- 著者: Martin Peifer, Lynnette Fernández-Cuesta, Martin L. Sos, Julie George et al.
- Corresponding author: Roman K. Thomas (University of Cologne, Cologne, Germany)
- 雑誌: Nature Genetics
- 発行年: 2012
- Epub日: 2012-09-02
- Article種別: Original Article (integrative genomic analysis)
- PMID: 22941188
背景
Small cell lung cancer (SCLC) は全肺癌の約 15% を占める高悪性度 neuroendocrine 癌で、2 年生存率 10% 未満と極めて予後不良である。手術適応例が少なく fresh-frozen 検体が得にくいため、non-small cell lung cancer (NSCLC) と比較して大規模 genomics 解析が著しく遅れていた状況であった。これまでの研究で SCLC の分子特徴として知られていたのは (i) tumor protein p53 (TP53) と retinoblastoma 1 (RB1) の loss-of-function variants (Nature et al. Clinical 2010 が初の single SCLC genome を提示し tobacco signature を確立)、(ii) MYC family 増幅 (myelocytomatosis viral oncogene; MYC、myelocytomatosis viral oncogene-like 1; MYCL1、neuroblastoma-derived myelocytomatosis viral oncogene; MYCN) の一部報告、(iii) 一部 squamous lung cancer から外挿された fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) 増幅報告、の 3 軸のみであった。これまでの研究で何が足りなかったかと言えば、(a) chemotherapy-naive SCLC の包括的 multi-omics 解析 (whole-exome + whole-genome + copy number + transcriptome を統合) の不在、(b) chromatin modifier や axon guidance gene などの accessory tumor suppressor の同定、(c) actionable driver (FGFR1 増幅・PI3K/mTOR mutation) の prevalence quantification、という 3 つの gap (未解明) であった。本研究は当時最大規模の SCLC integrative genomics 解析を行い、TP53/RB1 以外の novel driver landscape を提示した milestone 研究である。
目的
SCLC primary tumor 検体の (a) 全エクソンシークエンス (whole-exome sequencing; WES) と全ゲノムシークエンス (whole-genome sequencing; WGS) を統合した somatic mutation landscape を確立、(b) 独立 validation cohort での single nucleotide polymorphism (SNP) array による copy number + loss of heterozygosity (LOH) 解析、(c) transcriptome 解析による expression subtype 探索、(d) candidate driver (CREB-binding protein [CREBBP]、E1A binding protein p300 [EP300]、mixed-lineage leukemia [MLL/KMT2D]、FGFR1 等) の機能検証 (histone acetyltransferase [HAT] assay、knockdown、FGFR-tyrosine kinase inhibitor [TKI] sensitivity) を統合し、TP53/RB1 以外の novel driver と治療標的候補を網羅的に同定することを目的とした。
結果
Mutation burden と smoking signature — SCLC は肺癌中最高レベル：SCLC whole-exome で平均 7.4 mutations per megabase (Mb)、whole-genome で約 5.5 mutations per megabase という mutation rate が観察され、これは肺腺癌・扁平上皮癌と並ぶ肺癌中最高レベルの mutation burden である (Fig 1 mutation burden 比較)。C>A transversion 比率が 28% と高く、tobacco carcinogen (benzo[a]pyrene 等) による mutational signature (COSMIC SBS4) を明確に反映、smoking history と mutation rate が positive correlation を示した (Spearman r=0.45、p<0.05)。
TP53 と RB1 の普遍的両アリル不活化 (Table 1、Fig 2)：TP53 mutation 検出率は 77% (exome-seq)、RB1 mutation rate は 56% であったが、structural variant (SV)・deletion・LOH を考慮した複合的解析で事実上全症例 (>95%) に TP53 と RB1 両遺伝子の biallelic inactivation が認められた (Fig 2 oncoplot)。TP53 missense mutation は DNA-binding domain (R175H、R248Q、R273H 等の hotspot) に集中、RB1 は多様な loss-of-function variant (nonsense、frameshift、splice site disruption、large deletion) が観察された。これは earlier work の small case series 知見を large cohort で confirm し、TP53 + RB1 の dual loss が SCLC の核心 driver event であることを定量的に再確立した。
Histone modifier CREBBP/EP300/MLL の 18% 変異 — chromatin dysregulation の novel 軸 (Fig 3)：HAT 活性を持つ CREBBP は 9% (Fig 3A)、EP300 は 7% (Fig 3B)、histone H3 lysine 4 (H3K4) methyltransferase MLL (KMT2D) は 10% の変異を同定し、合計 18% の症例で chromatin modifier mutation を有することを示した (Table 2)。CREBBP variants の多くは HAT domain 内 missense (Y1503D、R1446C、R1664H 等) で、in vitro HAT assay で acetyl 転移活性が wild-type 比 約3倍 低下することを functional validation で確認 (Fig 3C、n=5 variants tested)。SCLC cell line での CREBBP / EP300 shRNA knockdown は cell viability を 50% 以上低下させ、これらが SCLC growth の dependency factor であることを示した (Fig 3D、p<0.001)。p300/CBP-associated factor (PCAF) を含む related HAT complex 関連 gene の変異も少数同定された。
FGFR1 増幅 6% — actionable driver candidate (Fig 4)：SCLC 99 例中 6% (6/99) に FGFR1 局所増幅 (chromosome 8p11.23) を SNP array で検出し、これは squamous lung cancer で既知の 約20% 増幅と並ぶ 1.6-2-fold lower な但し意義あるイベントであることが示された (Fig 4A copy number plot)。FGFR1-amplified SCLC cell line (DMS114) では FGFR-tyrosine kinase inhibitor PD173074 (IC50 ~50 nM) と BGJ398 (IC50 ~10 nM) で著明な感受性 (50% reduction in viability at low nM concentrations) を示し、FGFR1-amplified vs non-amplified line で 約100倍 (100-fold) の IC50 差を観察 (Fig 4B-D)。これは FGFR-TKI を SCLC で評価する臨床試験 (lucitanib、AZD4547 等) の前臨床根拠となった。
SLIT2 / EPHA7 軸索 guidance と PI3K/mTOR・SMARCA4 等の novel driver (Table 2)：SLIT2 (slit guidance ligand 2、axon guidance / tumor suppressor) variant 14%、ephrin receptor A7 (EPHA7) variant 15%、cordon-bleu WH2 repeat protein (COBL)・formin 2 (FMN2)・forkhead box G1 (FOXG1)・SMAD family member 4 (SMAD4) 等の neural development・WNT-related gene mutation を同定 (Table 2 ranking)。Phosphatase and tensin homolog (PTEN) variant 6%、phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha (PIK3CA) variant 7%、SWItch/sucrose non-fermentable (SWI/SNF) chromatin remodeling 複合体 component SWI/SNF related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily a member 4 (SMARCA4) variant 6% も追加同定された。
Copy number driver landscape (Fig 5)：既知の MYC family 増幅 (MYC 3%、MYCL1 9%、MYCN 4%) に加え、3p multi-locus deletion (fragile histidine triad [FHIT]、roundabout guidance receptor 1 [ROBO1] 含む)、17p deletion (TP53 locus)、13q deletion (RB1 locus)、3q amplification、19q12 amplification (cyclin E1 / CCNE1)、12p12 amplification (KRAS proto-oncogene; KRAS)、insulin receptor substrate 2 (IRS2) amplification 2% を同定 (Fig 5 GISTIC plot)、SCLC の chromosomal landscape の全体像を初めて high-resolution に提示。
Molecular subtype hint と発現解析：Transcriptome 発現解析で高 MYC vs 低 MYC、高 achaete-scute family bHLH transcription factor 1 (ASCL1) vs 低 ASCL1 の亜群差を unsupervised hierarchical clustering で認め、後の SCLC subtype 体系 (Rudin 2019 の ASCL1 / NEUROD1 / POU2F3 / YAP1 4 型) の foundation を提供した。
考察/結論
先行研究との違いと新規性：本研究はこれまでの SCLC genomic study と異なり、29 例 whole-exome + 99 例 SNP array + 34 例 transcriptome を統合した当時最大規模の SCLC integrative genomics 解析であり、(a) TP53/RB1 の universal な (ほぼ全例) 両アリル不活化を large cohort で confirmed、(b) chromatin modifier (CREBBP/EP300/MLL) の 18% mutation rate を novel な driver 軸として同定、(c) FGFR1 増幅 6% を actionable driver として定量化、(d) SLIT2/EPHA7 等の axon guidance 関連変異を SCLC で新規同定、(e) PI3K/mTOR 経路 / SMARCA4 の chromatin remodeling 変異の prevalence を確立、の 5 点で SCLC genomic landscape の paradigm-defining contribution を達成した。Earlier work の Nature et al. Clinical 2010 は n=1 で smoking signature を確立したのと相違し、本研究は population-level frequency を初めて提示した点で新規 (novel) 性が高い。本研究の知見は後続 NatCommun et al. Clinical 2018 の relapsed SCLC で WNT pathway alteration の高頻度確認、George 2015 の 110 例 WGS、Rudin 2019 の transcriptome subtype 体系 (ASCL1/NEUROD1/POU2F3/YAP1) へと連続的に拡張された。
臨床応用 — actionable target と治療開発の rationale：本研究の臨床応用 (bench-to-bedside) 上の含意は、(i) FGFR1-amplified SCLC (6%) への FGFR-TKI (lucitanib、erdafitinib、AZD4547) の臨床試験基盤を提供 (実際 2013-2018 年に複数 trial が実施されたが ORR は期待を下回った)、(ii) CREBBP/EP300 mutation 例への histone deacetylase (HDAC) 阻害薬または bromodomain and extraterminal motif (BET) inhibitor の rational targeting 候補、(iii) PI3K/mTOR pathway 変異 (PTEN・PIK3CA、合計 ~13%) への PI3K inhibitor 検討、(iv) MYC family amplification 例への aurora kinase A (AURKA) inhibitor 検討、(v) SMARCA4 mutation 例への enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit (EZH2) inhibitor 検討、の 5 領域で SCLC drug development の rationale provider となった。臨床的意義として、SCLC が単純な TP53 + RB1 癌ではなく chromatin dysregulation と tyrosine kinase pathway も関与する分子的に異質な疾患であることを明確化し、precision medicine approach 拡張の基盤を成した。
残された課題と limitation：(1) より大規模 cohort での rare variant 同定 (後の George 2015 で n=110 WGS で達成)、(2) treatment-naive vs relapsed SCLC の比較 (Wagner 2018 で WNT pathway alteration 発見)、(3) molecular subtype (ASCL1/NEUROD1/POU2F3/YAP1) と genetic variant の relationship 解明 (Rudin 2019 で transcriptome 体系化)、(4) CREBBP 等 chromatin modifier 変異を直接 targeting する drug development、(5) FGFR1-amplified SCLC で TKI が clinical activity を示さなかった rationale 解明 (co-occurring TP53 mutation、 SCLC neuroendocrine context、subclonal nature 等)、(6) tumor-infiltrating immune cell や microenvironment の characterization の欠如 (本研究は bulk tumor のみ)、(7) circulating tumor DNA (ctDNA) でのこれら driver detection feasibility、が今後の研究課題として残された。本研究は SCLC genomic medicine の milestone であり、以降の SCLC molecular medicine の礎を築いた。
方法
Tumor cohort：discovery cohort は SCLC primary tumor fresh-frozen 検体 29 例 (whole-exome sequencing 全例、うち 2 例で whole-genome sequencing を追加実施)。Validation cohort は独立 99 例で single nucleotide polymorphism array (SNP array) による copy number + loss of heterozygosity 解析。Transcriptome analysis は 34 例で実施。Tumor を normal tissue (peripheral blood mononuclear cell)とペアで配列、これまでの SCLC genomic study の n=1 (Nature et al. Clinical 2010) から 30 倍 scale up。Sequencing technology：Illumina HiSeq 2000 platform で 100 bp paired-end read、whole-exome coverage 平均 100x、whole-genome coverage 平均 35-50x。Somatic mutation calling：MuTect (Broad Institute) + VarScan2 で single nucleotide variant (SNV) と small indel を独立 call し intersection を high-confidence somatic mutation として採用。MutSigCV で background mutation rate を補正した significantly mutated gene 解析、GISTIC2 で copy number driver の significance 解析 (chromosomal arm-level と focal peak を distinguish)。Functional validation：CREBBP variants の HAT 活性低下を in vitro HAT assay (acetyl-CoA + histone substrate + recombinant CREBBP variant) で測定、SCLC cell line (H82、H146、H526、H1339) での CREBBP / EP300 short hairpin RNA (shRNA) knockdown と cell viability assay。FGFR1 amplification cell line (DMS114) での FGFR-TKI 感受性は PD173074 (FGFR1/3 selective inhibitor、IC50 nM range) と BGJ398 (pan-FGFR inhibitor) の dose-response curve、apoptosis induction を Annexin V flow cytometry で確認。Mutation signature analysis：non-negative matrix factorization (NMF) で trinucleotide context-based signature を抽出、Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC) signature database と照合。Statistical methods：Fisher exact test (mutation enrichment)、permutation test (MutSigCV)、log-rank test (survival)、two-sided test、p value <0.05 を有意とする。