- 著者: M. Zhu, J. Kim, Q. Deng, B. Ricciuti, J.V. Alessi, B. Eglenen-Polat, M.E. Bender, H.C. Huang, R.R. Kowash, I. Cuevas, Z.T. Bennett, J. Gao, J.D. Minna, D.H. Castrillon, M.M. Awad, L. Xu, E.A. Akbay
- Corresponding author: E.A. Akbay (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX)
- 雑誌: Cancer Cell
- 発行年: 2023
- Epub日: 2023-09-28
- Article種別: Original Article
- PMID: 37774698
背景
腫瘍変異量 (TMB) は、免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) の応答を予測するバイオマーカーとしてFDAに承認されているが、高TMBを示す腫瘍の中にもICBに抵抗性を示すものが多く存在し、TMB単独ではICB応答を完全に予測できないという課題が残されている。この現象の分子機序としては、腫瘍の癌遺伝子型、抗原提示能、および腫瘍内変異不均一性などが関与する可能性が示唆されている。しかし、従来の肺癌の自家性Genetically engineered mouse model (GEMM) モデルでは、ヒト肺癌と比較してTMBが著しく低いという問題があり、ヒトの病態を十分に再現できていなかった。このTMBのギャップが、ICBに対する腫瘍の応答を正確にモデル化する上での主要な知識ギャップとなっていた。
DNAポリメラーゼε (POLE) の超変異型バリアントであるPOLE P286Rは、ヒト癌で高頻度に検出され、高い変異率を示すことが知られている。この変異を肺上皮細胞特異的に発現させることで、GEMMにヒト肺癌に近いTMBを付与できる可能性が考えられる。また、TP53変異は非小細胞肺癌 (NSCLC) において最も頻繁に検出される変異の一つであり、その機能的役割は腫瘍抑制のみならず、免疫回避における役割も近年注目されている。特に、TP53の機能喪失型変異がICB応答に与える影響については、これまで十分に未解明な点が多かった。TP53の欠損が免疫微小環境に与える影響、特に抗原提示経路の調節メカニズムは未確立であった。
先行研究では、TMBが高い腫瘍がICBに対して良好な応答を示すことが報告されている (Rizvi et al. Science 2015)。しかし、高TMBであってもICBに抵抗性を示す腫瘍の存在は、TMB以外の要因が免疫応答に影響を与えていることを示唆している (Samstein et al. NatGenet 2019)。例えば、STK11/LKB1やKEAP1の不活性化変異は、KRAS変異型肺腺癌においてPD-1阻害薬への抵抗性と関連することが示されている (Skoulidis et al. CancerDiscov 2018)。これらの知見は、腫瘍の遺伝子型が免疫応答に複合的に影響を与えることを示唆しており、特にTP53変異が免疫微小環境や抗原提示経路に与える影響は未解明な点が多い。また、腫瘍内変異不均一性 (intratumoral mutational heterogeneity) がICB応答に与える影響についても、その詳細なメカニズムは不足していた。
本研究では、POLE P286R超変異アリルを導入した自家性マウス肺癌GEMMを用いて、高TMB腫瘍におけるp53の状態が免疫原性およびICB応答に与える影響を詳細に解析し、p53欠損による免疫抵抗性の分子メカニズムを解明することを目的とした。さらに、STINGアゴニストやp53機能回復を介した治療戦略の可能性についても探索し、ICB抵抗性肺癌に対する新たな治療アプローチの開発に貢献することを目指した。従来のGEMMではヒト肺癌のTMBレベルを再現することが難しく、このギャップを埋めることが重要な課題であった。
目的
本研究の目的は、DNAポリメラーゼε (POLE) P286R超変異アリルを用いた自家性マウス肺癌Genetically engineered mouse model (GEMM) において、ヒト肺癌に近い高腫瘍変異量 (TMB) を誘導することである。このモデルを用いて、p53の状態が高TMB腫瘍の免疫原性および免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) 応答に与える影響を詳細に解明する。具体的には、p53欠損が高TMB腫瘍の免疫抵抗性を促進する分子メカニズムを同定し、抗原提示経路の障害、免疫細胞浸潤の変化、および腫瘍内変異不均一性の役割を明らかにすることを目指す。
さらに、p53欠損によって引き起こされる免疫抵抗性を克服するための治療戦略を探索することも目的とする。これには、STINGアゴニストの投与やp53機能の回復が、主要組織適合遺伝子複合体クラスI (MHC-I) 発現の回復、T細胞の抗腫瘍活性の増強、およびICB感受性の向上にどのように寄与するかを評価することが含まれる。特に、p53の遺伝的誘導やMDM2阻害薬 (nutlin-3a) による薬理学的活性化が、MHC-I発現とT細胞傷害に与える影響を評価する。
最終的には、これらの基礎研究の知見を非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者コホートのデータと統合し、TP53変異がICB後の臨床転帰に与える影響を検証することで、臨床応用可能なバイオマーカーおよび治療戦略の開発に貢献することを目指す。本研究は、高TMBにもかかわらずICB抵抗性を示す肺癌の病態生理を解明し、新たな治療介入の根拠を提供することを目指す。
結果
POLE P286RによるTMB増加と免疫原性: Kras LSL-G12D/+ (K) マウスにPole LSL-P286R/+ (O) を導入したKOモデルは、Kモデルと比較して腫瘍変異量 (TMB) が約5倍増加した (K: 0.22 mut/MB vs. KO: 1.14 mut/MB)。このTMBの増加は、KO腫瘍の免疫原性を高め、免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) 治療に対する感受性を向上させた。ICB (抗PD-L1+抗CTLA-4) 投与により、KO腫瘍は有意な生存延長を示した (ICB vs. isotype: p=0.02)。具体的には、KOマウスの平均生存期間はICB群で196日であったのに対し、Kマウスでは146日であった (p=0.029)。CD8 T細胞除去実験では、KO腫瘍の増殖が促進され、生存期間が短縮されたが、K腫瘍では影響が認められなかった。これは、KO腫瘍の増殖抑制にCD8 T細胞が重要な役割を果たすことを示唆している (Figure 1G, S1D, S1E, S1F)。この実験にはn=23 KO miceとn=20 K miceが用いられた。
KPOモデルにおけるICB抵抗性: Kras LSL-G12D/+; Trp53 fl/fl (KP) モデルにPole P286Rを追加したKPOモデルでは、KPモデルと比較してTMBが約10倍増加した (KP: 0.59 mut/MB vs. KPO: 5.9 mut/MB, p=0.03)。しかし、この高TMBにもかかわらず、KPおよびKPOの両モデルはICBに対して抵抗性を示した。ICB投与後の腫瘍体積変化は両コホートで類似しており、生存曲線もコントロール群とICB治療群で重なり合った。KPモデルではICB群とisotype群で中央値生存期間が36日 vs. 44日 (p=0.14) であり、KPOモデルでは38.5日 vs. 40日 (p=0.23) であった。これは、p53欠損が高TMB腫瘍におけるICB抵抗性の主要な要因であることを示唆している (Figure 2F, 2G, 2I, 2J, 2K)。この解析にはn=14 KP-ICB miceとn=15 KPO-ICB miceが含まれた。
p53欠損による免疫微小環境の抑制: p53欠損腫瘍 (KP/KPO) では、CD3+ T細胞およびCD8+ T細胞の割合が有意に低下していた (K vs. KP: p<0.05; KO vs. KPO: p<0.0001)。また、CD8/Treg比も低下し、免疫抑制的な微小環境が形成されていることが示された。さらに、主要組織適合遺伝子複合体クラスI (MHC-I) の発現と、抗原処理関連遺伝子であるTransporter associated with antigen processing 1 (TAP1) およびEndoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (ERAP1) のmRNA発現がp53欠損腫瘍で有意に低下していた。これは、p53欠損が抗原提示経路の障害を引き起こし、T細胞による腫瘍認識を妨げている可能性を示唆する。ケモカインCCL2の産生はp53欠損腫瘍で増加しており、マクロファージの浸潤割合が高まっていた (Figure 4C, 4D, 4E, 4F, S2D)。MHC-I発現はKPO腫瘍でK腫瘍と比較して約2.5-foldの低下を示した。
変異不均一性による免疫逃避: KPO24細胞株から樹立されたシングルセルクローン (KPO24-1, -2, -3) は、混合プール細胞と比較してin vivoでの増殖が有意に遅く、ICBに対してより高い感受性を示した。特に、一部のシングルクローンではICBにより腫瘍が完全に消退する例も認められた (Figure 5C)。これに対し、混合腫瘍はICBに抵抗性を示した。細胞を継代培養する過程で、passage 1からpassage 21にかけてMutant-Allele Tumor Heterogeneity (MATH) スコアが低下し (不均一性の減少)、プール細胞とシングルクローン間の共有変異割合が9.1% (平均172変異) から52% (平均1733変異) に増加した。この不均一性の減少と共有変異の増加は、ICB感受性の向上と相関していた。免疫記憶試験では、単一クローン腫瘍がICBにより消退したマウスに再投与された場合、腫瘍増殖が抑制され、プール腫瘍も拒絶される例が6/7 miceで認められた。これは、共有ネオ抗原が保護的な免疫応答を誘導することを示唆する (Figure 5F)。
p53誘導によるMHC-I回復とT細胞傷害増強: ドキシサイクリン誘導性p53発現システムを導入したKPO-TetOpTrp53モデルにおいて、p53を誘導するとMHC-I発現が増加し、TAP1 mRNAレベルも上昇した (Figure 6B, 6C, 6D, 6E)。OVAを発現するKPO細胞とOT-1 T細胞の共培養実験では、p53誘導により腫瘍細胞の傷害 (LDH放出およびAnnexin V陽性細胞の増加) が有意に増強された (p<0.01) (Figure 6F)。MDM2阻害薬であるnutlin-3aの投与も、ヒトNSCLC細胞株 (A549, H23) およびマウスMC38細胞においてMHC-I発現の増加とT細胞傷害の増強を引き起こした (Figure 6G, 6H, 6I)。In vivo実験では、p53誘導とICBの併用療法により、KPO105腫瘍の有意な増殖抑制と完全消退例が観察された (Figure 7C)。この実験にはn=8 mice per groupが用いられた。
STINGアゴニストによる治療効果: KPO腫瘍ではKP腫瘍と比較してSTINGタンパク質の発現量が高い傾向にあったが、cGASおよびリン酸化STING (p-STING) の活性化レベルに大きな変化は認められなかった。また、STING分解経路に関連するp62の発現も増加していた。ナノ粒子包埋STINGアゴニスト (polySTING) の腫瘍内投与により、KPO皮下腫瘍の一次増殖が有意に抑制された (Figure 8D)。PolySTINGとICBの併用療法は、単独療法と比較してさらに強力な腫瘍増殖抑制効果を示し、免疫活性化 (IFNγ+CD8 T細胞およびNK細胞の増加、pTBK1およびcleaved caspase-3の増加) が確認された (Figure 8E, 8F)。この併用療法により、腫瘍体積はICB単独群と比較して約3-foldの減少を示した。
ヒトコホートの検証: 非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者コホートの解析において、TP53 truncating変異 (ナンセンス変異およびフレームシフト変異) は、ICB治療後の全生存期間 (OS) を有意に短縮した。Samstein et al. (2019) のデータセットでは、TP53 truncating変異を有する患者の中央値生存期間は8か月であったのに対し、TP53野生型患者では19か月であった (p=0.00046)。AACR-Genieデータセットでは9か月 vs. 21か月 (p=0.01)、SU2Cデータセットでは14か月 vs. 26か月 (p=0.07 [ログランク検定], p=0.0048 [Wilcoxon検定]) であった。TP53 missense変異では、いずれのコホートでもICB後のOSに有意な差は認められなかった (Figure 3A, 3B, 3C)。この解析にはn=61 patients with nonsense TP53 mutationsとn=133 patients with wild-type TP53が含まれた。
考察/結論
本研究は、POLE P286R超変異アリルを利用した自家性肺癌Genetically engineered mouse model (GEMM) を用いて、ヒト肺癌に近い腫瘍変異量 (TMB) レベルを初めて実現した。このモデルにより、TMBが高くてもp53欠損が存在する場合に免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) が無効となる分子機序を多角的に解明した。
先行研究との違い: これまでの研究では、高TMBがICB応答の良好な予測因子であることが示されてきたが、高TMBにもかかわらずICB抵抗性を示す腫瘍のメカニズムは十分に解明されていなかった。本研究は、p53欠損がこの抵抗性の主要なドライバーであることを、自家性マウスモデルとヒト患者データを用いて包括的に示した点で、これまでの報告と異なる。特に、p53欠損が抗原提示経路の障害、免疫抑制的な微小環境の形成、および腫瘍内変異不均一性の増大という複数のメカニズムを介して免疫抵抗性を促進することを示した点は新規である。また、TP53 truncating変異とmissense変異でICB応答に差があることを示した点も、これまでの報告と対照的である。
新規性: 本研究で初めて、p53欠損が高TMB腫瘍における主要組織適合遺伝子複合体クラスI (MHC-I) 発現の低下と、Transporter associated with antigen processing 1 (TAP1)/Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (ERAP1) の発現抑制を介して抗原提示を障害することを新規に同定した。さらに、腫瘍内変異不均一性がネオ抗原の「希釈効果」を引き起こし、免疫逃避に寄与するというメカニズムも明らかにした。シングルセルクローンが混合プール腫瘍よりもICBに感受性を示すという結果は、腫瘍のクローン性が免疫応答に与える影響に関する重要な新規知見である。また、STINGアゴニストやp53誘導がMHC-I発現を回復させ、ICB感受性を増強するという治療戦略の可能性も新規に示した。
臨床応用: 非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者コホートにおけるTP53 truncating変異がICB治療後の全生存期間を短縮するという臨床データは、マウスモデルで得られた知見がヒト肺癌にも外挿可能であることを強く支持する。この結果は、TP53 truncating変異がICB治療の予測バイオマーカーとして有用である可能性を示唆し、臨床現場での患者層別化に貢献し得る。治療的含意として、MDM2阻害薬 (nutlin-3aなど) による野生型p53の安定化・活性化がMHC-I発現を誘導し、ICB感受性を向上させる可能性が示された。また、mutant p53機能回復薬 (APR-246など) の応用や、高STING発現を標的としたSTINGアゴニスト (polySTINGなど) とICBの併用戦略も有望な治療選択肢となり得る。これらのアプローチは、ICB抵抗性を示すTP53変異型肺癌患者に対する新たな治療法開発に繋がる臨床的意義を持つ。
残された課題: 今後の検討課題として、TP53 missense変異とtruncating変異がICB応答に与える異なる影響の分子機序をさらに詳細に解明する必要がある。TP53 missense変異はSTING-TBK1-IRF3経路の抑制というGain-of-Function (GOF) 機能が報告されており (Ghosh et al. 2021 Cancer Cell)、truncating変異とは異なるメカニズムで免疫回避に寄与する可能性がある。また、MDM2/MDM4増幅など、p53調節遺伝子の役割がICB応答に与える影響についても検討が必要である。さらに、p53誘導とICBの最適な組み合わせや、全身投与可能なSTINGアゴニストの開発、そしてこれらの治療戦略の臨床試験での検証が残された課題である。本研究の一部実験が皮下腫瘍モデルで実施された点はlimitationであり、肺内腫瘍モデルでのさらなる検証が求められる。
方法
本研究では、条件付きPole LSL-P286R/+マウスをKras LSL-G12D/+ (K) モデルおよびKras LSL-G12D/+; Trp53 fl/fl (KP) モデルと交配させ、気管内Adeno-Creウイルス投与により肺腫瘍を誘導した。これにより、Kras変異単独のKモデル、Kras変異とPole P286R変異を併せ持つKOモデル、Kras変異とp53欠損を併せ持つKPモデル、そしてKras変異、p53欠損、Pole P286R変異を全て併せ持つKPOモデルを樹立した。K/KOモデルでは2.5x10^8 Adeno-CMV-Creを、KP/KPOモデルでは2.5x10^7 Adeno-CMV-Creを投与した。
腫瘍の進行は、MRIによる腫瘍体積測定および肺重量測定により評価した。腫瘍組織からは全エクソームシーケンス (WES) を実施し、腫瘍変異量 (TMB) および変異シグネチャーを解析した。WESデータはTrim Galoreで品質・アダプター除去後、Burrows-Wheeler Aligner (BWA, v0.7.17) (Li et al. Bioinformatics 2009) でマウス参照ゲノム (mm10) にアラインした。GATK (4.1.4.0) (DePristo et al. NatGenet 2011) を用いてバリアントコールを行い、低品質なコールはQD < 2, FS > 60, MQ < 40, DP < 3, GQ < 7の閾値で除外した。体細胞変異はGATK Mutect2を用いて同定し、dbSNPおよびマウス株のバリアントは除外した。
治療効果の評価には、免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) として抗PD-L1抗体と抗CTLA-4抗体の併用療法を用いた。ICBは腫瘍確認後に投与し、生存期間をログランク検定で評価した。腫瘍免疫微小環境の解析は、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学 (IHC) を用いて実施した。具体的には、CD3+ T細胞、CD8+ T細胞、制御性T細胞 (Treg) の割合、MHC-I発現、および抗原処理関連遺伝子 (TAP1, ERAP1) の発現レベルを評価した。フローサイトメトリーでは、CD45+細胞浸潤、CD3+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、NK細胞、Treg、マクロファージ、好中球の割合を解析した。
KPおよびKPO細胞株 (例: KPO24) を樹立し、シングルセルクローンと混合プール細胞間の変異共有率およびMutant-Allele Tumor Heterogeneity (MATH) スコアを比較することで、腫瘍内変異不均一性の役割を検討した。p53の機能回復実験では、Tet-Onシステムを用いたドキシサイクリン誘導性p53発現系 (KPO-TetOpTrp53モデル) を構築し、MHC-I誘導およびOVA発現KPO細胞とOT-1 T細胞を用いたT細胞傷害実験を実施した。また、MDM2阻害薬であるnutlin-3aがMHC-I発現およびT細胞傷害に与える影響も評価した。
STING経路の活性化を目的として、ナノ粒子包埋STINGアゴニスト (polySTING) を腫瘍内投与し、単独およびICBとの併用による腫瘍制御効果を評価した。STINGアゴニスト投与後の免疫活性化は、IFNγ+CD8 T細胞、NK細胞の増加、pTBK1、cleaved caspase-3の発現増加により評価した。
最後に、非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者コホート (Samstein 2019 Nat Genet、AACR-Genie、SU2C、DFCI) の公開データセットを用いて、TP53変異状態とICB治療後の全生存期間 (OS) との関連を解析した。TP53 truncating変異 (ナンセンス変異およびフレームシフト変異) とTP53 missense変異に分類し、ログランク検定およびWilcoxon検定を用いて生存曲線を比較した。STK11/KEAP1変異を有するサンプルは解析から除外した。