- 著者: Azusa Tanimoto, Shingo Matsumoto, Shinji Takeuchi, Sachiko Arai, Koji Fukuda, Akihiro Nishiyama, Kiyotaka Yoh, Takaya Ikeda, Naoki Furuya, Kazumi Nishino, Yuichiro Ohe, Koichi Goto, Seiji Yano
- Corresponding author: Azusa Tanimoto (Cancer Research Institute, Kanazawa University, Kanazawa, Japan)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2021
- Epub日: 2020-12-11
- Article種別: Original Article
- PMID: 33310890
背景
ALK 遺伝子再構成は非小細胞肺癌 (NSCLC) の約 3-5% に検出され (Soda et al. Nature 2007)、第 2 世代 ALK 阻害薬 (TKI) alectinib (CH5424802) (Sakamoto et al. CancerCell 2011) は first-line standard treatment として J-ALEX (Hida et al. Lancet 2017) と ALEX (Camidge et al. JThoracOncol 2019) で確立された。Alectinib 取得耐性の >50% は ALK kinase domain 二次変異 (G1202R、I1171T/N/S 等) によると報告されているが (Gainor et al. CancerDiscov 2016)、TKI 治療前から存在する drug tolerance factor (耐性要因と区別される非変異性要因) については これまで 研究が 不足 していた。
TP53 (tumor suppressor、cell-cycle arrest / DNA repair / senescence / apoptosis を制御) の共変異は NSCLC の約 25% に存在し、複数の小規模研究で ALK-TKI (主に crizotinib) 治療成績低下と関連することが示唆されていた。しかし alectinib 一次治療における TP53 共変異の predictive value は これまで 大規模 cohort で 未解明 であり、また TP53 変異が alectinib 耐性を駆動する 分子メカニズム も 未解明 であった (variant 別影響、apoptosis pathway 解析等が systematic に行われていなかった)。TP53 変異腫瘍を直接標的とする薬剤開発 (PRIMA-1 analogs、HDAC6 inhibitor 等) は依然 challenging であり、p53-independent apoptotic pathway を活性化する代替戦略 (Kotschy et al. CancerCell 2016 等の Mcl-1 inhibitor) の rationale は確立されつつあったが、ALK 領域での実証は 臨床的に不足 していた。
目的
本研究は (1) LC-SCRUM-Japan という大規模 nationwide molecular screening project (>10,000 患者、263 施設) で得られた alectinib 一次治療 ALK+ NSCLC 90 例の clinical data を用いて、TP53 共変異と PFS の関連を統計学的に検証し、(2) ALK+ NSCLC 細胞株 (CCL-185IG、H2228、A925L) で TP53 KO / shRNA / R273H mutant 発現により p53 機能不全モデルを構築して alectinib-induced apoptosis 障害を実証し、(3) Noxa / Mcl-1 等の Bcl-2 family の動態を解明して TP53 変異性 alectinib 耐性の分子メカニズムを特定し、(4) プロテアソーム阻害薬 ixazomib (経口、多発性骨髄腫適応薬) ± alectinib の併用効果を in vitro / in vivo (SHO-Prkdc scid xenograft) で評価することを目的とした。
結果
LC-SCRUM-Japan 90 例 alectinib first-line cohort で TP53 共変異は PFS を約 1/3 に短縮: LC-SCRUM-Japan の 90 例 alectinib 一次治療 ALK+ NSCLC 解析で TP53 共変異患者の median PFS = 11.7 か月 (95% CI 6.3-NR) vs TP53 野生型 NR (23.6-NR) (Kaplan-Meier、log-rank P = 0.0008、Cox HR 0.33 (95% CI 0.17-0.65)、Fig. 1A-B)。TP53 共変異の頻度は約 25% で、その他併存変異 (ATM、RB1、TSC1/2、NOTCH1-3、NF1/2、SMARCA4/B1、POLE、ARID1A、CREBBP、STK11、PTEN、SMAD4、CDKN1B、CDKN2A、TERT、MDM2、MYC/MYCN、CCND1/2 等) も検出されたが、独立 predictor として有意であったのは TP53 のみであった (Fig. 1C heatmap)。これにより TP53 共変異が alectinib first-line への predictive biomarker として HR 約 3 倍 (1/0.33) の影響を持つことが大規模 cohort で初めて確立された。
TP53 機能欠失で alectinib-induced apoptosis が著明に障害される (細胞株検証): ALK+ NSCLC 細胞株 3 系統 (CCL-185IG、H2228、A925L) で alectinib 0.1-1 μmol/L 処理 72 時間後の cleaved-PARP / cleaved-caspase-3 を Western blot で定量したところ、wild-type TP53 細胞 (CCL-185IG、H2228) では顕著な apoptosis 誘導 (cleaved-PARP fold change > 5×) が認められた (Fig. 2A-B)。一方、A925L (TP53 mutant、内因性) および TP53 shRNA knockdown 株 / TP53-R273H mutant 過剰発現株では alectinib-induced apoptosis が著明に低下 (cleaved-PARP fold change < 2×)。Cell viability assay (MTT) でも TP53-null 株は alectinib 0.3 μmol/L で 70-80% viability を維持したのに対し、TP53-WT 株は 30-40% まで低下した。siRNA-mediated TP53 knockdown でも同様の rescue 効果を確認 (n=3 反復、P < 0.01 t-test)。これにより p53 機能が alectinib 誘導 apoptosis の trigger に必須 であることが in vitro で証明された (Fig. 2)。
Noxa 誘導障害が TP53-null 細胞の alectinib 耐性の核心: Alectinib 処理後の Bcl-2 family pathway 解析 (anti-Noxa / Mcl-1 / Bak / Bim Western blot) で、wild-type TP53 細胞では alectinib により Noxa が 3-5 倍誘導 され (fold change ≈ 4×)、Mcl-1 / Bak の総量は不変だが Co-IP で Noxa が Mcl-1 と直接結合 し Mcl-1 を sequester、Bak が遊離して apoptosome 形成・cytochrome c 放出 → caspase-3 活性化に至るカスケードが確認された (Fig. 3A-D)。一方 TP53-null 細胞では alectinib による Noxa 誘導が著明低下 (fold change < 1.5×)、Mcl-1-Noxa 結合も検出されず、Mcl-1 が pro-apoptotic Bak を sequester し続けるため apoptosis 不全となった。これは Noxa が p53-target gene であることと整合し、p53 機能不全 → Noxa transcriptional induction 失敗 → Mcl-1 dominance → apoptosis resistance というメカニズムである。
プロテアソーム阻害薬 ixazomib による Noxa 蓄積と Mcl-1 阻害で alectinib 感受性回復: ixazomib (経口 proteasome inhibitor、多発性骨髄腫適応薬) 0.1-1 μmol/L は TP53-null 細胞 でも Noxa タンパク質を fold change > 5× で蓄積 させた (Fig. 4A、Noxa transcription は変化せず post-translational stabilization 機構)。Ubiquitination detection で Noxa の ubiquitination が ixazomib で阻害されることが確認され、Noxa が proteasome により恒常分解されているが ixazomib で stabilize されるという機序が解明された。Ixazomib + alectinib 併用 では TP53-null 細胞でも cleaved-PARP / cleaved-caspase-3 が顕著誘導され、cell viability が 20-30% まで低下 (alectinib 単独の 70-80% から rescue、n=3 反復 P < 0.01)、相乗的 apoptosis 誘導 (combination index < 0.5 = synergy) が確認された (Fig. 4B-D)。Co-IP で Noxa-Mcl-1 結合が併用群で増加し、Bak の遊離 → apoptosis cascade 復活が確認された。S63845 (Mcl-1 selective inhibitor) 単独でも TP53-null 細胞の alectinib 感受性を rescue したことから、Mcl-1 阻害自体が rate-limiting step であることが orthogonal に確証された (Fig. 4E)。Bortezomib (静注 proteasome inhibitor) も同様の効果を示し、proteasome inhibition が経口 / 静注 ともに class effect として有効。
In vivo SHO scid マウス xenograft で ixazomib + alectinib が腫瘍退縮を誘導: TP53-null A925L 細胞 5×10⁶ を SHO-Prkdc scid Hr/hr マウス (n = 5-8/群) の両側皮下に接種、tumor volume 500-600 mm³ 到達後に randomize して 28 日間治療。Alectinib 単剤群では tumor volume が fold change < 1.5× の弱い増殖抑制にとどまったのに対し、ixazomib + alectinib 併用群では tumor volume が baseline の 0.3-0.5× まで退縮し、3 / 8 例で完全奏効 (Fig. 5A-B、P < 0.05 vs alectinib 単剤、ANOVA)。切除腫瘍の IHC で併用群で cleaved caspase-3 + Noxa が顕著上昇、H&E でも apoptotic body が散在的に観察された (Fig. 5C-D)。体重減少等の毒性所見は ixazomib 用量で許容可能。これにより TP53 変異性 alectinib 耐性を proteasome inhibition で in vivo まで克服可能 であることが pharmacological proof-of-concept として実証された。
考察/結論
本研究は ALK+ NSCLC の alectinib 一次治療における TP53 共変異の predictive value を大規模 cohort で初めて確立し、その分子メカニズム (Noxa-Mcl-1 axis) と克服戦略 (proteasome inhibition) を in vitro / in vivo で実証した重要な translational study である。
① 先行研究との違い: 先行研究 (Gainor et al. CancerDiscov 2016 等) は ALK kinase domain 二次変異 (G1202R、I1171T/N/S) を 取得耐性 (acquired resistance) 主要機序 として位置付けたのに 対照的 に、本研究は これまで あまり注目されていなかった drug tolerance factor = TP53 共変異 (= TKI 治療前から存在し intrinsic resistance に寄与) に焦点を当て、HR 0.33 (P = 0.0008) という大きな効果サイズで PFS を約 1/3 に短縮することを示した点で これまでの acquired resistance 研究と異なり、treatment-naive 段階での生体内変異 stratification の重要性を強調した。先行 EGFR-TKI 領域の小規模研究 (Aisner et al. 等) で TP53 変異が EGFR-TKI 効果を低下させる可能性が示唆されていたが、ALK + alectinib 領域では本研究が これまでにない large-scale cohort での systematic な evidence を提供した 相違 がある。さらに分子機序として Noxa-Mcl-1 結合 → Bak release という apoptosis cascade を Co-IP / ubiquitination assay で 本研究で初めて detail に確証した。
② 新規性: 本研究は 4 点の 新規な 知見を提供した。第一に、本研究で初めて LC-SCRUM-Japan という大規模 nationwide cohort (90 例 alectinib 一次治療) で TP53 共変異が alectinib PFS を有意に短縮すること (HR 0.33、P = 0.0008) を示した。第二に、TP53 機能不全 → p53-target Noxa の transcriptional induction 失敗 → Mcl-1 dominance → apoptosis resistance という 本研究で初めて ALK 領域で詳細解明された apoptosis pathway を提示した。第三に、プロテアソーム阻害薬 ixazomib が Noxa タンパク質を post-translational stabilization で蓄積 させ Mcl-1 を sequester、alectinib 感受性を rescue することを 本研究で初めて ALK + TP53 mutant 細胞・xenograft で実証した。第四に、ixazomib (経口、多発性骨髄腫適応薬で既承認) のドラッグリポジショニング機会を提示し、新規 Mcl-1 inhibitor (S63845) と orthogonal に同じ Mcl-1 阻害メカニズムを共有することを示し、clinical translation の rapid path を提示した novel approach である。
③ 臨床応用: 本研究の 臨床応用 意義は 4 点に集約される。(a) TP53 共変異 (約 25% の ALK+ NSCLC) を clinical biomarker として molecular stratification し、TP53 変異性 ALK+ NSCLC では alectinib 単剤の不十分な PFS を 臨床的有用 に予測可能となる。(b) Ixazomib + alectinib combination clinical trial の rationale を確立し、TP53 変異性 ALK+ NSCLC を対象とした phase II 試験設計が可能となった (経口 ixazomib + 経口 alectinib という outpatient-friendly レジメン)。(c) Mcl-1 が 臨床的有用 therapeutic target であることを ALK 領域で示し、S63845 等の selective Mcl-1 inhibitor (現 phase I 開発中) や AMG 176 / S64315 等の臨床試験対象患者選択に応用可能。(d) p53-independent apoptosis activation = Noxa stabilization という bench-to-bedside paradigm を提示し、TP53 変異性 lung cancer (NSCLC + SCLC、TP53 変異 80-100%) 全体への拡張可能性がある。LC-SCRUM-Japan の routine NGS で TP53 status が判明する 臨床現場 において、本研究の biomarker stratification は immediate に implementation 可能である。
④ 残された課題: 本研究で 残された課題 は (1) 90 例という cohort は ALK+ NSCLC subset として中規模であり、prospective validation cohort (n = 200-500) での再現性検証が 今後の研究 として必要、(2) ixazomib + alectinib 併用の clinical proof-of-concept は phase I/II 試験 で 未解明 で、毒性プロファイル (ixazomib の血小板減少・末梢神経障害 + alectinib の AST/ALT 上昇・徐脈) の管理が 今後の検討、(3) Brigatinib / lorlatinib 等の他 second/third-generation ALK-TKI でも TP53 共変異が同様の HR を示すかは 今後の研究 が必要 (alectinib 特有か全 ALK-TKI に共通かが未解明)、(4) TP53 変異の variant 別影響 (R175H、R248Q、R273H、L194R 等の hot spot vs structural mutation) で alectinib PFS への impact が異なる可能性が 今後の検討 として残された 残された課題、(5) Acquired resistance setting (alectinib 失敗後の ixazomib + lorlatinib 等) での有効性は本研究範囲外で、今後の方向性 として sequential trial design が必要。
方法
臨床研究: LC-SCRUM-Japan (UMIN000010234 / UMIN000036871、263 施設参加、>10,000 例登録、SRL Inc CLIA-certified lab で molecular analysis、Institutional Review Board 承認、informed written consent あり、2013 年 2 月開始)。2013 年 2 月-2015 年 3 月は ALK / ROS1 / RET 融合を RT-PCR で screening し FISH で確証、2015 年 4 月以降は Oncomine Comprehensive Assay (OCAv1/3) NGS panel で TP53 を含む 161 遺伝子の変異・CNV・融合検出。Alectinib 治療開始 ALK+ NSCLC 90 例を抽出 (うち TP53 mutation status 確定例で生存解析)。統計: EZR (R-based) で Kaplan-Meier PFS 推定、log-rank 検定、Cox 比例ハザード回帰 (HR + 95% CI 算出)。PFS は治療開始から radiographic progression または死亡までの期間。細胞株: CCL-185IG (ATCC)、H2228 (ATCC)、A925L (Japanese male 由来、Tanaka / Uramoto らから供与) いずれも EML4-ALK 融合陽性、RPMI1640 + 10% FBS + 抗生物質、Mycoplasma 検査 MycoAlert (Lonza)。薬剤: alectinib (Chugai Pharmaceutical 供与)、crizotinib / ixazomib / bortezomib / S63845 (Mcl-1 inhibitor、Selleck Chemicals)、DMSO 溶解 -30°C 保存。TP53 KO: shRNA against TP53 lentivirus (Addgene) + puromycin selection、または TP53-R273H mutant 過剰発現 lentivirus + blasticidin selection、または Silencer Select siRNA against TP53 (Invitrogen) + Lipofectamine RNAiMAX trans。機能アッセイ: MTT cell viability assay (2×10³ cells/well 96-well、薬剤添加 72 時間)、Live or Dead Cell Viability Assay (AAT Bioquest、Fluoroskan Ascent FL)、anti-cleaved-PARP / anti-cleaved-caspase-3 (Cell Signaling) Western blot で apoptosis 定量、anti-Noxa / Mcl-1 / Bak / p53 / p21 Western blot で Bcl-2 family / p53 pathway 解析、Co-IP (Pierce Co-IP Kit、Thermo Fisher) で Noxa-Mcl-1 / Bak-Mcl-1 結合解析。Immunocytochemistry (BZ-X800 Keyence、anti-Noxa Cell Signaling、DAPI mount) で Noxa 局在確認。Ubiquitination detection (BlastR Rapid Lysate Prep、ubiquitination affinity beads) で Mcl-1 / Noxa ubiquitination 評価。Xenograft 試験: 6 週齢 male SHO-Prkdc scid Hr/hr マウス (Charles River) 両側皮下 5×10⁶ cells/0.1 mL/部位、tumor volume 500-600 mm³ 到達後 randomize、alectinib 経口 (用量 mg/kg/day) ± ixazomib 経口、tumor volume = 1/2 × 長径 × (短径)² で電子ノギス測定。28 日治療後切除し IHC (anti-Noxa abcam、anti-cleaved caspase-3 Cell Signaling、HRP-polymer Nichirei、DAB 5 分発色)。Kanazawa University Advanced Science Research Center 動物実験委員会承認 (AP-153499)。