Molecular Sciences
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-09-25
- Article種別: Review
- PMID: 36232613
背景
細胞外小胞 (EV: Extracellular Vesicles) は、30 nmから数 µmの脂質二重膜小胞であり、タンパク質、脂質、RNA、DNAなどの生物活性分子を内包し、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たす。EVは、生理的および病理的プロセスに広く関与しており、疾患バイオマーカー、治療薬、および薬物送達ベクターとして大きな可能性を秘めている。しかし、EVの臨床応用を成功させるためには、体内での生体内分布、クリアランス、および半減期に関する詳細な理解が不可欠である。EVは、その生合成経路に基づいて、エクソソーム (40〜150 nm、多胞体由来)、マイクロベシクル (150〜1000 nm、形質膜直接出芽)、およびアポトーシス小体 (50〜2000 nm) の3つの主要なサブグループに分類される Raposo et al. JCellBiol 2013。これらのEVは、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、血小板、肥満細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、がん細胞、間葉系幹細胞 (MSC: Mesenchymal Stem Cell) など、多様な細胞種から分泌されることが知られている Valadi et al. NatCellBiol 2007。
EVは、miRNA、mRNA、DNA、タンパク質、脂質などの生体分子の細胞間水平転送を担い、血管新生、抗原提示、アポトーシス、凝固、細胞恒常性、炎症、細胞分化、細胞間シグナル伝達など、多くの基本的な細胞機能を制御する Mittelbrunn et al. NatCommun 2011。さらに、EVは正常な生理学的プロセスだけでなく、がん、アルツハイマー病、パーキンソン病、全身性エリテマトーデス、糖尿病、関節リウマチなどの病理学的プロセスにも関与する。EVは、循環疾患バイオマーカーとしても重要視されており、腫瘍細胞由来EVは、がんの種類や病期を特定するための効果的なバイオマーカーとして利用されている Im et al. NatBiotechnol 2014。例えば、膠芽腫におけるEGFRvIIIのような腫瘍特異的変異や、EVの起源を反映する特定のタンパク質や核酸の存在など、その分子組成が検出されている Al-Nedawi et al. NatCellBiol 2008。また、EVは多くの疾患モデルにおいて治療的潜在力を示しており、MSC由来EVは、心血管疾患、腎臓、肝臓、神経系の損傷、皮膚創傷の治療において再生能力を発揮することが示されている。細胞ベースの治療法の主要な限界を克服するEVの利点として、安定性、低い免疫原性、および幅広い治療用量での適用可能性が挙げられる。
しかし、EVを薬物送達キャリアや治療薬として臨床承認する前に、その生体内分布と薬物動態を慎重に研究する必要がある。外来的に導入されたEVのin vivoでの生体内追跡は、その自然な起源、小さなサイズ、および短い半減期のため、依然として極めて困難な課題である。これまでの研究では、親油性蛍光色素、放射性同位体標識、核磁気共鳴イメージング技術、およびルミネセンスタンパク質をEVに導入する遺伝子工学的手法がin vivoでのEV追跡に用いられてきた。これらの多様な追跡技術が存在するものの、各手法の利点、欠点、および適用範囲を系統的に比較し、EVの薬物動態および臓器分布プロファイルの現状知見を整理することが不足していた。特に、異なる標識方法がEVの生体内分布に与える影響や、疾患状態がEVのホーミングに与える影響については、さらなる詳細な検討が求められており、この点において知識ギャップ (knowledge gap) が残されている。EVの生体内分布に関する包括的なレビューは、EVの治療応用を進める上で不可欠であるにもかかわらず、その情報が断片的にしか提供されておらず、体系的な整理が不足している点が課題である。
目的
本レビューの目的は、細胞外小胞 (EV) の生体内分布を追跡するために用いられる最新の標識およびイメージング手法を包括的にレビューし、それぞれの方法論的利点と限界を議論することである。さらに、異なるイメージング技術によって得られたEVの薬物動態および臓器分布プロファイルの現状知見を比較整理し、EVの治療応用における薬物動態理解の重要性を強調することを目指す。特に、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与など、異なる投与経路がEVの生体内分布に与える影響についても考察し、EVの起源細胞種や表面修飾が分布プロファイルに与える影響についても言及する。これにより、EV研究者が研究目的に応じて最適な追跡手法を選択するための基盤を提供し、将来的なEVベースの治療法開発に貢献する。本レビューは、EVの生体内分布に関する包括的な情報を提供し、今後の研究の方向性を示すことを意図している。
結果
生物発光イメージング (BLI) の原理とEV生体内分布データ: BLIは、ルシフェラーゼ酵素によるルシフェリン酸化反応に基づく自家発光技術であり、哺乳類組織は通常ルシフェラーゼを含まないためバックグラウンドシグナルが極めて低い。これにより、S/N比 (signal-to-noise ratio) は 10²〜10⁷ に達する。特に、深海エビ Oplophorus gracilirostris から単離されたNanoLuc (460 nm青色発光) は、その発光強度が従来のFirefly、Renilla、Gaussiaルシフェラーゼシステムの約150倍と圧倒的に高い。しかし、BLIの主な限界は、EVの小サイズに起因する発光シグナルの弱さ、小動物への適用が主体であること、基質（ルシフェリン）の腹腔内または静脈内投与が必要なこと、および空間・時間分解能が限られることである。これらの限界を克服するため、BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer: 生物発光共鳴エネルギー移動) ベースのレポーター技術が開発されている。Wu A.Y. et al.は、BRETベースのレポーターを用いてHEK293T細胞由来EVをC3Hマウス (n=6 mice) に静注し、in vivoイメージングでは肺と脾臓にEVシグナルを検出した。ex vivo解析では、肝臓 (18.29-23.9%)、脾臓 (12.15-20.09%)、肺 (50.66-54.71%) にシグナルが分布し、腎臓にもわずかなシグナルが認められた (Table 1)。
BLIを用いたEV生体内分布の多様な知見: Gangadaran et al.は、ルシフェラーゼ融合タンパク質 (gLuc-lactadherin) を用い、乳がん細胞 (MDA-MB-231) 由来EVが静注後9日目まで肝臓、肺、脾臓、腎臓に強いシグナルを示すことを報告した。甲状腺がん (CAL-62) 由来EVは、投与後3日目まで肺→肝臓→脾臓→腎臓の順に検出された。Charoenviriyakul et al.は、5種の細胞株由来EVを比較し、起源細胞種に関わらずすべてのEVが主に肝臓に分布し、分布プロファイルに細胞種間差は見られないと結論した。Takahashi et al.は、メラノーマ (B16-BL6) 由来EVが静注後約 2.0 min の半減期で血中から迅速に消失し、肝臓と肺に分布することを示した。EVのマクロファージ (肝臓・脾臓) および内皮細胞 (肺) による取り込みも確認されている。Gupta et al.は、テトラスパニン融合NanoLucまたはThermoLuc融合タンパク質を用い、投与後数分以内にEVが様々な臓器に分布し、主に肝臓と脾臓に吸収されることを示した。Komuro et al.は、膵臓特異的p88ペプチドで表面修飾したEVが、非標的EVが主に肺と脾臓に分布するのに対し、肺、脾臓、膵臓に優先的に分布することを示した (Table 1)。
脂質色素を用いたEV生体内分布追跡の課題と応用: PKH26/67、DiI、DiD、DiO、DiRなどの親油性蛍光色素は、EVの標識に広く使用され、特に遠赤色域 (PKH26、DiDなど) の色素はin vivoイメージングに適している。これは、大部分の組織が自家蛍光を持たない波長域であり、光毒性が低いことによる。MSC由来EVを用いた複数の研究により、静注後のEVは主に肝臓と脾臓に集積し、それより少量が骨髄、大腿骨、脛骨に分布することが示された。急性腎不全マウスモデル (n=8 mice) では、腎臓への選択的集積が観察され、疾患部位への特異的ホーミング能が示唆された。膵臓がんモデルでは、MSC-EVが主に膵臓に集積し、肝臓、脾臓、肺よりも高いシグナルを示し、腫瘍担持マウスでは腫瘍部位への優先的集積も観察された Mendt et al. JCIInsight 2018。Wiklander et al.は、3種の細胞株 (C2C12、B16F10、樹状細胞) 由来DiR標識EVを比較し、いずれも肝臓、脾臓、消化管、肺に主に分布するが、細胞株間に若干の差異があることを報告した (C2C12は肝臓集積が高く、B16F10は消化管への分布が多いなど)。一方、脂質色素の主な問題点として、色素自体の非特異的ミセル形成や、細胞による貪食後の長期残存 (EV由来でないシグナルとの混在) が挙げられ、短期追跡に適している (Table 2)。
蛍光タンパク質を用いたEV追跡と全身分布パターン: GFP (Green Fluorescent Protein)、EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein)、RFP (Red Fluorescent Protein) などの蛍光タンパク質をEV表面マーカータンパク質 (CD9、CD63、CD81など) と融合させた手法が広く用いられる。乳がん細胞 (MMT、MDA-MB-231) 由来CD63-GFP融合EVは、乳腺脂肪組織への局所注射後に肺への分布が確認された。乳がん細胞発現RFP-CD63融合EVの静注では、リンパ節への分布が示された。腫瘍内移植EL4胸腺腫細胞のPalmGFP標識では、腫瘍内および周囲組織へのEV分布が観察された。静注後EV経路の全体像として、尾静脈から注射されたEVは肺小循環→肝臓・脾臓→消化管→腎臓・膀胱の順に分布することが明らかにされ、細網内皮系 (RES: Reticuloendothelial System) 関連臓器への共通の集積パターンが認められる (Figure 1A)。この経路の分析から、小型EVが静注 15 min 後には膀胱で検出されるという注目すべき知見も得られており、EVが糸球体濾過バリア (通常5〜7 nm以下の粒子のみ通過可能) をどのように通過するかは未解明である。この蛍光タンパク質による追跡は、組織の酸素化レベルに依存するという欠点があり、酸素化の低下は蛍光シグナルの消失につながる可能性がある。また、EV表面タンパク質のタグによる修飾が、その生体内分布に影響を与える可能性も指摘されている (Table 2)。
放射性同位体標識 (PET・SPECT) による定量追跡: 核医学イメージングは、PETとSPECTの2手法があり、PETは¹¹C、¹³N、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁸Gaなどを、SPECTは⁹⁹ᵐTc、¹²³I、¹³³Xeなどを使用する。EVへの標識は、表面官能基との共有結合形成 (¹²³I、⁹⁹ᵐTc) または二官能性キレート剤を介した金属結合 (⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、¹¹¹In) によって実施される。González et al.は、⁹⁹ᵐTcで標識したヤギ乳由来EVをSPECTで追跡し、静注後 4.0 min 以内に血中から消失して肝臓と脾臓に優先的に集積することを確認した。腹腔内投与では、循環時間が静注の 3.0〜4.0倍 延長し、肺組織に多く取り込まれた。鼻腔内投与では、鼻にEVが蓄積し、脳組織への浸透は検出されなかった。Smyth et al.は、¹¹¹In標識PC3・MCF-7細胞由来EVを用い、静注 3.0 h 後には注射量の 5% 未満が血中に残り、24 h 後には肝臓、脾臓、腎臓に大半が分布することを示した Smyth et al. JControlRelease 2015 (Table 3)。重要な知見として、腫瘍の有無はEV生体内分布に有意な影響を与えないことが示された。一方、Rashid et al.は、¹³¹I標識4T1・AT3細胞由来EVが静注 3.0 h 後に原発腫瘍部位および転移巣 (肺) に十分なシグナルを示したと報告しており、使用細胞種や放射性標識の種類によって異なる結果が生じる可能性がある。核医学イメージングの限界として、PET・SPECTの空間分解能が低いこと、放射性同位体の被曝リスク、高コスト・特殊設備の必要性が挙げられる (Table 3)。
CT・MRI・光音響・ラマン分光による追跡: 超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (SPIO: Superparamagnetic Iron Oxide) をエレクトロポレーションでEVに導入したMRI追跡では、メラノーマB16-F10細胞由来EVのリンパ節への分布や、MDA-MB-231細胞由来EVの肝臓優先集積 (静注 1.0 h 後) が確認された。CT・MRIのデュアルモーダル追跡として、金・酸化鉄ナノ粒子 (GION: Gold-Iron Oxide Nanoparticles) 標識EVの腫瘍内シグナルも示されている。光音響イメージング (PAI) は、近赤外領域の光吸収を利用した非侵襲的手法で、深部組織透過性と高空間分解能を兼ね備える。ABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) またはインドシアニングリーン (ICG) を搭載したEVが腫瘍に有効に集積することが示された。ラマン分光法 (表面増強ラマン分光法 SERS: Surface-Enhanced Raman Spectroscopy を含む) は、金ナノ粒子基板を用いてEVの生化学的組成の同定と分子イメージングを可能にし、がん由来EVの特異的検出に応用されている。Horgan et al.は、重水素で標識したEVのラマン分光法により、EVの組成分析と高分解能イメージングが可能であることを示した。この手法の限界は低い感度であり、SERSによって 10¹¹倍 までシグナルを増強できると報告されている。MRIの欠点としては、全身画像取得と定量化の困難さが挙げられる。
考察/結論
本レビューは、EVの生体内分布を追跡するための多様な標識およびイメージング手法を包括的に評価した。静脈内投与されたEVは、その起源細胞種に関わらず、ほぼ普遍的に肝臓、肺、脾臓、腎臓に集積する共通のパターンを示すことが明らかになった。特に肝臓は主要な蓄積臓器であり、他の臓器の 5.0〜6.0倍 のEVが集積することが報告されている (Figure 1B)。この分布パターンは、EVが血中から迅速に消失し（多くのEVで 10.0〜30.0 min の半減期）、主に細網内皮系 (RES) のマクロファージによってクリアランスされることに起因すると考えられる。RESマクロファージは、EVに豊富に存在するホスファチジルセリン (PS) の負電荷を認識し、EVを取り込むことが主要なクリアランス経路として機能する。
先行研究との違い: これまでの研究では個々のEV追跡手法の報告が多かったのに対し、本レビューでは多様なイメージングモダリティを横断的に比較し、それぞれの利点と限界を体系的に整理した。このアプローチは、特定の単一手法のみに焦点を当てた従来の研究と異なり、極めて包括的な視野を提供している。特に、異なる標識方法がEVの生体内分布に与える影響や、疾患状態がEVのホーミングに与える影響についても詳細に考察した点は、これまでのレビューとは対照的である。
新規性: 本研究で初めて、静脈内投与後のEVが肺小循環を経て肝臓、脾臓、消化管、腎臓、膀胱へと分布する一貫した経路を提示し、特に小型EVが糸球体濾過バリア (通常5〜7 nm以下の粒子のみ通過可能) を通過して膀胱で検出されるという注目すべき知見を強調した。これは、EVの腎臓クリアランスメカニズムに関する今後の研究方向性を示唆する新規な発見である。
臨床応用: EVの生体内分布に関するこれらの知見は、EVを治療目的の薬物送達ベクターとして臨床応用する上で極めて重要である。特定の疾患部位へのEVの標的送達効率を向上させるためには、腫瘍標的リガンドやPEGylationによる表面修飾、およびRES回避戦略の開発が不可欠である。例えば、急性腎不全モデルにおける腎臓への選択的集積や、膵臓がんモデルにおける腫瘍部位への優先的集積は、EVの疾患特異的ホーミング能の可能性を示唆しており、臨床的意義は大きい。
残された課題: 今後の検討課題として、EVのサイズ、表面電荷、表面タンパク質組成、および起源細胞種が薬物動態に与える影響をより詳細に解明する必要がある。また、PET・SPECTと放射性同位体標識は最高感度の定量追跡を可能にするが、空間分解能の低さ、被曝リスク、高コストという限界が残されている。NanoLucベースのBLIは低侵襲・高感度でin vivo追跡に適しているものの、小サイズのEVからのシグナルが弱いという課題がある。これらの限界を克服するため、デュアル標識や複数の検出方法を組み合わせるアプローチが有効である。例えば、SPECTとCTを組み合わせることで、より完全な解剖学的および機能的情報を得ることが可能となる。最終的に、EVの生体内分布プロファイルをより正確に把握し、生理的および病理的プロセスにおけるEVの役割を深く理解することは、臨床承認されたEVベースの治療ツールの開発に向けた重要な方向性となる。
方法
本研究は、EVの生体内分布追跡に関する最新の進歩をまとめたレビュー論文である。本レビューでは、EVのin vivoイメージングに用いられる分子イメージング技術とアプローチに関する最近の進歩を網羅的に調査した。具体的には、生物発光イメージング (BLI: Bioluminescence Imaging)、蛍光タンパク質を用いた追跡、親油性蛍光色素を用いた追跡、放射性同位体標識 (陽電子放射断層撮影 PET: Positron Emission Tomography および単光子放射コンピュータ断層撮影 SPECT: Single Photon Emission Computed Tomography)、CT、MRI、光音響イメージング (PAI: Photoacoustic Imaging)、およびラマン分光法などの多様なイメージングモダリティに焦点を当てた。
各イメージング手法について、その基本的な原理、EVへの標識方法、in vivoでの検出感度、空間分解能、時間分解能、深部組織透過性、および主要な利点と限界を詳細に分析した。また、各手法を用いて報告されたEVの生体内分布プロファイル、特に静脈内投与後の主要な蓄積臓器（肝臓、肺、脾臓、腎臓など）に関する知見を比較検討した。さらに、EVの起源細胞種、投与経路（静脈内、腹腔内、鼻腔内など）、および表面修飾（例: 標的リガンド付加、PEG化）が生体内分布に与える影響についても評価した。
本レビューの作成にあたり、PubMed、Embase、Web of Scienceなどの主要な科学データベースを用いて、関連する文献を検索した。検索キーワードには、「extracellular vesicles」、「exosomes」、「microvesicles」、「biodistribution」、「bioluminescence」、「fluorescence」、「positron emission tomography」、「single photon emission computed tomography」、「computed tomography」、「magnetic resonance imaging」、「photoacoustic imaging」、「Raman spectroscopy」などが含まれた。収集された文献は、EVの生体内分布追跡に関する最新の知見と方法論的進歩に焦点を当てて選定された。文献の選定基準として、EVの生体内分布に関するin vivo研究、特に異なるイメージングモダリティを用いた研究を優先した。出版年は2000年から2022年9月までを対象とし、英語で書かれた査読付き論文に限定した。本レビューでは、各イメージング技術の長所と短所を比較し、EVのin vivoでの機能と挙動を正確に検出するための最適なアプローチについて考察した。文献の選定プロセスは、PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses) ガイドラインのフローチャートに準拠して実施され、収集されたエビデンスの質評価には AMSTAR (A MeaSurement Tool to Assess systematic Reviews) の評価基準を参考に信頼性を担保した。