- 著者: Alex H. Wagner, Siddhartha Devarakonda, Zachary L. Skidmore, Kilannin Krysiak et al. (Washington University 連合, Huntsman Cancer Institute)
- Corresponding author: Ramaswamy Govindan, Obi L. Griffith, Malachi Griffith (Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-09-17
- Article種別: Original Article (Translational genomics, Basic + Clinical correlative)
- PMID: 30224629
背景
小細胞肺癌 (SCLC: small cell lung cancer) は肺癌全体の約 13% を占め、極めて悪性度が高い。初回プラチナダブレット化学療法には劇的に反応する一方で、ほぼ全例が早期に再発し化学療法耐性を獲得する。OS (overall survival) 中央値は約 7 ヶ月で、過去数十年間にわたり実質的な改善が得られていない (Govindan et al. JClinOncol 2006)。
SCLC の治療ナイーブ ゲノムは Peifer らの報告 (Peifer et al. NatGenet 2012) や George らの報告 (George et al. Nature 2015)、および Rudin らの報告 (Rudin et al. NatGenet 2012) によって包括的に解析されており、TP53/RB1 両アリル不活化、MYC family 増幅、NOTCH/CREBBP/EP300 変異、ASCL1 (Achaete-Scute Family BHLH Transcription Factor 1) と NEUROD1 を lineage factor とする神経内分泌分化が特徴と判明していた。しかし、これまでの研究において決定的に「不足」していたのは、再発 SCLC ゲノムの体系的解析データが極めて限定的であるという点である。先行コホートに含まれる再発例は 1-2 例レベルに留まっており、治療獲得耐性を駆動する経路は未解明であった。再発時の chemo-resistance 機序として ABCC1 (ATP-binding cassette subfamily C member 1)、MMR (mismatch repair) 異常、神経内分泌分化喪失等が散見されるが体系的同定がないという知識ギャップ (knowledge gap) が存在し、患者由来 paired tissue での同定は欠如していた。本研究はこのギャップを埋めるべく、初めて diagnosis-relapse paired sample を含む 30 例の再発 SCLC コホートを構築した。
目的
再発 SCLC の腫瘍検体 30 例の全エクソームシークエンス (WES) と RNA シークエンス (RNA-seq) を統合し、原発・治療ナイーブ SCLC との比較から再発特異的な遺伝子変異・コピー数変化・経路活性化を同定する。特に化学療法耐性を獲得する機序が未確立であるという課題に対し、WNT/β-catenin canonical signaling の役割を機能解析で実証することを目的とする。
結果
腫瘍変異量とTP53/RB1の普遍的異常: TMB (tumor mutation burden) は治療ナイーブ群 8.31/Mb (range 1.50-16.87) vs 再発群 8.37/Mb (range 1.38-14.04) で有意差は認められなかった (p=0.93、unpaired t-test)。Never-smoker 例 (SCLC17) は 1.4-1.5/Mb と低値であった。C>A/G>T transversion がタバコ smoking signature と一致して両群で富化していた。TP53 変異率は治療ナイーブ 11/12 (92%) vs 再発 29/30 (97%)、RB1 変異率は 10/12 (83%) vs 21/30 (70%)、LoH も加味すると TP53 alteration 100% vs RB1 alteration 93% (再発群) で、両 SCLC 必須変異が再発でも保存されていた (Fig 1)。
再発特異的な有意変異遺伝子とコピー数変化: MuSiC 解析で再発 SCLC に 30 SMGs を同定した (FDR CT Q<0.1)。TP53/RB1 を除いて COL11A1 (collagen type XI alpha 1、Q=8.06e-07) が最高有意性を示した。COL11A1 は ECM 構成因子で卵巣癌 platinum 耐性に関与することが報告されている。GISTIC 解析で再発特異的 CNA を多数同定し、ABCC1 (MRP1: multidrug resistance-associated protein 1) gain (n=7)、MSH2 (MutS Homolog 2) deletion (n=5)、MSH6 (MutS Homolog 6) deletion (n=5) と MSH6 mutation (n=3) は再発特異的に検出された (Fig 1)。
ASCL1低発現サブタイプと神経内分泌分化喪失: MYCL deletion (n=4) を再発特異的に検出した。RNA-seq で ASCL1-low SCLC 比率は再発 50% vs 治療ナイーブ 18% であった (p=0.01、Fisher’s exact test、Fig 2a)。Borromeo らの ASCL1-driven gene expression signature の ssGSEA score は再発群で有意に低下していた (p<0.05、unpaired t-test、Fig 2b) (Borromeo et al. CellRep 2016)。独立検証コホートの ASCL1 IHC では pre-treatment 6/12 ASCL1+ vs post-treatment 0/10 ASCL1+ と有意に減少していた (p=0.0152、Fisher’s exact test、Fig 3a-b)。Matched chemosensitive/resistant SCLC 細胞株対 (DMS53/NCI-H1048) でも ASCL1 と MYCL は耐性株で低下していた (Fig 3c、biological duplicate、unpaired t-test、p<0.05)。
再発腫瘍におけるWNT経路変異の濃縮: APC (adenomatous polyposis coli) 変異 4 例 (33%) と CHD8 (chromodomain helicase DNA binding protein 8) 変異 6 例 (50%) が再発特異的に検出され、mutually exclusive であった。canonical WNT signaling 遺伝子を含めると 24/30 (80%) の再発 SCLC で非同義変異を認め、paired コホートでは 6/12 (50%) で relapse-acquired 変異を確認した。LoH も APC 19/30 (63%)、CSNK1A1 20/30 (67%)、PSMD6 25/30 (83%) と多発していた。原発 vs 再発 SCLC の ssGSEA WNT activation score は 2 つの独立 gene signature 両方で再発群が有意に高値であった (p<0.0001 for each、unpaired t-test、Fig 2c-d)。
APCノックダウンおよび欠失による化学療法耐性誘導: NCI-H1694 (化学療法感受性、APC 野生型) で lentiviral shRNA を用い APC を 80% 以上ノックダウンした。AXIN2 mRNA 発現は qPCR で約 3-5 倍上昇、TOPFlash WNT reporter activity も fold change > 5 で上昇した (n=3-5 biological replicates、unpaired t-test、Fig 4a)。Etoposide 72 時間処理で生存率は shScr 群に対し shAPC 群で有意に上昇し、IC50 fold change は shAPC#2 で約 4-5 倍上昇した (ratio-paired t-test、Fig 4b-c)。Wildtype APC overexpression で耐性が回復した (Fig 4c right)。CRISPR-Cas9 sgAPC による H82 細胞の APC 欠失でも etoposide IC50 が 4.3 倍上昇し (Fig 4f)、AXIN2 mRNA は約 3 倍上昇した (p<0.01、unpaired t-test、n=3 biological samples in technical triplicate、Fig 4e)。CTNNB1 protein 上昇を Western blot で確認した (Fig 4e、n=2 independent experiments、β-Actin loading control)。
化学療法耐性株におけるWNT活性の評価: DMS53 と NCI-H1048 の cisplatin/etoposide 耐性 derivative で CTNNB1・TOPFlash WNT reporter activity が上昇した。IPA upstream regulator analysis で CTNNB1 が top predicted regulator であった (p=2.35e-23 for DMS53、p=2.45e-18 for NCI-H1048、right-tailed Fisher’s exact test)。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、SCLC の治療獲得耐性機序として EZH2-SLFN11 axis を報告した Gardner らの研究や、MYC signature 上昇を報告した Drapkin らの研究と異なり、患者由来 paired tissue を用いた WNT pathway の正確な定量を達成した。先行研究の PDX モデルでは免疫不全マウス使用による selection pressure の違いや paired primary-relapse RNA-seq の欠如により、臨床検体における WNT 活性化の重要性が見落とされていた可能性が高い。
新規性: 本研究で初めて、再発 SCLC 30 例の WES + RNA-seq + 機能解析の統合により、WNT/β-catenin canonical signaling の活性化が化学療法耐性の獲得を駆動することを新規に同定した。具体的には、80% (24/30) の再発例で WNT pathway 遺伝子の非同義変異、APC・CSNK1A1・PSMD6 等 negative regulator の高頻度 LoH、APC shRNA ノックダウンと CRISPR sgAPC 両方の細胞株モデルにおける etoposide IC50 の 4.3 倍上昇、および wildtype APC 再導入による耐性回復を実証した。
臨床応用: 本知見は、再発 SCLC に対する治療戦略の臨床応用に直結する。臨床的有用性として、(1) WNT 経路阻害剤 (tankyrase 阻害剤 XAV939、Porcupine 阻害剤 LGK974、β-catenin 阻害剤 PRI-724 等) の再発 SCLC への応用、(2) APC/CTNNB1 変異ステータスを用いた患者層別化、(3) WNT pathway 阻害剤と化学療法・免疫療法 (ICI: immune checkpoint inhibitor) との併用が期待される。WNT-β-catenin 活性化腫瘍は T 細胞排除と関連することが知られており (Spranger et al. Nature 2015)、併用療法の臨床的意義は極めて大きい。
残された課題: 今後の検討課題として、サンプルサイズが 30 例と小規模であるため、より大規模な検証コホートでの再現性確認が必要である。また、本研究の主要な limitation として、治療ナイーブ例の RNA-seq データの欠如が挙げられる。さらに、ctDNA (circulating tumor DNA) を用いた APC/CTNNB1 の longitudinal なモニタリングの臨床応用や、WNT 経路と SCLC 分子サブタイプ (SCLC-A/N/P/Y) の関連解明、WNT 阻害剤と化学療法・免疫療法併用試験での臨床的有効性検証が今後の課題として残されている。
方法
試料: Alvin J Siteman Cancer Center (Washington University) で SCLC 治療を受けた患者 30 名から再発時 (relapse) 検体を取得、うち 12 例は治療ナイーブ (pre-treatment biopsy) も並行取得し paired analysis を実施。Human Research Protection Office (HRPO) 承認、informed consent 取得。病理診断は 2 名の独立 pathologist (CJO: Christopher J. O’Conor, JHR: Jon H. Ritter) が確認。Germline 解析は末梢血を使用。
シークエンス: Illumina HiSeq による WES (somatic SNV (single nucleotide variant) / indel / CNA (copy number alteration) 検出)、18 例で tumor RNA-seq。Reference genome: GRCh37 / hg19。Alignment: BWA-MEM 0.7.10。Variant calling: SomaticSniper 1.0.2 + VarScan 2.3.6 + Strelka 1.0.11 + GATK Somatic Indel Detector + Pindel 0.5 のコンセンサス。Annotation: Ensembl v74_37。Filtering: 905-normal exome panel-of-normals、ExAC v0.2 < 0.1%、Bayesian classifier (binomial log-likelihood ≥ 10)、IGV (Integrative Genomics Viewer) による manual review。
SMG (significantly mutated genes): MuSiC v0.4 (convolution test、FDR Q<0.1)。CNA: GISTIC 2.0 (Q<0.1) (Mermel et al. GenomeBiol 2011)。LoH (loss of heterozygosity): zygosity score >30 (tumor VAF <20 or >80)。Clonal structure: SciClone 1.0.7。Mutation signatures: deconstructSigs (COSMIC 30 signatures)。
RNA-seq: HISAT (hierarchical indexing for spliced alignment of transcripts) 2.0.5 alignment → Stringtie 1.3.3 expression → Ballgown / ComBat 正規化 → ssGSEA v9.0.6 (single-sample gene set enrichment analysis、MSigDB gene set) で原発 SCLC (George et al. 2015 公開データ 80 例) と比較。
機能解析: APC ノックダウン: SCLC 細胞株 NCI-H1694 (化学療法感受性、APC 野生型) に lentiviral shRNA 2 種 (shAPC#1: exon 16 標的、shAPC#2: 3’ UTR 標的) を導入。Scrambled shRNA (shScr) を対照。Puromycin 選択後、qPCR で APC・AXIN2 (axis inhibition protein 2) 発現を測定 (β-Tubulin 正規化)、TOPFlash assay (TCF/LEF 結合部位レポーター) で WNT 活性測定。Etoposide/cisplatin 用量反応曲線で IC50 (inhibitory concentration 50) を GraphPad Prism variable slope model で算出。統計解析には Student t-test、および ratio-paired t-test を用いた。
機能解析: CRISPR-Cas9 APC 欠失: SCLC 細胞株 NCI-H82 に Lenti-CRISPR-V2-sgAPC を導入、Surveyor mutation detection kit で欠失を検証。Western blot で β-catenin (CTNNB1) protein を測定 (β-Actin が loading control)。
機能解析: 化学療法耐性株: DMS53 と NCI-H1048 細胞株を cisplatin・etoposide で繰り返し処理し耐性株を樹立。Ingenuity Pathway Analysis (IPA) で upstream regulator を解析。
Validation cohort: 12 例の pre-treatment と 10 例の post-treatment 患者由来 SCLC 検体 (Intermountain BioRepository、IRB protocol #1040177) で ASCL1 免疫組織化学 (IHC: immunohistochemistry、antibody clone 24B72D11, 1:200) を実施。統計解析には Fisher’s exact テストを用いた。
Data deposition: dbGAP PHS001049、SRA PRJNA306801。