- 著者: Pore N, Wu S, Standifer N, Jure-Kunkel M, de Los Reyes M, Shrestha Y, Halpin R, Rothstein R, Mulgrew K, Blackmore S, Martin P, Meekin J, Griffin M, Bisha I, Proia TA, Miragaia RJ, Herbst R, Gupta A, Abdullah SE, Raja R, Frigault MM, Barrett JC, Dennis PA, Ascierto ML, Oberst MD
- Corresponding author: Maria Libera Ascierto (ml.ascierto@gmail.com), Michael Oberst (michael.oberst@astrazeneca.com)
- 雑誌: Cancer discovery
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-07-06
- Article種別: Original Article
- PMID: 34230008
背景
PD-1/PD-L1阻害薬は非小細胞肺がん (NSCLC) の標準治療に組み込まれているが、依然として大多数の患者は奏効せず、治療抵抗性のメカニズム解明が喫緊の課題である。STK11 (LKB1) はセリン/トレオニンキナーゼであり、AMPK (AMP活性化プロテインキナーゼ) を介した細胞代謝およびエネルギーセンシングの中枢調節因子として機能する。STK11/LKB1の機能喪失変異はNSCLC患者の約5%から30%に認められ、特にKRAS変異アデノカルシノーマで高頻度であると報告されている Imielinski et al. Cell 2012。先行研究では、STK11変異がニボルマブ単剤療法やイピリムマブとの併用療法、およびペムブロリズマブとプラチナ併用化学療法に対する抵抗性と関連することが示唆されていた Skoulidis et al. CancerDiscov 2018、Hellmann et al. CancerCell 2018。しかし、アストラゼネカ社のPD-L1阻害薬デュルバルマブ単剤、または抗CTLA-4抗体トレメリムマブとの併用療法におけるSTK11変異の影響については、これまで詳細な検討が不足していた。
STK11の機能喪失は、STING (Stimulator of Interferon Genes) の転写抑制、IL-8ファミリーサイトカインの増加、好中球様細胞の浸潤増加、およびT細胞排除型の腫瘍微小環境 (TME) の形成と関連するとされる Koyama et al. CancerRes 2016、Kitajima et al. CancerDiscov 2019。これらの研究では、STK11変異が免疫抑制的なTMEを形成し、免疫チェックポイント阻害薬に対する抵抗性を引き起こす可能性が示唆された。例えば、STK11変異はT細胞浸潤の低下、PD-L1発現の低減、および顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF; CSF3) やIL-8ファミリーサイトカインの高レベルと関連することが報告されている Skoulidis et al. CancerDiscov 2015。また、STK11変異はDC-LAMP (Dendritic Cell Lysosome-Associated Membrane Glycoprotein) 陽性樹状細胞のTMEにおける喪失とも関連するとされる Biton et al. ClinCancerRes 2018。しかし、この免疫抑制的なTME形成の分子メカニズムと、それを治療的に克服するための具体的な戦略は未解明であった。特に、STK11変異がSTAT3シグナル伝達経路にどのように影響し、免疫療法抵抗性を引き起こすのか、そしてSTAT3を標的とすることでこの抵抗性を克服できるのかについては、さらなる詳細な検討が不足している。本研究は、これらの知識ギャップを埋めることを目指した。
目的
本研究は、3つの独立した臨床試験のデータを用いて、非扁平上皮NSCLC患者におけるSTK11機能変異とデュルバルマブ単剤療法およびデュルバルマブ+トレメリムマブ併用療法への抵抗性との関連を検証することを目的とした。具体的には、STK11変異がデュルバルマブ単剤療法 (Study 1108およびATLANTIC試験) およびデュルバルマブとトレメリムマブの併用療法 (Study 006試験) の客観的奏効率 (ORR) および全生存期間 (OS) に与える影響を評価した。さらに、STK11変異を有する腫瘍に特異的な免疫フェノタイプを詳細に解明し、腫瘍微小環境 (TME) および末梢血における免疫細胞集団やサイトカインプロファイルの変化を解析した。最終的に、前臨床モデルにおいてSTK11欠損が引き起こす免疫療法抵抗性の根底にある分子メカニズム、特にSTAT3シグナル伝達の役割を特定し、STAT3標的療法による免疫療法抵抗性克服の可能性を検討することを目指した。これらの目的を達成することで、STK11変異NSCLC患者に対する新たな治療戦略の開発に貢献する。
結果
STK11機能変異はデュルバルマブ単剤および併用療法への抵抗性と関連する: Study 1108とATLANTICの統合解析では、STK11変異 (STK11 mut) 患者の客観的奏効率 (ORR) は5.9% (1/17) であり、STK11野生型 (STK11 wt) 患者の19.5% (32/164) と比較して低い傾向が認められた (P = 0.166)。全生存期間 (OS) はSTK11 mut患者で中央値3.3ヶ月、STK11 wt患者で13.6ヶ月と著明に短縮しており (HR 2.83; 95% CI 1.64-4.89)、治療開始後数ヶ月で生存曲線が乖離した (Figure 1D)。Study 006では、デュルバルマブとトレメリムマブの併用療法において、STK11 mut患者のORRが3.8% (1/26) とSTK11 wt患者の20% (19/95) と比較して有意に低く (P = 0.049)、中央OSも7.5ヶ月とSTK11 wt患者の15.4ヶ月より短縮していた (HR 2.39; 95% CI 1.34-4.25) (Figure 1B, C, E)。KRAS変異状態による層別解析でも、STK11変異と不良なOSの関連は維持されたが、STK11 mut/KRAS wt患者のサンプル数に制約があった。STK11 mut腫瘍では、腫瘍変異負荷 (TMB) はSTK11 wt腫瘍と差がなかったが、PD-L1中央値発現は低い傾向が認められた (Study 1108および006共通) (Supplementary Figure S3B)。これらの結果は、STK11機能変異がデュルバルマブ単剤およびデュルバルマブ+トレメリムマブ併用療法に対する抵抗性を示す主要な因子であることを強く示唆する。
STK11変異腫瘍は免疫抑制的な腫瘍微小環境と末梢免疫プロファイルを示す: 全転写産物解析では、STK11 mut腫瘍において153遺伝子がSTK11 wt腫瘍と比較して有意に過剰発現していた (Fold change ≥ 1.5; P ≤ 0.05)。Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 機能アノテーション解析の結果、これらの過剰発現遺伝子は主に「顆粒球接着」「M1マクロファージおよびTh17細胞によるサイトカイン産生」「自然免疫と適応免疫のクロストーク」に関連するパスウェイに濃縮されていることが判明した (Figure 2A)。具体的には、好中球浸潤および骨髄系免疫抑制に関わるIL-6、CSF3 (顆粒球コロニー刺激因子)、Th17細胞関連のIL17REL (Interleukin 17 Receptor E Like) のmRNAがTMEで増加していた (Figure 2B)。さらに、Study 1108のSTK11 mut患者の血清中IL-8およびIL-6は有意に高値であった (P < 0.01) (Figure 3A)。末梢血フローサイトメトリー解析では、NK細胞、CD4エフェクターメモリーT細胞、CD4 HLA-DR+ T細胞、CD8エフェクターメモリーT細胞、およびCD8 HLA-DR+ T細胞の5つのリンパ球集団が、STK11 mut患者においてSTK11 wt患者と比較して有意に減少していることが示された (ベースラインおよびデュルバルマブ投与後、P < 0.05) (Figure 3B, C, D)。これらのデータは、STK11変異が免疫抑制的なTMEおよび全身性免疫プロファイルを形成し、免疫療法抵抗性に寄与する可能性を示唆している。
STK11欠損はSTAT3シグナルを介した免疫抑制的な腫瘍微小環境を誘導する: CRISPR/Cas9を用いてSTK11遺伝子を欠損させたCT26クローンでは、野生型CT26と比較してin vivoでの腫瘍増殖が増加し (Supplementary Figure S4C)、scRNA-seqおよびフローサイトメトリーによりLy6G+顆粒球様細胞の著明な増加とCD8+ T細胞浸潤および活性化の低下が確認された (Supplementary Figure S5G, S6A)。CD45陰性細胞では、IL-6およびCXCL3 (IL-6RおよびCXCR2を介してSTAT3を活性化するリガンド) のmRNAが有意に上昇していた (Supplementary Figure S5N)。IHCでは、STK11 KO腫瘍のCD45陰性腫瘍細胞・間質細胞およびCD45陽性免疫細胞の双方でpSTAT3+細胞が増加し、pSTAT3+ CD163+ M2様マクロファージの増加も観察された (Supplementary Figure S7A)。The Cancer Genome Atlas (TCGA) 解析でも、STK11 mut NSCLCにおいてpSTAT3 (RPPAデータ) およびSTAT3 mRNAが有意に増加していることが示された (Supplementary Figure S7B)。STK11変異NSCLC PDXのIHCでも、ヒト腫瘍細胞におけるpSTAT3+の増加が確認された (Supplementary Figure S7C, S7D)。STK11 KO CT26腫瘍は抗PD-L1抗体単剤療法で生存率が約0%であったのに対し、STK11野生型CT26腫瘍では約75%の生存率を示し、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、OX40、CD137、ICOSアゴニスト抗体に対して全て抵抗性を示し、STK11の再導入 (STK11ノックイン; KI) により感受性が回復した (Figure 4A-G)。これらの結果は、STK11欠損がSTAT3シグナルを介した免疫抑制的なTMEを誘導し、免疫療法抵抗性を引き起こすことを強く示唆する。
STAT3標的療法はSTK11欠損モデルにおける免疫療法耐性を克服する: STK11欠損CT26モデルにおいて、STAT3 ASO単剤は腫瘍増殖を抑制し、抗PD-L1抗体との二剤併用、さらに抗CTLA-4抗体を加えた三剤併用で著明に増強された深い奏効と有意な生存期間延長が認められた (全比較でP < 0.0001) (Figure 5B, C)。メカニズム面では、STAT3 ASOがTMEのcDC1 (conventional dendritic cell type 1) のCD86+割合を増加させ (抗原提示の活性化)、M2様CD206+およびCD163+骨髄系細胞割合を減少させた (免疫抑制的骨髄系細胞の再プログラム化) (Figure 6A, C, D)。MDSC抑制アッセイでは、STAT3 ASO単剤がMDSCによるT細胞増殖抑制を完全に逆転させ、抗PD-L1および抗CTLA-4との併用でその効果がさらに増強された (Figure 6E)。STAT3 ASO単剤療法はCD8+エフェクターT細胞に部分的に依存し、抗PD-L1と抗CTLA-4との併用効果は完全にCD8+ T細胞に依存することが示された (Supplementary Figure S14A-S14C)。これらのデータは、STAT3標的療法がSTK11欠損による免疫療法抵抗性を克服する有望な戦略であることを示している。
考察/結論
本研究は、STK11機能喪失変異がデュルバルマブ単剤療法およびデュルバルマブ+トレメリムマブ併用免疫療法に対しても抵抗性を付与することを、3つの独立した臨床試験のレトロスペクティブ解析により確認した。これは、STK11変異がニボルマブやペムブロリズマブといった他のPD-1/PD-L1阻害薬のみならず、PD-L1阻害薬およびCTLA-4阻害薬に対しても共通の免疫療法抵抗性機構となることを示す重要なエビデンスである。KRAS変異状態とは独立してSTK11変異が主要な抵抗性決定因子であることも確認された。
先行研究との違い: これまでの研究ではSTK11変異とPD-1阻害薬抵抗性の関連が報告されていたが Skoulidis et al. CancerDiscov 2018、本研究はデュルバルマブ単剤およびデュルバルマブ+トレメリムマブ併用療法におけるSTK11変異の役割を初めて詳細に検討した点で、先行研究と対照的である。特に、STAT3シグナルの過活性化がSTK11喪失による免疫抑制メカニズムの中心的役割を担うことを示唆した点は、これまでの報告を補完し、より深い分子メカニズムを解明した。
新規性: 本研究で初めて、STK11喪失腫瘍が産生するIL-6やCXCL3などのSTAT3活性化リガンドが、TME内のマクロファージ、樹状細胞 (DC)、線維芽細胞、血管内皮細胞にパラクリン的に作用し、過剰なSTAT3活性化を引き起こすことで免疫抑制的なM2様骨髄系細胞や低活性DCの形成が促進されるというメカニズムを提唱した。さらに、STAT3 ASOが複数の免疫抑制性シグナル経路を同時に遮断することでTMEを抗腫瘍方向に再プログラム化し、免疫チェックポイント阻害薬 (ICI) との相乗的な抗腫瘍効果を発揮するという新規な治療戦略を前臨床モデルで実証した Proia et al. ClinCancerRes 2020。
臨床応用: 本知見は、STK11変異を有するNSCLC患者に対するICI治療の層別化と個別化医療の臨床応用に直結する。STK11変異患者はICI単剤や標準的なICI二剤併用では奏効しにくいため、STAT3標的薬との三剤併用療法が戦略的に合理的である。現在臨床開発中のSTAT3標的薬 (ASOやその他の阻害薬) とICIとの組み合わせ試験は、STK11変異患者を富化したデザインで優先的に実施されるべきであるという臨床的含意を持つ。
残された課題: 今後の検討課題として、STAT3 ASOがTME内のどの細胞タイプに特異的に作用し、免疫抑制を解除しているのかをさらに詳細に解明する必要がある。本研究で用いたシンジェニックモデルはヒトのSTK11変異NSCLCの微小環境をよく再現しているが、遺伝子改変マウスモデル (GEMM) などを用いたさらなる検証も今後の研究で必要である。また、STAT3 ASOの薬理学的特性 (間質・骨髄系細胞・Tregへの取り込み促進と腫瘍細胞・リンパ球の温存) がこの文脈で有利に作用した可能性があり、そのメカニズムの深掘りも残された課題である。さらに、本研究の臨床データはレトロスペクティブ解析であり、Guardant360パネルを用いたctDNA解析ではホモ接合性欠失を検出できない可能性があったため、STK11変異の真の頻度が過小評価されている可能性も考慮すべきである。これらの限界を克服するため、より大規模な前向き研究や、異なるSTK11変異検出方法を用いた検証が必要である。
非扁平上皮NSCLCにおけるSTK11機能喪失変異は、デュルバルマブ単剤およびデュルバルマブ+トレメリムマブ併用療法への抵抗性と有意に関連し、KRAS変異状態とは独立した主要な免疫療法抵抗性決定因子である。STK11変異腫瘍ではSTAT3シグナルの過活性化が免疫抑制的骨髄系細胞 (好中球様細胞、M2様マクロファージ) の蓄積とDC活性化障害を介してT細胞排除TMEを形成する。STAT3 ASOは複数の免疫抑制性シグナル経路を同時に遮断することでTMEを抗腫瘍方向に再プログラム化し、免疫チェックポイント阻害薬との相乗的な抗腫瘍効果を発揮する。STAT3標的療法はSTK11変異NSCLCにおける免疫療法抵抗性の克服に有望な治療戦略である。
方法
本研究では、3つの独立した臨床試験 (Study 1108: デュルバルマブ単剤 phase I/II、ATLANTIC: デュルバルマブ単剤 phase II 3L+、Study 006: デュルバルマブ+トレメリムマブ併用 phase Ib 2L+) に登録された非扁平上皮NSCLC患者の腫瘍組織および血液サンプルを対象に、STK11変異状態と免疫療法奏効の関連をレトロスペクティブに解析した。
STK11変異状態は、Study 1108およびATLANTICでは前治療血漿サンプルからの循環腫瘍DNA (ctDNA) のtargeted NGS (Guardant360パネル) により評価された。一方、Study 006では前治療腫瘍組織のNGS (FoundationOne CDxパネル) により評価された。これらの方法論の違いは、ctDNA解析がホモ接合性欠失を検出できない可能性があるため、STK11変異の表現に影響を与える可能性が指摘されている。STK11変異と客観的奏効率 (ORR) および全生存期間 (OS) の関連を解析した (Study 1108 + ATLANTIC: n=181患者、Study 006: n=121患者)。OS解析にはCox比例ハザードモデルとログランク検定を用いた。腫瘍変異負荷 (TMB) およびPD-L1発現レベルも、Study 1108および006のスクリーニング腫瘍サンプルで評価され、STK11変異状態との関連がウィルコクソン順位和検定により解析された。
全転写産物解析 (マイクロアレイおよびIngenuity Pathway Analysis; IPA) により、Study 1108および006のスクリーニング生検における遺伝子発現差異を解析し、STK11変異腫瘍で過剰発現する遺伝子の機能的アノテーションを行った。血清中IL-6およびIL-8はELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) で測定し、末梢血フローサイトメトリーによりNK細胞、CD4/CD8サブセットなどの免疫表現型を解析した。フローサイトメトリーベースの免疫表現型アッセイは、T細胞、B細胞、NK細胞、および活性化T細胞サブセットの絶対数を定量するために用いられ、ウィルコクソン順位和検定により統計的有意差が評価された。
前臨床モデルでは、CRISPR/Cas9を用いてSTK11遺伝子を欠損させたCT26大腸がんおよびEMT6 (マウス乳がん) シンジェニックモデル (STK11ノックアウト; KO) を樹立した。これらの細胞株は、PCRベースのテストにより認証され、マイコプラズマ感染がないことが確認された。STK11 KOモデルを用いて、in vivoでの腫瘍増殖、免疫チェックポイント阻害薬 (CPI) 感受性、免疫表現型 (シングルセルRNAシーケンス; scRNA-seq、フローサイトメトリー、免疫組織化学; IHC)、およびSTAT3シグナルを評価した。特に、scRNA-seqによりLy6G+顆粒球様細胞の増加とCD8+ T細胞浸潤の低下が解析された。STAT3アンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO) と抗PD-L1抗体±抗CTLA-4抗体の三剤併用療法の有効性および薬力学的解析を実施し、骨髄由来免疫抑制細胞 (MDSC) 抑制アッセイも行った。MDSC抑制アッセイでは、Gr1+ MDSCを腫瘍から単離し、CFSE標識T細胞との共培養によりT細胞増殖抑制能を評価した。The Cancer Genome Atlas (TCGA) NSCLCデータベースを用いてpSTAT3 (リン酸化STAT3) およびSTAT3 mRNAの発現を比較し、STK11変異NSCLC患者由来のPDX (patient-derived xenograft) を免疫不全マウス (NSGマウス) に移植したモデルでpSTAT3のIHC解析を行った。統計解析には、GraphPad Prism version 8.0.0を用いた一元配置分散分析 (ANOVA) とDunnett補正、およびログランク (Mantel-Cox) 検定が用いられた。