- 著者: Muhammed Murtaza, Sarah-Jane Dawson, Dana W. Y. Tsui, Davina Gale, Tim Forshew, Anna M. Piskorz, Christine Parkinson, Shy-Kyi Chin, Zoya Kingsbury, Adrienne M. Wong, et al.
- Corresponding author: Carlos Caldas; Nitzan Rosenfeld (Cancer Research UK Cambridge Institute, University of Cambridge, Cambridge, UK)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2013
- Epub日: 2013-04-07
- Article種別: Original Article
- PMID: 23563269
背景
がん患者における治療抵抗性 (drug resistance) の獲得は clonal evolution と治療選択圧による subclonal 増殖の結果であり、その分子機序の解明と新規治療標的の同定には腫瘍ゲノムの 経時的な逐次サンプリング が必須である (Aparicio et al. NEJM 2013)。しかし転移性がん患者で繰り返し組織生検 (repeat biopsies) を行うことは侵襲的かつ実施困難であり、さらに Gerlinger et al. NEJM 2012 が明示したように単一生検は腫瘍の時空間的不均一性 (intra-tumour heterogeneity) を捉えきれず、minor subclone の resistance driver を見逃す危険がある。本研究以前は、(1) Pao et al. PLoSMed 2005 が EGFR T790M を gefitinib 抵抗性の主要機序として組織生検で同定した先行研究や、(2) Diehl et al. NatMed 2008 による標的 single-locus digital PCR で circulating mutant DNA (cmDNA) を量的追跡した先行研究、(3) Forshew et al. SciTranslMed 2012 の tagged-amplicon deep sequencing (TAm-Seq) による特定 hotspot 領域の plasma 解析、などが提示されていた。
しかしこれらはいずれも 既知の hotspot 変異 / 単一座位 / 構造変異 に限定された hypothesis-driven 解析であり、仮説非依存的に exome-wide に治療抵抗性 driver を発見する という観点ではエビデンスが手薄であった。さらに、血漿中 ctDNA の割合は通常 1-20% と低く、希釈された signal を WES (whole exome sequencing) で捉えるには深い coverage が必要で、当時のシーケンス費用・解析感度では実行可能性が未検証であった。「腫瘍進化を非侵襲的に exome wide にリアルタイム追跡できる plasma sequencing platform」 という概念は理論的には可能でも、対照組織との concordance 検証・WES 由来 AF (allele fraction) と digital PCR との一致性検証・複数患者・複数 cohort での連続採血 1-2 年規模の縦断 proof-of-principle は 未解明 であった。この knowledge gap (= 「exome-wide ctDNA tracking が技術的・臨床的に実行可能かが unresolved・不足」) と、それ以前の hotspot-only assay の limitation が controversial に議論されていた状況が、液体生検 (liquid biopsy) の clinical translation を妨げていた。
目的
進行がん患者の血漿循環腫瘍 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) を対象に全エクソームシーケンス (whole exome sequencing, WES) を実施することで、(1) 系統的な治療選択圧下での腫瘍ゲノム進化を非侵襲的かつ exome-wide に追跡できるか、(2) 既知・新規両方の薬剤抵抗性 driver 変異の出現を allele fraction (AF) 変化として定量検出できるか、(3) 同期 metastatic biopsy 組織と血漿 WES の所見が genome-wide に一致するか、という3点の concept proof を提供することを目的とした。
結果
血漿 WES による全 exome 体細胞変異検出と digital PCR との concordance (n=19 plasma samples, 6 patients, ≥2 technical replicates per anchor mutation)：6 例全例で plasma WES から体細胞非同義変異 (somatic non-synonymous mutations) が検出され、Bonferroni 補正後 false discovery rate (FDR) <10% で有意な abundance 変化を示した変異は症例あたり 15-121 個 (median 49)、合計 364 個 同定された (Fig 2)。同一サンプルに対する WES、digital PCR、tagged-amplicon deep sequencing (TAm-Seq) の 3 手法 (= n=3 technical replication methods) による AF 値は Pearson correlation coefficient 0.8 (p<0.0001) で highly concordant、低い ctDNA 比率でも安定した定量が可能であることが確認された (Fig 1, Supplementary Fig 1)。19 検体 (= biological replicates n=19 across 6 patients) のうちすべてで体細胞変異が安定検出された。Copy number aberrations (CNAs、gain・loss いずれも) は全症例で genome-wide に観察され、特に mutant AF >50% の plasma で顕著であった。
Plasma と同期 metastatic biopsy 組織との genome-wide concordance：Case 1 (breast) では plasma または synchronous metastatic biopsy のいずれかで同定された変異 151 個のうち 93 個 (約 62%) が両サンプルで共通、共通変異の AF は plasma 側でより高く、primary tumour にも認められた変異の plasma-biopsy AF correlation r = 0.71、primary tumour に無い変異では r = -0.22 と乖離した (Fig 3a, c)。Case 4 (ovarian) では両サンプル合算 895 個の変異 が同定され、共通 172 個の AF correlation r = 0.72、biopsy 側に private な低 AF (<0.2) 変異が 686 個 検出された (Fig 3b, d)。RB1 E580X 変異は cisplatin 治療後の biopsy で sequencing reads の 95% (59/62) に存在し、13q (RB1 領域) の loss of heterozygosity (LOH) を伴うことが確認された。これらは ctDNA が 複数 metastatic site からの mixture を反映するため、単一生検より広いゲノム情報を提供しうることを示す。
PIK3CA E545K と paclitaxel 抵抗性 (case 1, 乳がん)：Case 1 乳がん例では paclitaxel 治療進行時点で PIK3CA E545K の AF が 14% → 34% へ 2.4 倍上昇 (Table 1)。同変異は [Isakoff et al. CancerRes 2005] で mammary epithelial cells での paclitaxel resistance を駆動することが既に示されており、PI3K-AKT-mTOR pathway 活性化を介した既知の抵抗性機序の plasma WES での初の non-invasive 検出となった (Fig 2a)。同症例ではさらに BMI1 S324Y (AF 3% → 12%、chemoresistance 関連)、SMC4 I1000S (14% → 22%、taxane resistance 関連) の AF 増加も並行同定され、複数 driver の co-selection が示唆された。
MED1 / GAS6 変異と endocrine + targeted therapy 抵抗性 (case 2, 乳がん)：ER+ HER2+ breast cancer の case 2 では、tamoxifen + trastuzumab 後に MED1 S1179X nonsense 変異 が AF 4% → 15% へ上昇 (mediator complex subunit 1, ER co-activator)、後続 lapatinib + capecitabine 治療後に GAS6 splicing 変異 が AF 6% → 30% へ 5 倍上昇した (Fig 2b, Table 1)。GAS6 は AXL receptor tyrosine kinase のリガンドであり、[Liu et al. CancerRes 2009] および [Zhang et al. NatGenet 2012] で AXL 活性化が EGFR-targeted therapy 抵抗性を駆動することが既知であった。同症例ではさらに ATM I2948F (AF 6% → 45%)、PDGFRA D714E (AF 0% → 15%) の出現も観察され、multi-line 治療を経た parallel evolution の縦断証拠を提供した。
RB1 E580X 変異と cisplatin 抵抗性 (case 4, 卵巣がん)：Case 4 卵巣がん例では cisplatin 治療後に RB1 E580X truncating mutation の AF が 14% → 22% へ上昇 (Fig 2d, Table 1)。RB1 は DNA 損傷応答と細胞周期に関わる古典的腫瘍抑制遺伝子で、その機能喪失が chemotherapy resistance に関連することが [Knudsen & Knudsen NatRevCancer 2008] で総括されており、本症例の plasma 変化はその機序と整合する。さらに ZEB2 Y663C (AF 11% → 15%、EMT-related cisplatin resistance、Haslehurst et al. 2012) や MTOR K1655N (AF 8% → 14%、activating、microtubule agent resistance、VanderWeele et al. 2004) も同症例で AF 増加を示し、複数経路 (DNA repair・EMT・mTOR) の収斂的 co-selection が non-invasive に可視化された。
EGFR T790M 変異と gefitinib 抵抗性 (case 6, NSCLC)：EGFR 変異陽性 NSCLC の case 6 では、gefitinib 治療開始前の plasma で T790M が 検出感度以下 (AF 0%) であったのに対し、進行時の plasma で AF 13% で新たに検出 された (Table 1, Fig 2f)。T790M は EGFR kinase domain exon 20 の gatekeeper mutation で、第 1 世代 EGFR-TKI 抵抗性の 最も一般的な機序 (約 50-60%) として Pao et al. PLoSMed 2005 により組織生検で確立されており、本研究は plasma WES での unbiased な exome-wide discovery setup から T790M を同定した最初の報告の 1 つとなった。同例では TP53 Y163C (AF 0% → 14%)・NFKB1 G489V (AF 0% → 17%) の同時出現も確認され、これらは [Wu et al. BBRC 2011] が示した p53 knockdown 下の Aurora-A-NFkB pathway 経由の gefitinib resistance 機序と整合した。
考察/結論
① 先行研究との違い：本研究は plasma DNA を用いた腫瘍評価という先行領域 (Diehl et al. 2008 の single-locus digital PCR、Forshew et al. 2012 の TAm-Seq による hotspot panel、Chan et al. 2013 の plasma low-coverage WGS) と異なり、plasma DNA に対する exome-wide な深い WES (140× median) で hypothesis-free に治療抵抗性 driver を発見できることを初めて示した。これまでの cmDNA / ctDNA 解析は既知 hotspot panel に対象を限定していたが、本研究は対照的に exome 全領域での variant discovery を可能にし、PIK3CA・RB1・MED1・GAS6・EGFR T790M という多様な機序の variant を同一プラットフォームで同時追跡可能であることを実証した。さらに、これまでの single-time-point ctDNA 研究と相違し、1-2 年に及ぶ縦断 (longitudinal) 採血と治療経過の対応付けにより、変異 AF 変化と clinical treatment line の対応を明示した点も新規である。
② 新規性：本研究で初めて、(a) 血漿 cfDNA からの exome-wide WES が技術的に実行可能であること、(b) 6 患者で延べ 19 サンプル・364 変異 規模での経時 monitoring を実現したこと、(c) plasma と同期 metastatic biopsy の genome-wide CNA・SNV concordance を Pearson r = 0.71-0.92 で定量検証したこと、(d) 治療選択圧と AF 変化の対応関係を multi-cancer (breast / ovarian / NSCLC)・multi-drug (taxane / cisplatin / tamoxifen / trastuzumab / lapatinib / gefitinib) で並行実証したこと、を一括で提示した novel な proof-of-principle research である。これまでに報告されていない exome-wide な ctDNA tracking という方法論を確立した点でも novel である。
③ 臨床応用 / Bench-to-bedside：本研究の知見は precision oncology の臨床応用に直接的に橋渡しされている。①治療抵抗性出現の早期検出による治療変更タイミングの最適化、②既知 driver (T790M 等) に基づく次世代 TKI (osimertinib 等) への切替を non-invasive に決定、③hypothesis-free な新規 driver 発見による新規治療標的の同定、④単一 biopsy が捉えられない subclonal heterogeneity の評価、という 4 つの臨床的有用な応用領域が直接導かれる。本研究を起点として、CAPP-Seq・droplet digital PCR・UMI 付き NGS・ddPCR + ctDNA panel など複数の後続技術が臨床現場で実装され、現在は NSCLC EGFR T790M (osimertinib 適応決定)、乳がん PIK3CA (alpelisib 適応決定)、ESR1 mutations (内分泌療法抵抗性評価) 等で plasma ctDNA-based companion diagnostic が承認・実臨床応用されている。臨床応用の橋渡し例として本研究の概念は液体生検フィールド全体の礎となった。
④ 残された課題 / 今後の検討 / limitation：①患者数 n=6 と極めて限定的で、3 がん種のみに限られた点は最大の limitation。多施設大規模 cohort での再現性検証が必要。②検出感度は plasma ctDNA fraction に依存し、本研究では mutant AF が plasma で十分高い (median 10-20% 以上) sample を選択して sequence しており、low tumour burden 早期がんや MRD setting への汎化可能性は別途検証を要する。③シーケンス費用と coverage 要件 (140× exome) は当時の臨床標準を超え、cost-effective な targeted panel approach (CAPP-Seq・FoundationOne Liquid・Guardant360 等) の発展が必要であった。④WES のみでは structural variants (gene fusion, large indels) や methylation 変化を捉えられず、相補的アッセイ (RNA-seq, methylation profiling) との統合が今後の検討課題。⑤本研究は観察研究であり、ctDNA-guided treatment change の臨床的有用性は前向き介入試験 (例: AURA3、FLAURA、DESTINY-Breast 等) での検証を経て初めて立証された。⑥血漿 ctDNA の biological half-life の短さ (約 2 時間) を活かしたよりリアルタイムな treatment response monitoring (e.g. early molecular response assessment)、また minimal residual disease (MRD) detection への展開が future research directions として残されている。
方法
進行がん患者 6 例 (乳がん 2 例 [case 1, 2]、卵巣がん 3 例 [case 3-5]、非小細胞肺がん [non-small cell lung cancer, NSCLC] 1 例 [case 6]、登録: Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK (倫理委員会 REC (Research Ethics Committee) 番号 07/Q0106/63, 08/H0306/61) / 単一 NSCLC 例は National University Health System, Singapore の NCT00809237 hydroxychloroquine + gefitinib 試験) を対象とし、治療経過中に複数時点で採取した血漿サンプル計 19 検体 と対応する正常組織 DNA (末梢血白血球 buffy coat) の WES を実施した。フォローアップ期間 109-665 日 (中央値 433 日)、各患者で 2-5 plasma sample を sequence。Library prep は ThruPLEX-FD (FD = Fragmented DNA kit, Rubicon Genomics) で 2.3-40 ng の DNA input (血漿 2.0-2.2 mL から抽出した 4-20%) を使用、TruSeq Exome Enrichment (Illumina) で exome capture 後 HiSeq2500 で paired-end sequence。average reads per sample = 169 million、unique coverage 31-160× (median 140×) for plasma, 130× for tumour metastasis biopsy, 60× for germline。
変異検出は BWA v0.5.9 で hg19 alignment → Picard で PCR duplicate marking → GATK で local realignment → samtools v0.1.17 で pileup → ANNOVAR (annotation of variants from genome resources) で annotation の標準パイプライン。Mutation calling 基準: germline で mutant read 0、plasma で ≥4 mutant reads (forward / reverse 各 ≥1)、germline coverage ≥10×。Allele fraction (AF) は high-quality reads (phred Q30 以上、Q30 = quality score 30 → base call error rate <0.1%) で定量。多重比較補正は Bonferroni correction (62 million × n 仮説検証)、false discovery rate (FDR) <10% で有意とした。Statistical methods には Pearson correlation (genome-wide concordance)、binomial probability test (AF 変化検定)、Fisher exact test (mutation overlap)、Kaplan-Meier 法に類する time-course モニタリングを併用。Anchor mutations は digital PCR (BioMark Fluidigm 12.765 Digital Array) または TAm-Seq で並列定量 (PIK3CA / MET / ATM / TP53 / EGFR exon19 / T790M 等)。同期 metastatic biopsy 組織 (case 1 sample E1, case 4 sample E2) と plasma WES の比較解析を実施し、copy number aberration (CNA) profile を log R ratio (LRR) で算出。