- 著者: WonJae Lee, Song Yi Ko, Muhaned S. Mohamed, Hilary A. Kenny, Ernst Lengyel, Honami Naora
- Corresponding author: Honami Naora (Department of Molecular and Cellular Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX; hnaora@mdanderson.org)
- 雑誌: Journal of Experimental Medicine
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-11-15
- Article種別: Original Article
- PMID: 30567719
背景
卵巣癌、特に高悪性度漿液性癌 (high-grade serous carcinoma, HGSC) は、女性における癌死因の第5位であり、腹腔内播種による転移が特徴である。患者の約60%が進行期に診断され、そのほとんどの症例で大網への転移が認められる。大網は、胃から垂れ下がるエプロン状の構造で、脂肪組織と結合組織から構成され、中皮細胞によって裏打ちされている。この大網には、リンパ球やマクロファージを主体とする「milky spot」と呼ばれる免疫細胞構造が豊富に存在し、癌細胞が好んで定着する部位として知られている。大網における卵巣癌細胞の増殖は、大網脂肪細胞由来の脂質や、大網線維芽細胞および脂肪間葉系幹細胞から分泌されるサイトカインによって促進されることが報告されている (Nieman et al., 2011; Ko et al., 2012)。しかし、循環する卵巣癌細胞が大網に選択的にホーミングし、定着するメカニズムについては未解明な点が多い。
これまでの研究では、CD44、P-カドヘリン、α5β1インテグリンなどの細胞表面分子が、癌細胞と中皮細胞または中皮下細胞外マトリックスとの相互作用を促進し、卵巣癌細胞の定着を促進することが示されている (Strobel et al., 1997; Iwanicki et al., 2011; Usui et al., 2014)。しかし、すべての内臓表面は中皮細胞で覆われているため、中皮細胞との相互作用だけでは卵巣癌細胞の大網指向性を完全に説明することはできない。
大網は100年以上前から「腹部の警察官」と称され、腹膜防御において重要な役割を果たすことが認識されてきた (Meza-Perez and Randall, 2017)。大網を他の内臓脂肪組織と区別する特徴は、milky spotと呼ばれる高度に血管新生した免疫細胞構造が豊富に存在することである (Hagiwara et al., 1993)。興味深いことに、T細胞、B細胞、NK細胞が欠損したマウスの大網においても、免疫能が正常なマウスと同様に卵巣癌細胞が定着することが観察されている (Clark et al., 2013)。これらの知見は、非リンパ系免疫細胞が大網への卵巣癌細胞の選択的転移に関与していることを強く示唆する。マクロファージは卵巣腫瘍の血管新生や免疫回避を刺激するサイトカインを分泌し (Robinson-Smith et al., 2007; Ko et al., 2014)、最近の研究では、大網におけるマクロファージの密度が疾患の進行とともに増加することが示されている (Pearce et al., 2018)。しかし、マクロファージは腹腔液の細胞成分の約60%を占め、腹腔内の複数の部位に豊富に存在するため (van Furth et al., 1979)、大網への卵巣癌細胞のホーミングの傾向を完全に説明するものではない。
骨髄由来の好中球は、病原体や組織損傷に対する防御の最前線として機能し、通常、大網や腹腔液中には低濃度で存在する (Fruhman, 1960; Cohen et al., 2013)。最近、好中球は腹膜感染や損傷に応答して、大網のmilky spotにある高内皮細静脈 (HEV) と呼ばれる特殊な血管を介して腹腔内に動員されることが報告された (Buscher et al., 2016)。このことから、卵巣癌における転移前大網ニッチの形成には、この部位への好中球の流入が関与している可能性が考えられる。
Peinado et al. NatRevCancer 2017によって確立された転移前ニッチの概念（腫瘍が到達する前に転移を許容する微小環境が形成されること）が卵巣癌の大網転移に応用可能であるかは未検証であった。本研究は、卵巣癌の大網指向性を決定する細胞動態をin vivoで解析し、好中球の動員とNETs形成が癌到達前の転移前ニッチ形成の必須ステップであるかを検証する。
目的
本研究の目的は、卵巣癌の大網への選択的転移における細胞動態をin vivoで詳細に解析することである。特に、好中球の動員と好中球細胞外トラップ (NETs) 形成が、癌細胞が大網に到達する前の転移前ニッチ形成における必須ステップであるかを、同系マウスモデルおよび異種移植マウスモデル、さらに早期HGSC患者の臨床サンプルを用いて検証することを目指す。具体的には、以下の点を明らかにする。
- 卵巣癌の初期段階において、大網への好中球の集積が癌細胞の定着に先行して起こるかどうかを時系列で評価する。
- 好中球の除去（Ly6G抗体による）が、大網転移の形成に与える影響を評価し、好中球が大網転移の開始に必須の細胞種であるかを検証する。
- 好中球のNETs形成を阻害する薬剤（PAD4阻害薬GSK484）および遺伝学的アプローチ（好中球特異的Padi4欠損マウス）を用いて、NETs形成が大網転移に与える影響を評価する。
- 早期卵巣癌患者の大網組織において、NETs形成のバイオマーカーが検出されるかどうかを検証し、NETs形成が臨床的な大網転移の早期イベントである可能性を探る。
- 卵巣癌細胞がNETsに物理的に結合するかどうかをin vitroで評価し、NETsが大網における癌細胞の捕捉に寄与するメカニズムを解明する。
- 早期腫瘍が全身的にNETs形成を誘導する能力を持つかどうかを評価し、大網におけるNETs形成のドライバーを特定する。
これらの検証を通じて、卵巣癌の大網選択的転移における好中球とNETsの役割を包括的に理解し、新たな治療戦略開発の基盤を築くことを目指す。
結果
好中球の大網への転移前集積: ID8細胞をi.b.注入したC57BL/6マウスにおいて、原発腫瘍が確立し触知可能となる3週目の時点で、大網における好中球数が生理食塩水注入対照群と比較して有意に約7倍増加した (p<0.01)。これは、大網転移が触知可能となる4週目よりも前の段階である。同様に、ES2細胞をi.p.注入したヌードマウスモデルでは、癌細胞の定着が最初に検出される5日目よりも前の4日目の時点で、大網における好中球数が約6倍増加した。これらの結果は、好中球が癌細胞のコロニー形成に先行して大網に集積し、転移前ニッチ形成の初期イベントであることを時系列で明確に示した (Figure 2A)。対照的に、マクロファージの数は転移前段階で有意な増加を示さなかった (Figure 2B)。好中球は転移前段階の大網において、PNAd陽性血管の近くに主に局在しており、高内皮細静脈 (HEV) を介した流入を示唆した (Figure 2C)。他の腹膜脂肪組織（腎周囲、生殖腺、腸間膜）では、好中球数の有意な増加は認められなかった。
Ly6G抗体による好中球除去が大網転移を約70%抑制: ID8細胞をi.b.注入したC57BL/6マウスにおいて、原発腫瘍形成が確認された3週目以降にLy6G抗体を週2回、3週間にわたりi.p.投与することで、末梢血中の好中球が有意に減少した (p<0.01)。この好中球除去により、大網転移が対照群と比較して有意に約70%減少した (p<0.01)。一方、原発腫瘍のサイズには有意な差は認められなかった (Figure 3D-G)。この結果は、好中球が大網転移の開始に必須の細胞種であり、その役割が転移選択的であることを示唆する。ES2細胞をi.p.注入したヌードマウスモデルでも同様に、Ly6G抗体による好中球除去が大網への癌細胞定着を有意に抑制した (p<0.01)。
早期HGSC患者大網におけるNETsバイオマーカーの検出: FIGO stage I/IIのHGSC患者の大網組織において、MPO (ミエロペルオキシダーゼ) とcit-H3 (シトルリン化ヒストンH3) の二重陽性細胞、すなわちNETs形成を示すバイオマーカーが、癌のない女性の正常大網組織 (p<0.001) およびstage I/II SLMP (漿液性低悪性度腫瘍) 患者の大網組織 (p<0.01) と比較して有意に高値で検出された (Figure 5C, D)。これは、早期臨床病期の卵巣癌患者において大網でのNETs形成が認められることを示しており、NETs形成が大網転移の早期イベントである可能性、および予防的介入の機会が存在することを示唆する。卵巣癌細胞は組織切片において、cit-H3陽性好中球の近傍に優先的に分布していることが観察された (Figure 6D)。
PAD4阻害薬GSK484および好中球特異的Padi4欠損による大網転移抑制: ES2細胞をi.p.注入したヌードマウスモデルにおいて、PAD4阻害薬GSK484を20 mg/kg/日、9日間投与することで、大網における癌細胞のコロニー形成が有意に抑制された (p<0.001)。また、腹水形成も有意に減少した (p<0.0001)。GSK484は好中球の流入には影響を与えなかったが、大網好中球によるDNA放出を有意に阻害した (p<0.01)。さらに、NETs形成に必須であるPAD4を好中球特異的に欠損させたPadi4-/-マウス（MRP8-Cre × Padi4 fl/fl）では、ID8細胞i.b.注入後6週目の時点で、大網転移がPadi4+/+同腹仔と比較して有意に約70%減少した (p<0.001)。原発腫瘍の成長には両群間で差は認められなかった (Figure 7D-G)。これらの薬理学的および遺伝学的な独立したアプローチは、NETs形成が大網転移にのみ必須であり、原発腫瘍の成長には影響しないことを強く支持する。DNase IによるNETsの分解も同様に大網転移を有意に抑制した (p<0.001)。
NETsを介した卵巣癌細胞の物理的捕捉: In vitroアッセイにおいて、卵巣癌細胞（ID8およびES2）は、NETs陽性好中球に非誘導好中球よりも有意に優先的に接着することが示された (p<0.01) (Figure 6A-C)。この接着は、PAD4依存的なクロマチン脱凝縮とヒストンシトルリン化に必須であることが確認された。腫瘍由来のIL-8、G-CSF、GRO-α/βなどのサイトカインが、好中球の動員とNETs形成の両方を促進するドライバーとして機能することが示された。Padi4-/-マウスの好中球では、NETs形成は特異的に阻害されたが、癌細胞コンディショニング培地に対する走化性は保持されていた (Figure S4D)。これは、NETs形成が癌細胞の物理的捕捉に直接関与していることを示唆する。
早期腫瘍による全身的なNETs誘導活性: ID8細胞のハイドロ早期腫瘍（触知可能となる前）のコンディショニング培地でも、ナイーブ好中球のNETs形成を誘導する能力があることが示された。これは、腫瘍によって誘導される全身性サイトカイン（IL-8、G-CSFなど）が大網における局所的なNETs形成を促進することを示唆する。この結果は、手術や感染が存在しない状況下での純粋な腫瘍内在性メカニズムを証明し、Albrengues et al. Science 2018が提唱した原発腫瘍によって誘導されるNETsの概念と一致する。
考察/結論
本研究は、卵巣癌の大網への選択的転移が、早期腫瘍によって誘導される好中球の流入と好中球細胞外トラップ (NETs) 形成による転移前ニッチ形成に依存することを、in vivoで初めて包括的に証明した画期的な論文である。ID8およびES2の2つのマウスモデルにおける転移の動態解析、Ly6G抗体による好中球除去、PAD4阻害薬GSK484による薬理学的介入、そして好中球特異的Padi4欠損マウスを用いた遺伝学的検証という4つの独立した介入アプローチが、いずれも大網転移を約70%抑制するという収束した結果を示しており、メカニズムの厳密性が非常に高い。さらに、FIGO stage I/IIのHGSC患者の大網組織においてMPO+cit-H3+ NETsが検出されたことは、NETs形成が大網転移の早期イベントであり、早期診断と予防的介入の可能性を示唆する重要な臨床的含意を持つ。
先行研究との違い: これまでの研究では、卵巣癌の腹腔内播種は受動的なプロセスであり、癌細胞が剥離し、腹膜液の機械的流れによって循環し、腹膜表面に定着すると説明されてきた (Tan et al., 2006; Lengyel, 2010)。しかし、本研究は、他の腫瘍タイプで確立された転移前ニッチの概念を卵巣癌の大網転移に応用し、大網指向性が腫瘍と宿主細胞が協調して転移を許容する微小環境を形成する、能動的かつオーケストレーションされたプロセスであることを初めて示した点で、これまでの受動的転移の概念とは対照的である。特に、好中球の役割については、卵巣癌患者における好中球/リンパ球比の上昇が予後不良と関連することが報告されている一方で (Zhou et al., 2017)、Gr1抗体による治療が卵巣腫瘍異種移植片を抑制しないという研究もあり、その意義はcontroversialであった (Robinson-Smith et al., 2007)。本研究は、より特異的なLy6G抗体を用いて好中球を枯渇させることで、大網転移が約70%抑制され、原発腫瘍の成長には影響がないことを示し、好中球の転移促進における役割を明確にした。
新規性: 本研究で初めて、早期卵巣腫瘍が大網への好中球の動員を誘発し、主にmilky spotの高内皮細静脈を介して、この好中球の流入が大網転移に少なくとも部分的に依存することを示した。また、早期卵巣腫瘍がNETs形成を誘導し、NETsが循環する卵巣癌細胞を捕捉することで大網転移を促進するという新規メカニズムを明らかにした。これは、Brinkmann et al. Science 2004によるNETsの発見、Fuchs et al. JCellBiol 2007によるNETosisの提唱以来、癌転移におけるNETsの役割を明確にした重要な知見である。特に、Cools-Lartigue et al. JClinInvest 2013やPark et al. SciTranslMed 2016らの研究がNETsと転移の関連を示唆していたが、卵巣癌の大網指向性という特定の転移部位におけるメカニズムを解明した点で新規性が高い。
臨床応用: 本研究の知見は、卵巣癌の治療戦略に複数の臨床的含意を持つ。第一に、GSK484のようなPAD4阻害薬や、BMS-P5などの新規PAD4阻害薬は、卵巣癌術後の維持療法として、あるいは高リスク患者に対する予防的介入として、大網転移を抑制する可能性を秘めている。第二に、NETsを分解するDNase I（ドルナーゼアルファ）は、大網切除を回避できる早期HGSC患者において、NETs分解治療として有効である可能性がある。第三に、大網切除が標準術式である現状を再評価し、NETs阻害薬がアジュバント療法として大網切除の代替となる可能性も考えられる。第四に、cit-H3やMPOなどのNETsバイオマーカーを血液中で測定することで、HGSCの早期検出パネルの一部として利用できる可能性がある。第五に、BRCA1/2遺伝子変異キャリアなど、卵巣癌発症リスクの高い女性に対するリスク低減手術の前に、NETs形成を阻害する介入が検討されるかもしれない。最後に、化学療法による好中球減少症の予防に用いられるG-CSFがNETs形成を促進する可能性が示唆されたことは、G-CSFの予防的投与の便益と転移促進リスクを比較検討する必要があるという注意喚起となる。
残された課題: 本研究にはいくつかのlimitationが残されている。第一に、マウスモデルはID8同系移植とES2異種移植に依存しており、他のHGSC遺伝子型（BRCA変異、HRDなど）におけるNETsの役割は未検証である。第二に、ヒトにおける検証は、大網組織の免疫組織化学染色10例のみであり、血液中のNETsバイオマーカーによる大規模な検証は行われていない。第三に、Ly6G抗体がLy6C陽性単球も一部除去する可能性があり、好中球除去の特異性には限界がある（ただし、フローサイトメトリーでPMN特異性はほぼ確認済み）。第四に、NETsが癌細胞を物理的に捕捉するメカニズムと、NETsが分泌する因子が癌細胞の成長を刺激するシグナル伝達のどちらが大網転移においてより支配的であるかは、まだ完全に解明されていない。第五に、NETs阻害薬の有効性を、大網切除という標準術式と直接比較するhead-to-head試験は行われていない。第六に、NETs形成以外の好中球機能（プロテアーゼ、ROSなど）が大網ニッチ形成に寄与する可能性があり、これらの寄与を分離して評価する必要がある。今後の研究では、これらの課題を解決し、NETsを標的とした卵巣癌治療のさらなる開発を進めることが期待される。本研究は、Wculek et al. Nature 2015やGranot et al. CancerCell 2011らのNETsと転移に関する研究系譜に、卵巣癌の大網指向性メカニズムという新たな知見を追加した高被引用論文であり、NaoraグループとLengyelグループの融合成果として、今後のNETs標的HGSC予防療法の開発を牽引するものである。
方法
マウスモデル: 卵巣癌の転移モデルとして、免疫能を有するC57BL/6マウスにID8細胞株（ルシフェラーゼおよびGFP安定発現）を卵巣滑液包内 (intrabursal, i.b.) に整形外科的に注入し、同系移植モデルを構築した。また、ヌードマウスおよびNODscid IL2Rγnull (NSG) マウスにES2ヒト卵巣癌細胞（GFP安定発現）を腹腔内 (intraperitoneal, i.p.) に注入し、異種移植モデルを構築した。腫瘍の検出には、生物発光イメージングとフローサイトメトリーを用いた。
好中球除去: 好中球の機能的役割を評価するため、ID8細胞をi.b.注入したC57BL/6マウスに対し、Ly6Gモノクローナル抗体（クローン1A8、200 µg/マウス）を週2回、3週間にわたりi.p.投与した。対照群にはコントロールIgを投与した。好中球除去の有効性は、フローサイトメトリーおよび全血球計算 (CBC) で確認した。
PAD4阻害と遺伝学的検証: NETs形成の必須酵素であるPAD4の役割を評価するため、PAD4阻害薬GSK484（20 mg/kg/日）を9日間連日i.p.投与した。また、好中球特異的Padi4欠損マウス（Padi4 fl/fl マウスとMRP8-Cre-ires/GFPトランスジェニックマウスの交配により作製）を用いて、遺伝学的にNETs形成を阻害し、その影響を評価した。Padi4欠損は定量的RT-PCR (qRT-PCR) で確認した。
臨床サンプル: FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) stage I/IIのHGSC患者およびstage I/IIの漿液性低悪性度腫瘍 (SLMP) 患者の大網組織（各群n=10例）を、癌のない対照群と比較した。これらの組織は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターおよびシカゴ大学のInstitutional Research Boardsの承認を得て、患者のインフォームドコンセントのもとで取得された残余組織を用いた。
検出・解析手法:
- 細胞数定量: フローサイトメトリーを用いて、大網組織中の好中球 (CD11b+Ly6G+) およびマクロファージ (CD11b+F4/80+) の割合を定量した。
- NETs検出: 免疫蛍光染色により、citrullinated histone H3 (cit-H3) およびミエロペルオキシダーゼ (MPO) の二重染色を行い、NETs形成を評価した。Sytox Green/Red色素を用いて、細胞外DNAの放出も検出した。
- 癌細胞接着アッセイ: In vitroで、卵巣癌細胞がNETs陽性好中球に接着する能力を評価した。
- サイトカイン検出: 卵巣癌細胞のコンディショニング培地中のサイトカイン（IL-8、MCP-1、GRO-α/β、G-CSFなど）をサイトカイン抗体アレイおよびELISAで定量した。
- 統計解析: 統計解析にはStatistica 13.1およびPrism 6ソフトウェアを使用し、in vitroおよびin vivoアッセイのデータは、対応のないまたは対応のある両側Studentのt検定で有意差を評価した。患者群間のデータはMann-Whitney U検定で評価した。P値が0.05未満を有意とした。サンプルサイズは、予備研究で観察された異種移植片増殖の分散に基づき、P < 0.05の有意水準と90%の確率でデータ値に50%以上の差を検出するために、各群6匹のマウスが最小数として計算された。