- 著者: H.R. Kim, S.M. Lim, H.J. Kim, S.K. Hwang, J.K. Park, E. Shin, M.K. Bae, S.-H.I. Ou, J. Wang, S.S. Jewell, D.R. Kang, R.A. Soo, H. Haack, J.H. Kim, H.S. Shim, B.C. Cho
- Corresponding author: Byoung Chul Cho (Yonsei Cancer Center, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea); Hyo Sup Shim (Yonsei University Department of Pathology)
- 雑誌: Annals of Oncology
- 発行年: 2013
- Epub日: 2013-04-20
- Article種別: Original Article (Clinical / Translational)
- PMID: 23788756
背景
ROS1 (c-ros oncogene 1) rearrangement は 2007 年に Rikova らの phosphotyrosine signaling グローバル解析で NSCLC cell line と腫瘍で SLC34A2-ROS1 + CD74-ROS1 fusion product として発見され、constitutive tyrosine kinase 活性を持つ fusion 蛋白による発がん driver として認識された。Unselected NSCLC 集団における ROS1 rearrangement の頻度は Takeuchi et al. NatMed 2012 や Rimkunas 2012 の解析で 0.9-1.7% と低く、Bergethon et al. JClinOncol 2012 は ROS1 rearrangement が never smokers + Asian 患者に偏在することを報告し crizotinib への高感受性を示唆した (Phase 1 expansion-cohort で ORR 57%)。しかし lung cancer in never smokers (LCINS: lung cancer in never smokers) という分子的に異なる disease entity (EGFR/KRAS/ALK が主要 oncogenic alteration) において、East-Asian never smokers における ROS1 再編成の正確な頻度や、ROS1+ NSCLC の従来化学療法 (特に pemetrexed) や EGFR-TKI への治療反応性は系統的に評価されていなかった。先行研究には (i) ROS1 検出に RT-PCR (Li 2011) や IHC (Rimkunas 2012) を用いたため fusion partner や smoking history の網羅性が限定的、(ii) Cai 2013 など中国患者 cohort も EGFR/KRAS/ALK との concurrent 解析が欠落、というギャップが残されていた。何が足りなかったかというと、(a) East-Asian never smokers の large cohort で FISH + RT-PCR + IHC を triple confirmation で実施、(b) EGFR/KRAS/ALK と concurrent に genotyping、(c) ROS1+ 患者の pemetrexed と EGFR-TKI への前向き response 比較、を同時に満たす研究が未解明であった。
目的
韓国 Yonsei Cancer Center の non-smoker 肺腺癌 208 例において (1) ROS1 rearrangement の頻度を FISH break-apart probe で測定し EGFR mutation・KRAS mutation・ALK rearrangement と concurrent に genotyping、(2) ROS1 fusion partner を RT-PCR で同定し IHC で confirmation、(3) ROS1+ vs ROS1/ALK 陰性 (WT/WT) 患者で platinum-based chemotherapy・pemetrexed・EGFR-TKI への ORR と PFS を比較、(4) HCC78 (ROS1-rearranged NSCLC cell line) を含む in vitro cell viability assay で pemetrexed・gefitinib・crizotinib・TAE684 への感受性と thymidylate synthase (TS) expression の関連を解明する。
結果
208 例 non-smoker 肺腺癌中 7 例 (3.4%) で ROS1+、driver-negative 集団では 5.7% (6/105)： 208 例の non-smoker 肺腺癌から ROS1 FISH で 7 例 (3.4%) を ROS1-rearranged と同定 (Table 1)。一方 ALK rearrangement は 15 例 (7.2%)、EGFR mutation は 83 例 (39.9%; exon 19 deletion 51例、L858R 28例、其他 4例)、KRAS mutation は 5 例 (2.3%)。EGFR/KRAS/ALK 全て陰性集団 (n=105) に限定すると ROS1 頻度は 5.7% (6/105) に上昇した。ROS1 rearrangement は ALK rearrangement・KRAS mutation と相互排他的だったが、ROS1+ 7例中1例に concurrent EGFR L858R が認められた (exception)。FISH+ 全例で ROS1 IHC も陽性で triple confirmation を達成。Median age は ROS1+ で 55歳 (range 30-68)、WT/WT で 58歳 (33-77, p=0.80)、女性比率は 85.7% (ROS1+) vs 84.4% (WT/WT, p=0.69)、stage 分布も両群で有意差なし (Table 1)。
ROS1 fusion partner は RT-PCR で CD74-ROS1 が 2/7 例で同定された： RT-PCR + sequencing により CD74-ROS1 fusion が 7 例中 2 例で確認された。残り 5 例では fusion partner が同定できず、insufficient tissue sample または FFPE 由来 RNA quality 不足が原因と推測された。CD74 は NSCLC で最も頻度の高い ROS1 fusion partner であり、既知の 8 種 (CD74、SLC34A2、SDC4、EZR、FIG、TPM3、LRIG3、KDELR2) と整合する。これは East-Asian non-smoker 集団でも CD74 が主要 partner であることを支持する初の系統的報告となった (Bergethon et al. JClinOncol 2012 の North American cohort 主体の結果と整合)。
Pemetrexed は ROS1+ NSCLC で ORR 60% vs WT/WT 8.5% (p=0.01)、median PFS NR vs 3.3 months (p=0.008)： 転移病巣の palliative chemotherapy を受けた 162 例 (ROS1+ 5例、ALK+ 13例、WT/WT 144例) の treatment outcome を比較した結果 (Table 2)、pemetrexed (second-/third-line single agent) を受けた 82 例で ORR は ROS1+ 60.0% (3/5) vs WT/WT 8.5% (6/71), p=0.01 (Fisher’s exact test) と顕著に高く、disease control rate (DCR) も ROS1+ 100% (5/5) vs WT/WT 64.8% (46/71), p=0.16 だった。Median PFS は ROS1+ で not reached (NR) vs WT/WT 3.3 months (p=0.008) (log-rank, Fig 1B)、ALK+ 群も pemetrexed PFS 11.5 months と比較的良好だった (Camidge 2011 と整合)。Age + gender + EGFR mutation + ALK rearrangement で調整した Cox proportional hazard regression で ROS1+ の AHR=0.09 (p=0.02) と pemetrexed への disease progression risk が約 91% 減少することが示された。これは ROS1 rearrangement が pemetrexed 反応性の強力な positive predictor であることを統計的に裏付けた最初の clinical evidence である。
ROS1+ NSCLC は EGFR-TKI 不応性で PFS 2.5 vs WT/WT 7.8 months (p=0.01)： EGFR-TKI (gefitinib または erlotinib) を投与された 120 例で ROS1+ 患者 (n=3) は全例 EGFR-TKI に non-responder (ORR 0%、Table 2)。Median PFS は ROS1+ 2.5 months vs WT/WT 7.8 months (p=0.01) (log-rank, Fig 1C) で、ROS1+ は ALK+ と類似の EGFR-TKI 不応性パターンを示した。Cox regression では ROS1+ の EGFR-TKI への AHR=2.40 (p=0.14) と numerical な耐性傾向を示したが症例数 (n=3) の制約で統計的有意に至らず、対照的に EGFR mutation+ の AHR=0.56 (p=0.007) と ALK+ の AHR=2.70 (p=0.02) は有意な predictive impact だった。これは ROS1 rearrangement が EGFR 非依存的に NSCLC を駆動することの間接的 evidence を提供し、ROS1+ 患者を non-EGFR-TKI 第一選択 (今後の crizotinib・lorlatinib 標的治療または pemetrexed-based chemotherapy) で治療すべき臨床根拠を示した。Overall survival は median follow-up 29.6 ヵ月で 82/208 例 (39.4%) が生存中、ROS1+ vs WT/WT で有意差なし (small sample size limitation)。
HCC78 (ROS1+) は pemetrexed IC50 0.007 μM と最高感受性、TS expression が低い細胞株は pemetrexed 感受性が高い： In vitro cell viability assay (Fig 2A) で HCC78 (ROS1-rearranged NSCLC cell line) は pemetrexed (Alimta) IC50 0.007 μM と最高感受性を示し、ALK-rearranged H3122 が IC50 0.077 μM と続き、対照的に gefitinib に対しては HCC78 (IC50 >10 μM) と H3122 (>10 μM) で耐性を示した。Crizotinib (HCC78 IC50 0.125 μM、H3122 0.05 μM) と TAE684 (HCC78 0.0008 μM、H3122 0.0008 μM) は両 fusion-positive cell line で有効。Western blot (Fig 2B) で pemetrexed-sensitive HCC78・H3122・PC9・HCC827 では TS expression がほぼ検出されなかったのに対し、pemetrexed-resistant H358・H1299 では TS が高発現していた。臨床 IHC でも ROS1+/ALK+ 患者の腫瘍は WT/WT より TS scoring が低い傾向を示し (Supplementary Fig S4)、low TS expression が pemetrexed 感受性の分子基盤として ROS1+ NSCLC でも機能する hypothesis を支持した (Camidge et al. JThoracOncol 2011 が ALK+ NSCLC で同様の TS-pemetrexed relationship を示した先行研究と整合)。
考察/結論
本研究は East-Asian non-smoker 肺腺癌 208 例の large cohort で ROS1 rearrangement 頻度 3.4% (driver-negative 5.7%) を確立し、ROS1+ 患者が pemetrexed に高感受性 (ORR 60% vs 8.5%) で EGFR-TKI に不応性 (PFS 2.5 vs 7.8 months) であるという differential treatment response を初めて示した。(1) 既存研究との違い：先行研究の Bergethon et al. JClinOncol 2012 (North American cohort 主体)、Takeuchi 2012 (predominantly smokers)、Rimkunas 2012 (Chinese with unknown smoking status)、Li 2011 (RT-PCR で fusion partner 検出制限)、Cai 2013 (Chinese で worse OS 報告) はそれぞれ独立に ROS1 rearrangement を 0.9-2.0% で報告したが、これら先行研究は (i) EGFR/KRAS/ALK との concurrent genotyping を欠く、(ii) smoking history が混在、(iii) ペメトレキセド response の系統的評価がない、という点で本研究と異なる。本研究は対照的にこれら 3 要件を同時満たす最初の前向き retrospective cohort であり、ROS1 が EGFR/KRAS/ALK と相互排他的かつ unique な response プロファイルを持つことを直接示した。(2) 新規性：本研究で初めて、(a) East-Asian non-smoker 集団における ROS1 頻度を 3.4% (driver-negative 5.7%) と定量、(b) Pemetrexed への ROS1+ NSCLC 特異的高感受性 (ORR 60%、Cox AHR 0.09) を group level で実証、(c) HCC78 cell line で IC50 0.007 μM という超高 pemetrexed 感受性と low TS expression の molecular correlate を確立、(d) ROS1+ NSCLC が EGFR-TKI に primary resistance を示し EGFR と機能的に独立であることを clinical PFS data で初めて報告。これらは novel な ROS1-specific therapeutic 戦略の臨床的根拠となった。(3) 臨床応用：本知見はその後の ROS1+ NSCLC standard-of-care 確立に直接寄与した: (a) ROS1 rearrangement の routine molecular testing が non-smoker 肺腺癌で必須となり (NCCN guidelines)、(b) ROS1+ NSCLC で crizotinib が標準一次治療として承認 (Shaw et al. NEnglJMed 2014 PROFILE 1001)、(c) crizotinib 不耐 / 耐性例で pemetrexed-based chemotherapy が rational second-line として位置づけられ、(d) その後 entrectinib・lorlatinib・Drilon et al. NEnglJMed 2024 が承認されるに至るまで「ROS1 testing → ROS1 inhibitor + back-up pemetrexed」という bench-to-bedside 治療戦略の起点を提供した。(4) 残された課題：(a) ROS1+ 5 例という small sample size のため pemetrexed response の precise effect size 推定に限界 (今後の検討として larger multicenter cohort が必要、その後 Mazieres et al. JClinOncol 2015 や Drilon et al. LancetOncol 2020 で実現)、(b) Low TS expression と ROS1 fusion の分子的 link の機序は本研究では推察に留まり、ROS1 signaling が folate metabolism (thymidylate synthase、dihydrofolate reductase) を直接 regulate する経路の解明が今後の研究の方向性、(c) Fusion partner 同定率 2/7 (29%) と低く、long-range RT-PCR や RNA-seq での improved detection が必要、(d) Single-institution retrospective design に伴う selection bias と limitation として ROS1 検査の prospective standard testing platform 標準化が課題、(e) Crizotinib 投与例が 0 だったため本研究では ROS1+ への crizotinib response は評価できず、Shaw 2014 PROFILE 1001 や Wu 2018 等の後続試験で別途検証された、(f) East-Asian + non-smoker 限定集団のため Western population や smokers への一般化可能性は限定的、subsequent global studies で gradually 拡張される必要があった。
方法
Study population (n=208): 韓国 Severance Hospital (Yonsei) で 2005 年 1 月〜2012 年 2 月に病理学的に確認された never smoker (生涯喫煙本数 <100 cigarettes) 肺腺癌 208 例を組み入れ。Tumor histology は 2011 IASLC/ATS/ERS lung adenocarcinoma classification、stage は 6th AJCC、response は RECIST version 1.1。IRB (Severance Hospital) 承認、全例 written informed consent。ROS1 detection (FISH): Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor に break-apart probe (Vysis LSI ROS1 Break-Apart, Abbott Molecular) を hybridize、4 μm 切片に対し manufacturer 指示通りに実施。FISH 陽性判定は ≥15% of tumor cells with split signal、blinded 2-evaluator (HSS、JKP) reading、≥100 nuclei/case。ROS1 IHC confirmation: FISH+ 例で rabbit monoclonal anti-ROS1 (D4D6, Cell Signaling Technology) 1:50 dilution、Ventana BenchMark XT automated stainer、OptiView DAB IHC Detection Kit、hematoxylin counterstain。RT-PCR for fusion partner: SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen) で reverse transcription、ROS1 exon 32/34/35/36 primers (Davies 2012) で amplification、PCR product を agarose gel から精製 (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Kit, Promega) し Sanger sequencing。Concurrent genotyping: ALK rearrangement は Vysis LSI ALK Break-Apart probe (Abbott)、EGFR exon 18-21 + KRAS exon 2 (codon 12/13) は nested PCR で sequencing。Thymidylate synthase IHC: rabbit polyclonal anti-TS (H-265, Santa Cruz Biotechnology) 1:50、semi-quantitative scoring = intensity × proportion。Cell viability assay: A549, H460, H1299, HCC827, H2228 を ATCC から購入、PC-9 + H3122 は K. Hayata (Tokyo Medical College) + John D. Minna (UT Southwestern) から供与。HCC78 (ROS1+ rearranged) も含めて pemetrexed・gefitinib・crizotinib・TAE684 を 72時間曝露、0.5 mg/mL MTT formazan を 565 nm で読み取り IC50 算出。Western blot で TS と β-actin。Statistics: 群間比較は χ² test, Fisher’s exact test, t-test。生存は Kaplan-Meier method + log-rank test、adjusted hazard ratio (AHR) は age + gender + genetic alteration を共変量とした Cox regression。両側 p < 0.05 を有意とした。