- 著者: Weiyi Peng, Jie Qing Chen, Chengwen Liu, Shruti Malu, Caitlin Creasy, Michael T. Tetzlaff, et al.
- Corresponding author: Patrick Hwu (UT MD Anderson Cancer Center, Department of Melanoma Medical Oncology); Michael A. Davies (UT MD Anderson Cancer Center)
- 雑誌: Cancer Discovery
- 発行年: 2016
- Epub日: 2015-12-08
- Article種別: Original Article
- PMID: 26645196
背景
PD-1チェックポイント阻害療法と養子T細胞療法 (ACT, TIL therapy) は、転移性メラノーマ患者において33%から48%の客観的奏効率 (ORR) を示し、その多くは持続的な効果をもたらすことが報告されている Robert et al. NEnglJMed 2015、Larkin et al. NEnglJMed 2015。しかし、過半数の患者はT細胞介在性免疫療法に奏効せず、その治療抵抗性のメカニズムについては未解明な点が多い。治療抵抗性の経路を理解することは、患者選択の改善を通じて免疫療法の臨床応用を促進し、より効果的な併用療法の開発に繋がる可能性がある。腫瘍細胞内のシグナル伝達経路が抗腫瘍免疫応答を修飾することは、BRAF変異やβ-カテニン経路の活性化によって報告されており、腫瘍内在性経路の解明が患者選択と併用戦略の鍵となることが示唆されている Spranger et al. Nature 2015。
PTENはPI3K-AKT経路を抑制する脂質ホスファターゼであり、その発現消失は複数の腫瘍タイプでPI3K-AKT経路の活性化と関連することが知られている。メラノーマでは最大30%の症例でPTENの消失が認められ、BRAF変異と高頻度に共存する。BRAF単独の変異ではメラノサイトの形質転換は不十分であるが、PTENの消失が加わることで、マウスモデルにおいて侵襲性および自然転移性の病変が形成されることが示されている。また、BRAF変異を有するメラノーマ患者においてPTENの消失は、ステージIII患者の予後不良、およびFDA承認のBRAF阻害薬で治療されたステージIV患者の予後不良と関連することが報告されている。PTEN欠失腫瘍はBRAF/MEK阻害薬で増殖停止するものの、アポトーシス誘導には抵抗性を示すことが知られており、T細胞応答への影響も同様の腫瘍内在性経路によると仮説立てられた。
これまでの研究では、腫瘍内在性のBRAF変異がIL1αおよびIL1βの発現を増加させ、腫瘍関連線維芽細胞におけるPD-L1およびPD-L2の発現を促進し、腫瘍浸潤T細胞 (TIL) の機能を抑制することが示されている。また、BRAF阻害はメラノサイト抗原の発現を増加させ、VEGF産生を抑制することで、腫瘍反応性T細胞の腫瘍へのホーミングを促進することが報告されている Shrimali et al. CancerRes 2010。これらの知見は、腫瘍内在性経路が抗腫瘍免疫応答、特にT細胞応答に影響を与えることを示している。しかし、PTEN欠失がT細胞介在性免疫応答に与える影響、特に免疫療法抵抗性との関係については、これまで十分に解明されていなかった。この知識のギャップを埋めることは、PTEN欠失を有するメラノーマ患者に対する免疫療法の効果を改善するための新たな戦略を開発する上で重要である。
目的
本研究の目的は、PTEN欠失がT細胞介在性抗腫瘍免疫応答に与える影響を前臨床モデルと臨床検体の両方で包括的に検証することである。具体的には、PTEN欠失メラノーマにおける免疫療法抵抗性の機構（免疫制御分子発現、サイトカイン産生、オートファジーなど）を詳細に解析し、その薬理学的標的化の可能性を明らかにすることを目指した。これにより、PTEN欠失を有するメラノーマ患者に対する免疫療法の効果を改善するための新規治療戦略の基盤を確立する。
結果
PTEN欠失によるT細胞介在性殺細胞抵抗性 (in vitro/in vivo): PTENをノックダウンしたA375/GH/shPTEN細胞では、ウェスタンブロッティングによりPTEN発現の低下とpAKT (S473・T308) の有意な上昇が確認された (Figure 1A)。PMEL-1 T細胞との共培養アッセイにおいて、PTEN欠失腫瘍細胞ではcleaved caspase-3陽性腫瘍細胞の割合がPTEN発現腫瘍細胞に比べ有意に低下した (p < 0.05、各E:T比で一貫した差、Figure 1B)。in vivo ACTマウスモデル (n=3〜5 mice/group) では、PTEN欠失腫瘍へのルシフェラーゼ標識PMEL-1 T細胞の集積が有意に低下し (腫瘍局所での光子フラックスが有意に減少、p < 0.05、Figure 1D, E)、腫瘍増殖抑制効果および生存延長効果も顕著に減弱した (Figure 1F, G)。BRAF阻害薬 (PLX4720) 併用下でも同様にPTEN欠失腫瘍はT細胞傷害に抵抗性を示した。これらの結果は、MHC喪失や抗原喪失とは独立した耐性機構であり、免疫シグナル経路の腫瘍内在的制御が示唆された。
臨床検体でのPTEN欠失と抗PD-1抵抗性の相関: 抗PD-1治療を受けた転移性メラノーマ患者39例の解析では、PTEN発現腫瘍を有する患者はPTEN欠失腫瘍を有する患者よりも有意に大きな腫瘍縮小を示した (p = 0.029、Figure 2B, C)。PTEN存在群の腫瘍縮小率の中央値は顕著に高く、PTEN欠失群では多くが腫瘍増大を示した。年齢、性別、病期、標的病変径、血清LDH値などの背景因子に有意差はなく、PTEN欠失が抗PD-1治療に対する独立した予測因子である可能性が示唆された (Supplementary Table S1)。
TIL浸潤の低下とTIL拡大成功率の低下: ステージIIIB/Cメラノーマ患者135例の解析では、PTEN欠失腫瘍はCD8+ T細胞浸潤が有意に低下していた (p < 0.001、Figure 2E)。この所見はBRAF/NRAS変異状態とは独立しており、BRAF変異型および野生型ともにPTEN欠失腫瘍でCD8+ TILの低下が確認された (Supplementary Figure S2B, S2C)。また、6%の腫瘍でPTEN発現が不均一なパターンを示し、PTEN発現領域ではPTEN欠失隣接領域より多くのCD8+ T細胞が浸潤していた (Figure 2F)。TIL拡大成功率 (初回拡大 ≤40×10^6 TIL = 失敗) の解析では、TIL拡大非成功群におけるPTEN欠失率は26% (n=11/42 patients) であったのに対し、TIL拡大成功群では11% (n=9/81 patients) と有意に高かった (p = 0.04、Fisher exact test、Figure 2D)。この結果は、PTEN欠失がTIL療法の適応外となる患者の割合を増加させる可能性を示唆する。
TCGAデータによるPTEN CN欠失腫瘍の免疫プロファイル: TCGAメラノーマデータセットの解析では、PTEN CNが低い (≤-0.4) 腫瘍はpAKT発現が高く (p = 0.04)、LCK (T細胞マーカー、p < 0.01)、IFN-γ mRNA (p < 0.001)、granzyme B mRNA (p < 0.001)、およびLスコア (リンパ球浸潤スコア、p < 0.001) が有意に低下していた (Figure 3A, B, C)。LスコアはpAKT発現と逆相関を示した (Supplementary Figure S2E)。非T細胞炎症性腫瘍におけるPTEN欠失/変異頻度 (19%) はT細胞炎症性腫瘍 (6%) と比較して有意に高く (p < 0.01)、β-カテニン経路活性化とPTEN欠失は重複しないことも示された (2%のみ重複、Figure 3D)。免疫細胞溶解活性スコアもPTEN CN低値腫瘍で有意に低下していた (Supplementary Figure S2D)。
サイトカイン・ケモカイン・オートファジー機序: 47例の転移性メラノーマ検体での609炎症関連遺伝子発現解析では、PTEN欠失腫瘍で504/609遺伝子 (83%) が発現低下しており、炎症細胞の腫瘍浸潤不足が示唆された。leave-one-out logistic回帰分析により、TNFRSF10C、PDGFRB、TILR3、MASP2、CLUの5遺伝子がPTEN発現と正の相関として同定され、これら5遺伝子のROC分類器のAUCは91.6%であった (Supplementary Figure S4C)。in vitro解析では、PTENをノックダウンしたA375細胞でCCL2 (p = 0.013) とVEGF (p = 0.035) が有意に上昇し、CXCL10は有意に低下した (p = 0.0012、Figure 5A, B)。抗VEGF抗体はPTEN欠失腫瘍へのT細胞浸潤を増強し、T細胞移入モデルでの抗腫瘍効果を部分的に回復させた (Figure 5C, D)。PD-L1発現はPTEN状態と有意な相関を示さず (in vitro p = 0.138、臨床コホート p = 0.139、Figure 4A, D)、MHCクラスI発現も相関しなかったため、PTEN欠失による免疫抵抗性はPD-L1/MHC経路とは独立した機序であることが示された (Supplementary Figure S2F)。オートファジー解析では、PTEN欠失によりATG16L mRNA/タンパク質発現が低下し、LC3I・LC3IIが減少した (Figure 6A)。患者由来メラノーマ3株 (Mel2400細胞など) での機能試験で、オートファジー活性化遺伝子 (MAP1LC3B) の阻害がT細胞による腫瘍アポトーシス誘導を障害した (Figure 6B)。これはPTEN→PI3K-AKT→mTOR→オートファジー抑制という経路でT細胞殺傷抵抗性を媒介する可能性を示す。MAP1LC3Bの過剰発現はPTEN欠失腫瘍細胞のT細胞殺傷感受性を完全に回復させた (p < 0.0001、Figure 6C)。
選択的PI3Kβ阻害薬 (GSK2636771) による感受性回復: GSK2636771はPTEN欠失腫瘍でPI3Kβアイソフォームを選択的に阻害し、AKT経路の活性化を抑制した (Figure 7B)。ACTマウスモデルへの併用投与で、PTEN欠失腫瘍に対するT細胞集積、腫瘍増殖抑制、および生存延長が有意に回復した (p < 0.05、Figure 7C, D, E)。この効果はPTEN発現腫瘍に対する抗腫瘍効果には顕著な追加効果を示さず、PI3Kβ阻害の効果がPTEN欠失腫瘍に選択的であることを支持した。PI3Kβ阻害薬は、パンPI3K阻害薬BKM120とは異なり、T細胞の生存や機能に影響を与えず、gp100特異的T細胞の増殖や記憶T細胞の生成を阻害しなかった (Figure 7A)。また、抗CTLA-4抗体との併用でも同様の相乗効果が認められた (Supplementary Figure S7A-S7C)。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、PTEN欠失が腫瘍細胞内在性のメカニズムを介してT細胞介在性免疫療法 (抗PD-1/TIL therapy/ACT) への抵抗性を促進することを、前臨床モデルと臨床検体の両面から初めて統合的に示した点で新規性が高い。これまで、腫瘍内在性のシグナル伝達経路が免疫応答を修飾することは知られていたが、PTEN欠失が免疫抵抗性に与える多層的な影響は本研究で初めて詳細に解明された。また、これまでの報告と異なり、PTEN欠失とβ-カテニン経路活性化は独立かつ重複しない免疫排除機構であることが明確化された (同時保有率2%のみ)。
新規性: PTEN欠失は、(1) VEGF分泌増加とT細胞遊走の低下、(2) IFN-γ・granzyme B等のT細胞エフェクター遺伝子発現抑制、(3) CCL2過剰産生を介した腫瘍微小環境 (TME) の免疫抑制形成、(4) オートファジー経路抑制によるT細胞誘導アポトーシス耐性、という多層的機序で「cold tumor」表現型を作り出すことを新規に示した。
臨床応用: 本研究の成果はいくつかの重要な臨床的含意を持つ。第一に、抗PD-1治療前のPTEN状態評価による患者選択の改善が期待される。PTEN欠失がIHCによりスクリーニング可能であるため、治療効果が低い患者を事前に特定し、より適切な治療戦略を立案できる可能性がある。第二に、PI3K阻害薬、特にPTEN欠失で活性化されるPI3Kβアイソフォーム選択的阻害薬 (例: GSK2636771) と免疫療法の合理的な併用療法が有望である。前臨床モデルでは、PI3Kβ阻害薬がPTEN欠失腫瘍におけるAKT経路活性化を抑制し、T細胞による腫瘍殺傷を改善し、抗PD-1抗体または抗CTLA-4抗体との併用で有意な抗腫瘍効果と生存延長を示した。これは、臨床応用に向けての強力な根拠となる。第三に、TIL拡大成功率がPTEN欠失症例で低い (11% vs 26%) ことを踏まえ、ACTの適応外となる患者への代替戦略構築が重要である。
残された課題: 残された課題として、本研究の臨床コホート (n=39 patients) は比較的小規模であるため、より大規模なコホートでの検証が今後の検討課題である。しかし、前臨床エビデンスと方向性が一致する点、および独立したバイオマーカー解析 (TCGA、IHCコホート) が一致した所見を示した点が本研究の説得力を高めている。また、PTEN欠失以外のPI3K-AKT活性化経路 (例: PIK3CA変異) が同様の表現型を示すか、PTEN欠失下で機能するサイトカイン・ケモカイン分子の完全な同定、オートファジーとT細胞殺傷感受性の因果関係の更なる検証も今後の研究で必要である。PI3K阻害薬と免疫療法併用の臨床試験での有効性確認は、本研究の知見を臨床現場に橋渡しするための重要なステップとなる。本研究は、腫瘍内在性PI3K-AKT経路シグナルが免疫療法抵抗性の重要規定因子であることを示した先駆的研究であり、その後の多数の前臨床・臨床研究の出発点となった。
方法
本研究では、PTEN欠失がT細胞介在性抗腫瘍免疫応答に与える影響を多角的に評価するため、in vitroおよびin vivoの前臨床モデル、ならびに臨床検体を用いた包括的な解析を実施した。
(1) in vitro / in vivo 前臨床モデル: BRAF変異ヒトメラノーマ細胞株A375にgp100/H-2D(b)を強制発現させたモデル (A375/GH細胞) を用いた。この細胞株にshRNAでPTENをノックダウンし (2種の独立shRNA: shPTEN-17, shPTEN-60)、PTEN発現低下とpAKT (S473・T308) 上昇をウェスタンブロッティングで確認した。in vitroでは、PMEL-1マウス由来腫瘍反応性T細胞との共培養殺細胞アッセイを実施し、Caspase-3切断をフローサイトメトリーで定量した (E:T比1:0〜1:6)。in vivoでは、ACTマウスモデル (n=3〜5匹/群) を用いて、ルシフェラーゼ発現T細胞の生物発光イメージングによりT細胞の腫瘍集積を評価し、腫瘍増殖抑制効果と生存延長効果を解析した。また、BRAF阻害薬 (PLX4720) 併用下でのT細胞傷害抵抗性も評価した。
(2) 臨床検体解析:
- 抗PD-1治療コホート: 抗PD-1抗体 (pembrolizumabまたはnivolumab) 治療を受けた転移性メラノーマ患者39例の腫瘍検体で、PTEN発現をCLIA認定PTEN IHCアッセイで評価した (陰性カットオフ: <10%陽性細胞)。最良腫瘍縮小率との相関を解析し、PTEN発現群とPTEN欠失群の腫瘍縮小率を比較した (Wilcoxon rank-sum test)。
- TIL拡大コホート: 養子T細胞療法 (ACT) 前培養におけるTIL拡大成功率 (初回拡大 ≤40×10^6 TIL = 失敗) とPTEN欠失の関連を解析した (n=123例、Fisher exact test)。
- CD8 T細胞浸潤コホート: Stage IIIB/Cメラノーマ患者135例の切除検体で、CD8 T細胞浸潤をIHCで評価し、PTEN発現状態との関連を解析した (unpaired t test)。PTEN発現が不均一な腫瘍 (6%) においては、PTEN発現領域と欠失領域でのCD8 T細胞浸潤を比較した。
- TCGAデータセット解析: TCGAメラノーマデータセット (cutaneous melanoma) を用い、PTEN遺伝子コピー数 (CN) が低い (カットオフ ≤-0.4) 腫瘍におけるpAKT発現、LCK (T細胞マーカー)、IFN-γ mRNA、granzyme B mRNA、およびリンパ球浸潤スコア (Lスコア) の発現レベルを解析した。また、T細胞炎症性/非炎症性腫瘍におけるPTEN欠失/変異頻度とβ-カテニン経路活性化との重複を評価した (χ^2 test)。
(3) メカニズム解析:
- 炎症関連遺伝子プロファイリング: 47例の転移性メラノーマ検体で609炎症関連遺伝子の発現プロファイリングをNanostring技術で実施し、PTEN欠失腫瘍における遺伝子発現変化を解析した。leave-one-out logistic回帰分析により、PTEN発現と相関する遺伝子を同定した。
- サイトカイン・ケモカイン測定: PTENノックダウンメラノーマ細胞株 (A375細胞、WM35細胞) およびin vivo異種移植腫瘍で、免疫調節サイトカイン・ケモカイン (CCL2, VEGF, CXCL10など) のmRNA発現 (RT-PCR) およびタンパク質レベル (Luminex) を測定した。VEGFの機能的役割を検証するため、抗VEGF抗体併用ACTマウスモデルでT細胞浸潤と抗腫瘍効果を評価した。PD-L1およびMHCクラスI発現とPTEN状態の関連も評価した。
- オートファジー関連遺伝子プロファイリング: PTENノックダウン細胞株 (A375細胞、WM35細胞) および患者由来メラノーマ細胞株 (Mel2400細胞) で、オートファジー関連遺伝子 (ATG16L, LC3I, LC3II) の発現をウェスタンブロッティングおよびマイクロアレイで解析した。オートファジー活性化遺伝子 (MAP1LC3B) の発現操作がT細胞による腫瘍アポトーシス誘導に与える影響を評価し、オートファジー阻害薬 (ヒドロキシクロロキン, HCQ) の効果も検証した。
(4) 治療標的検証: 選択的PI3Kβ阻害薬 (GSK2636771) の併用効果をACTマウスモデルで評価した。PTEN欠失を有する_Tyr:CreER_; Braf[V600E/+]; Pten[lox/lox] マウス (BPマウス) を用いた自然発生腫瘍モデルおよび移植腫瘍モデルで、GSK2636771単独または抗PD-1抗体/抗CTLA-4抗体との併用効果を、腫瘍増殖抑制、生存期間、および腫瘍浸潤T細胞数 (CD4, CD8) で評価した。PI3Kβ阻害薬がT細胞機能に与える影響を、gp100特異的T細胞の増殖と記憶T細胞の生成を指標に評価した。統計解析には、t検定、Wilcoxon rank-sum test、Fisher exact test、χ^2 test、ANOVA、Kaplan-Meier法、ログランク検定を用いた。