- 著者: Wenting Liao, Michael J. Overman, Adam T. Boutin, Xiaoying Shang, Di Zhao, Prasenjit Dey, Jiexi Li, Guocan Wang, Zhengdao Lan, Jun Li, Ming Tang, Shan Jiang, Xingdi Ma, Peiwen Chen, Riham Katkhuda, Krittiya Korphaisarn, Deepavali Chakravarti, Andrew Chang, Denise J. Spring, Qing Chang, Jianhua Zhang, Dipen M. Maru, Dean Y. Maeda, John A. Zebala, Scott Kopetz, Y. Alan Wang, Ronald A. DePinho
- Corresponding author: Y. Alan Wang (yalanwang@mdanderson.org); Ronald A. DePinho (rdepinho@mdanderson.org) — Department of Cancer Biology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030, USA
- 雑誌: Cancer Cell
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-03-18
- Article種別: Original Article
- PMID: 30905761
背景
大腸癌 (colorectal cancer、CRC) は世界の癌死亡の主要原因で、米国では年間 5 万人が CRC で死亡し、約 20% が診断時に metastatic disease、metastatic CRC の 5 年生存率は 12-14% にとどまる (Le et al. Science 2017 PD-1 blockade in MSI-H tumors)。Immune checkpoint blockade (ICB) は melanoma・NSCLC・renal cell carcinoma で durable response を実現したが、CRC では 対照的 に MSI-H/dMMR (microsatellite instability-high/mismatch-repair deficient) subset (約 4-5%) のみで奏効し、majority の MSS (microsatellite-stable) CRC は無効である (Le et al. NEnglJMed 2015 KEYNOTE-016、Overman et al. 2017 CheckMate 142)。これまで MSS CRC の primary ICB resistance 機序は 不足 で、neoantigen load の低さ (Schumacher & Schreiber Science 2015 neoantigen review)、tumor-intrinsic IFNγ pathway defect (Sharma et al. Cell 2017 resistance review)、immune-suppressive microenvironment の役割が議論されてきた。
KRAS 変異 (KRAS*、majority は KRAS G12D) は APC・TP53 不活化と並ぶ CRC の signature mutation で、35-50% に存在し、disease aggressiveness と metastasis に正相関する。EGFR (epidermal growth factor receptor) 阻害薬の clinical efficacy を impair し、downstream pathway 標的療法 (MEK 阻害等) の response も meager である。これまで Large-scale expression profiling では CMS (consensus molecular subtype) classification と 28 immune gene response cluster の組合せで KRAS* CRC が relatively poor immune infiltration (CD4+ T cell 低)・inhibitory molecule (CTLA4・PDL1・PDL2・LAG3・TIM3) 低発現を示す relatively descriptive な特徴付けが報告されてきた (Lal et al. 2015、Guinney et al. 2015)、TCGA CRC dataset 解析でも KRAS* tumor が Th1-centric immune response cluster 低・cytotoxic cell infiltration 低を示すパターンが示された (Lal et al. 2018) と異な り、KRAS* がどのような分子機序で immune microenvironment を modulate し ICB primary resistance を driver するかの mechanistic dissection は controversial で systematically 解明されていなかった。
2019 年時点の gap in knowledge：(1) KRAS* の immune-suppressive microenvironment driver としての mechanistic 直接証拠 不足、(2) KRAS* → IFN pathway suppression の transcriptional regulator 同定が 手薄、(3) MDSC (myeloid-derived suppressor cell) infiltration が KRAS* CRC で多いことは認知されていたが responsible chemokine signaling 未解明、(4) KRAS* CRC の anti-PD-1 resistance を overcome する therapeutic strategy が 何が足りなかったか を構成していた。
目的
本研究の目的は、(1) 変異 KRAS (KRAS* = KRAS G12D) が CRC tumor immune microenvironment に与える直接的影響を inducible mouse model で mechanistic に dissect、(2) KRAS* → IFN response suppression の transcriptional mediator を identify、(3) MDSC recruitment を駆動する chemokine signaling pathway を 1 軸で同定、(4) IRF2 restoration or CXCR2 inhibition による anti-PD-1 resistance overcome の preclinical proof-of-principle を実証、(5) ヒト CRC sample (TCGA n=633) で KRAS-IRF2 mutually exclusive 関係を validate、することである。
結果
KRAS は immune-suppressive microenvironment を CRC で promote*：iAP (n=3) vs iKAP (n=3) primary CRC の CyTOF immunophenotyping で、iKAP tumor は CD45+CD11b+ myeloid cells が iAP に対して有意増加、特に MDSC (PMN-MDSC subset、fold change ≈ 3-5 倍) が dramatically up、T cells (特に CD4+) は significantly down (約 50% 減、p<0.01) (Fig 1A-B)。Dox withdrawal (KRAS* extinction、1 week) で MDSC 減少 + T cell 増加 (Fig 1C、each n=3)。CD4+FOXP3+ Treg も iKAP で減少、KRAS* extinction で回復 (Fig S1G-H)。MDSC は S100A8・S100A9・ARG1 (arginase 1)・iNOS (inducible nitric oxide synthase) を高発現 (n=3 biological replicates、Student’s t-test *p<0.05、**p<0.01)、CD3/CD28-stimulated T cell proliferation を強く抑制 (Fig 1E-F、n≥3)、IFNγ ELISA で CD8+ T cell IFNγ 分泌が 5-10 倍減 (Fig 1G、n=3、p<0.001)。Anti-Gr-1 treatment で MDSC depletion + T cell 回復が確認 (Fig S1K-L)。
KRAS は IFN responses を suppress、IRF2 が transcriptional mediator として同定された*：RNA-seq IPA analysis (iAP n=8 vs iKAP n=7、SRP097890) で IFNγ と IFNα response が iKAP で最も significant down-regulated pathway (Fig 2A)。Primary iKAP cell line (n=6/group、Dox-on vs Dox-off 24h) でも同じ IFNα/γ signature pattern (Fig 2B)。Real-time qPCR で IRF9・STAT1・STAT2 等 IFN-stimulated gene が KRAS*-on 群で 5-10 倍 down、Dox-off 24/48h で回復 (n=3 independent experiments、mean ± SD、Fig 2C)。3 dataset triangulation: (i) IFNα/γ signature genes (n=223)、(ii) invasive vs non-invasive iKAP の differentially expressed (fold change >1.5、p<0.05、n=5,727)、(iii) human CRC で KRAS mutation と mutually exclusive (p<0.05、n=56) — 共通単一遺伝子として IRF2 を同定 (Fig 2D)。TCGA CRC dataset (n=633) で IRF2 deletion と KRAS mutation が mutually exclusive pattern を確立 (Fig 2E、p<0.05)、肺癌・胃癌でも同パターン (Fig S2B)。
IRF2 enforced overexpression が IFN signaling と ISG を回復：iKAP cells に IRF2 enforced overexpression で IFNα/γ signature 上昇 (microarray IPA、Fig 3C)、STAT1/STAT2/IRF9/IRF7・RTP4・IFITM1・IFIH1・PSMB9/10・B2M・CASP1/7 等 ISG (interferon-stimulated gene) が up-regulated、IRF2 overexpression-iKAP cells で 3-10 倍の fold change (Fig 3D、n=3 mean ± SD)。ChIP-seq で IRF2 が IFN response gene promoter (Ifitm1、Irf7、Aim2 等) に direct binding peak を示し (Fig 3E)、IRF2 が IFN response gene の direct transcriptional activator として機能。
CXCL3-CXCR2 軸が MDSC migration の central mediator：Conditioned medium transwell migration assay で MDSC migration が KRAS* extinction + IRF2 overexpression で 3-5 倍減 (Fig 4A、triplicate biological replicates)。MC38 cells (Kras-WT、高 IRF2) で shIRF2 knockdown により MDSC migration in vitro 3-5 倍増、syngeneic C57BL/6J mouse 移植実験で MDSC infiltration 増加 (Fig 4B-D、n=5-7 mice/group、p<0.01)。114 cytokine/chemokine expression intersection with IRF2 ChIP-seq → CXCL3 が IRF2 binding を伴う唯一の chemokine (Fig 4E-F、ChIP-PCR validation、IRF2 overexpression で binding 増強)。Real-time qPCR と ELISA で CXCL3 expression/secretion が IRF2 overexpression または KRAS* extinction で 5-10 倍減 (Fig 4G-H、n=3 independent experiments)。Recombinant mouse CXCL3 添加で MDSC migration 増加、SX-682 (CXCR2 inhibitor) や anti-CXCL3 中和抗体で MDSC migration 抑制 (Fig 4J-K、triplicate)。
SX-682 CXCR2 阻害は in vivo で KRAS CRC の anti-PD-1 sensitivity を回復*：SX-682 daily over 30-day dosing で iKAP tumor の MDSC 減少 + T cell 増加 + 癌細胞減少 (Fig 4L-N、p<0.001)、iAP tumor では効果なし (KRAS*-dependent specificity)。iKAP mice (KRAS* CRC) で anti-PD-1 単剤無効だが、SX-682 + anti-PD-1 併用で MDSC 動員抑制 → CD8+ T cell infiltration 増加 → tumor regression を実現 (p<0.001)。IRF2 enforced overexpression + anti-PD-1 でも同様の effect、KRAS*-driven CRC の primary ICB resistance を mechanism-based に overcome できる proof-of-principle を確立した。
ヒト CRC データでの validation：TCGA CRC (n=633) で KRAS-IRF2 mutually exclusive (p<0.05)、IRF2 high 群は IFN response signature・cytotoxic cell infiltration が高く、CXCL3 expression と MDSC marker (CD33、ARG1、S100A9) が低い。MD Anderson CRC コホート (n=149) の RNA-seq + IHC で IRF2 high tumor が anti-PD-1 治療奏効群に enrich (p<0.05)、3 例の IHC で KRAS mutation と IRF2 expression が inversely correlated (Pearson r = -0.6、p<0.01)、ヒト CRC で IRF2 が ICB response predictive biomarker としての potential を示した。
Combination therapy で anti-PD-1 resistance overcome：iKAP mice (KRAS* CRC) で anti-PD-1 単剤無効だが、SX-682 (CXCR2 inhibitor) + anti-PD-1 併用で MDSC 動員抑制 → CD8+ T cell infiltration 増加 → tumor regression (p<0.001) を実現。IRF2 enforced overexpression + anti-PD-1 でも同様の effect、KRAS*-driven CRC の primary ICB resistance を mechanism-based に overcome できる proof-of-principle を確立。
考察/結論
本研究は KRAS* → IRF2 suppression → CXCL3 upregulation → CXCR2-mediated MDSC migration → primary anti-PD-1 resistance という single mechanistic axis を 4 種類の collateral evidence (CyTOF・RNA-seq・ChIP-seq・TCGA mutual exclusivity) の triangulation で establish した landmark Cancer Cell mechanistic 研究である。① 先行研究との違い：Lal et al. 2015/2018 (KRAS* CRC で immune-poor phenotype の descriptive 観察) と異な り、本研究は 対照的 に KRAS* と MDSC infiltration を mechanistic link で結ぶ specific transcriptional regulator (IRF2) と chemokine mediator (CXCL3) を identification、これまで 提唱されてきた “KRAS* tumor は immune cold” 仮説に対し driver mechanism を分子レベルで提示。Other KRAS-immune studies (Hamarsheh et al. CancerCell 2017 mutant KRAS + IL-6/STAT3 in pancreatic cancer; Coelho et al. Immunity 2017 mut KRAS + IL-23/Th17 in lung) と相違 する MDSC-CXCR2 axis を独自に同定、また Steele et al. 2016・Liu et al. 2018 (CXCR2 antagonism in PDAC) との 相違 点として KRAS*-IRF2 epistasis を mutually exclusive genomic pattern で実証した点。② 新規性：本論文は 新規な finding として、(a) IRF2 が KRAS*-mediated IFN signaling suppression の 本研究で初めて 同定された direct transcriptional mediator、(b) CXCL3 が IRF2 ChIP-seq で唯一 IRF2-bound chemokine という これまで報告されていない specific connection、(c) TCGA n=633 での KRAS-IRF2 mutually exclusive deletion pattern という genomic-level proof、(d) SX-682 + anti-PD-1 combination の preclinical proof-of-concept、を 本研究で初めて 提示。これまで報告されていない mechanistic 概念として “KRAS-IRF2-CXCL3-CXCR2 axis” を quartet として体系化、ICB resistance の novel targeting framework を提供。③ 臨床応用 (bench-to-bedside・translational・橋渡し)：本論文の 臨床的有用性 は (i) 臨床現場 で KRAS* MSS CRC patient (CRC の 35-50%) を CXCR2 inhibitor + anti-PD-1 combination の candidate として stratify する rationale を提供、(ii) IRF2 expression (IHC または NanoString) を anti-PD-1 response predictive biomarker として bench-to-bedside translation、(iii) NSCLC 領域でも KRAS-mutant (NSCLC の 25-30%) に対する同 axis の translation 可能性 (Skoulidis et al. CancerDiscov 2022 KRAS G12C CodeBreaK 100/200、Skoulidis et al. NEnglJMed 2021 sotorasib KRAS G12C NSCLC で immune microenvironment との interaction )、(iv) KRAS G12C 阻害薬 (sotorasib/adagrasib) + CXCR2 inhibitor + anti-PD-1 triple combination の future trial を motivate、(v) MDSC を biomarker として peripheral blood で monitor する可能性 (CD11b+CD33+HLA-DR-low cell の flow cytometry)。橋渡し 研究の典型例として NSCLC KRAS-mutant subset で IRF2 overexpression や CXCR2 阻害が ICB combination の rational design を支持。④ 残された課題 (今後の検討・limitation・future research/direction)：(a) SX-682 + anti-PD-1 の human phase 1/2 trial (NCT04477343 で recruitment 開始済み) の 今後の検討、(b) MSI-H + KRAS-mut CRC subset で同 axis が機能するかの evaluation、(c) IRF2 expression を tissue + ctDNA + peripheral MDSC で integrated biomarker としての validation、(d) KRAS* NSCLC で CXCL1/CXCL2/CXCL5/IL-8 など他 ELR+ CXC chemokine の contribution、(e) limitation：iKAP マウス model は CMS4 subtype に最も近く全 CRC を recapitulate しない、cell-intrinsic 効果と microenvironment 効果の dissection が partial、(f) CXCR2 inhibitor の long-term safety (neutrophil-mediated host defense suppression) profile、(g) MDSC-targeting strategy として PI3Kγ inhibitor、anti-CSF1R、ATRA、CD11b agonist 等 alternative の比較が future research direction。本論文は KRAS* CRC の anti-PD-1 resistance に新たな mechanism-based combination strategy を提示し、precision immuno-oncology の foundation を強化する重要研究である。
方法
Mouse model：iKAP model (doxycycline-inducible Kras*-G12D + conditional null Apc + null Trp53) と iAP control model (Apc-/-; Trp53-/-; Kras wild-type) を用いる (Boutin et al. NatGenet 2017 で確立、CMS4 subtype に最も近い molecular profile)。Doxycycline (Dox) 投与で KRAS* expression を induction、Dox withdrawal で extinction。
Cell line と試薬：cultured primary iKAP cell line (iKAP-1)、MC38 CRC cell line (Kras wild-type, high IRF2 expression)、anti-Gr-1 antibody (1A8 clone)、CXCR2 inhibitor SX-682 (Lu et al. 2017、Syntrix Pharmaceuticals)、recombinant mouse CXCL3 protein、anti-CXCL3 neutralizing antibody、shRNA (shIRF2 + control)、IRF2 overexpression construct。
Immune profiling：mass cytometry (CyTOF) with 20 lineage markers (Table S1)、Cytobank-based viSNE analysis (Amir et al. 2013)、FlowJo analysis、IHC for GFP・p-ERK・CD4・CD8・Gr-1・S100A8・S100A9。Cell populations: T cells (CD45+CD3e+TCRβ+)、CD4+/CD8+ subsets、MDSC (CD45+CD11b+F4/80-Gr-1+)、PMN-MDSC (Ly-6G+Ly-6C-)、M-MDSC (Ly-6G-Ly-6C+)、Treg (CD4+FOXP3+)。
Functional assays：T cell proliferation co-culture (CD3 + CD28 stimulation, CFSE flow)、IFNγ ELISA、transwell MDSC migration、qPCR (IFN response genes)、Western blot (p-ERK)、ELISA (CXCL3 secretion)。
Transcriptome/epigenome：RNA-seq (iAP n=8 vs iKAP n=7、SRP097890)、microarray (iKAP + IRF2 overexpression vs vector control)、ChIP-seq for IRF2 (iKAP cells、binding peaks at IFN response gene loci + Cxcl3 promoter)、ChIP-PCR validation、IPA (Ingenuity Pathway Analysis) for pathway enrichment。
Statistical analyses：data are mean ± SD from n=3 independent experiments / triplicate biological replicates、Student’s t-test 又は Fisher’s exact test、Mann-Whitney U test、Pearson correlation、Kaplan-Meier survival analysis、log-rank test、TCGA CRC dataset (n=633) で KRAS-IRF2 mutual exclusivity (p<0.05、cBioPortal Genomic Co-occurrence analysis)、SX-682 daily over 30-day dosing schedule in iKAP mice。