- 著者: Jana Biermann, Johannes C. Melms, Amit Dipak Amin, Yiping Wang, Lindsay A. Caprio, Alcida Karz, Somnath Tagore, Irving Barrera, Miguel A. Ibarra-Arellano, Massimo Andreatta, et al., Gary K. Schwartz, Benjamin Izar
- Corresponding author: Benjamin Izar (Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-07-07
- Article種別: Original Article (Resource)
- PMID: 35803246
背景
MBM (melanoma brain metastasis, メラノーマ脳転移) は進行 melanoma 患者の 40-60% に発生し、肺癌・乳癌に次ぐ第3位の脳転移原因として高い罹患率・死亡率をもたらす (Boire et al. NatRevCancer 2020)。ICI (immune checkpoint inhibitor, 免疫チェックポイント阻害剤) 併用療法 (ipilimumab + nivolumab) は MBM 患者の 30-50% で奏効することが CheckMate-204 試験 (Tawbi et al. NEJM 2018) で示されたが、多くの患者は奏効せず、頭蓋外病変が制御された後も MBM が出現・増悪する dissociated response が頻発し依然として予後不良である (Taggart et al. ProcNatlAcadSciUSA 2018)。先行するゲノム研究では carcinoma (肺癌・乳癌) 脳転移で primary と divergent な driver mutation を同定した (Brastianos et al. Cancer Discov 2015) が、MBM では明瞭な脳転移特異的 driver 変異は発見されず (Fischer et al. Cancer Discov 2019)、ゲノム以外の phenotypic・TME (tumor microenvironment, 腫瘍微小環境) 因子が MBM 生物学を規定すると示唆された。単細胞解析の側面では、Tirosh et al. Science 2016 による転移性 melanoma の scRNA-seq (single-cell RNA sequencing) が治療耐性と関連する細胞状態を初めて提示したが、MBM は含まれなかった。その後 Gonzalez et al. (Cell 2022) が脳転移を含む scRNA-seq を行ったが、新鮮組織採取の技術的制約から治療歴のある患者が混在し、治療効果と固有生物学の分離が困難であった。このように、(1) 治療ナイーブ MBM を対象とした multi-modal 単細胞 + 空間 atlas が手薄な状況にあり、(2) MBM vs ECM (extracranial melanoma metastasis, 頭蓋外転移) を定量的に比較した細胞・分子レベルの系統解析、(3) 凍結 archive 検体への snRNA-seq (single-nucleus RNA sequencing) 適用技術、(4) TME における myeloid・T・B 細胞の機能異常と空間的文脈、が根本的に不足しており、これらが治療ナイーブ MBM 研究における未解明な knowledge gap を構成していた。
目的
治療ナイーブ MBM (n=22, 21 patients) と ECM (n=10) の multi-modal 単細胞 + 空間 atlas を構築し、(1) 9 主要細胞種・26 細胞 subtype の同定と組成比較、(2) CIN (chromosomal instability, 染色体不安定性) と脳転移特異的な neuronal-like metaprogram の解明、(3) MBM での myeloid・T・B 細胞の機能異常と免疫回避機構の定量化、(4) lymphoid aggregate の空間地理学的解析、(5) Aurora kinase B 阻害・LAG3 標的化などの治療戦略候補の同定、を独立コホート・PDX (patient-derived xenograft) モデル・機能アッセイと組み合わせて体系的に明らかにすることを目的とした。
結果
Atlas 構築と snRNA-seq の凍結検体適用性 (Fig 1): 22 MBM + 10 ECM から計 n=114,455 cells/nuclei の sc/snRNA-seq データを取得した。技術検証として同一 MBM05 検体を fresh scRNA-seq と凍結 snRNA-seq で直接比較したところ、median 遺伝子検出数はそれぞれ 2,137 vs 2,504 genes/cell と同等であり、CD45+ コンパートメント (3,817 vs 3,551) と CD45- コンパートメント (1,698 vs 1,457) の両方で比較可能な値を示した。新鮮組織処理に起因する stress signature は snRNA-seq で有意に低減され (Wilcoxon rank-sum test, p < 2.2e-16)、UMAP 上のクラスタリングは profiling 法ではなく細胞型で分離された (Fig 1C-D)。inferCNV による CNA 推定も両法で一致し (染色体 7 amplification 等)、15 年以上前の archive 凍結検体を含む tissue bank 利用が可能であることを実証した (Fig 1E)。9 主要細胞型 [malignant n=92,733、myeloid n=20,449、T/NK n=18,650、B/plasma n=3,695、low-quality n=3,804、stromal n=3,344、CNS (central nervous system) n=1,708、endothelial n=896、epithelial n=276] と 26 cell subtype を annotation した (Table S2)。
MBM 特異的 CIN 亢進と Aurora kinase B 治療標的 (Fig 2): malignant 細胞間の aneuploidy pattern の不均一性が MBM で顕著であり、WES 解析 (MBM n=21 vs ECM n=23、Fischer et al. 2019 データ) で MBM が有意に高い fraction of genome altered を示した (Wilcoxon rank-sum test, Fig 2G)。matched cell line pairs (5B1 vs 4L; 12-273 BM vs 12-273 LN) の high-throughput microscopy で MBM 由来細胞株の micronuclei 頻度が ECM 対照を有意に上回り (Fig 2H)、CIN の cell-autonomous 亢進を確認した。NSG マウス intracardiac injection 実験では、5B1 (MBM 由来) の 45%、独立した MBM05・MBM03 モデルで 90% / 45% の動物に大型 MBM が形成されたのに対し、4L (ECM 由来) は頭蓋外臓器に選択的に転移した (Fig 2K-L)。in vitro 遊走能も MBM 由来モデルで高かった (Fig 2I)。これらの結果は CIN が脳転移 organotropism と選択的に関連し、最近の大規模臨床ゲノム研究 (Nguyen et al. 2022) での知見と一致することを単細胞レベルで実証した。
神経様 metaprogram (MP7) の MBM 特異的獲得と NCAM1 protein 検証 (Fig 3): 癌細胞の MITF-high program は MBM で高く、AXL-high program は ECM で優位であった。KINOMO NMF 解析で 87 programs が 7 MP に収束し、MP7 のみが MBM 専用の neuronal-like metaprogram として同定された (Fig 3J-K)。MP7 は NGFR (neuronal growth factor receptor)、NLGN3 (neuroligin 3)、NRXN (neurexin)、SNCA (synuclein alpha)、SYT11 (synaptotagmin 11)、GPHN (gephyrin) など神経発達・シナプス機能遺伝子を多数含み、NOTCH シグナルとは独立して MBM 特異的神経様可塑性を表現した (Fig 3I)。多 dataset 統合 (sc/snRNA-seq + Fischer 2019 bulk + Kleffman 2022 proteomics) で NCAM1 (neural cell adhesion molecule 1)、NELL1 (neural epidermal growth factor-like 1)、LRRC1 (leucine-rich repeat containing 1) が MBM で一貫して高発現することを確認した (Fig 3L)。独立コホート 42 例 (19 MBM + 23 ECM) の multiplexed IF で MBM 癌細胞の NCAM1 陽性割合と発現強度が ECM を有意に上回った (Wilcoxon p < 0.001; Fig 3O-P)。VIPER + SCENIC 両法で MITF・RELB が MBM 特異的な転写因子として同定され、ATAC-seq footprinting でも MITF/SOX10/NPAS2/ZNF317/CUX1 の 5 転写因子が MBM 特異的クロマチン開放領域を制御することが示された。
MDM 優位の MBM 免疫抑制 myeloid 環境と microglia 活性化 (Fig 4): myeloid 細胞 n=17,562 (MBM n=12,579, ECM n=4,983) を取得し、MDM n=13,049、monocytes n=2,119、microglia n=1,658、DCs (dendritic cells) n=663 (cDC1/cDC2/DC3)、mast cells n=73 を同定した。RNA velocity (scVelo) 解析で FTL+ MDM を early cell state とし MDM-c1 が生じる系列関係を示した。MBM の MDM は ECM と比較して抗原提示遺伝子 (HLA-A/B/C/E、B2M、CIITA、CD74、HLA-DP/DQ/DR) と matrix protease (MMP2/14) が低発現し、pro-tumorigenic マーカー (CD163、TLR2、MERTK、AXL、IL2RA) が高発現していた (DESeq2, padj < 0.05; Fig 4H)。独立コホート 42 例の IF 解析では MBM で macrophage (CD68+) 割合が有意に高く (Fig 4I)、CD163 protein 発現強度も MBM で有意に高かった (Wilcoxon p < 0.05; Fig 4J)。SPP1 (secreted phosphoprotein 1)+ microglia サブ集団 (MG1) は CCL2/3/4・TNF-α・IL-1β を産生する炎症性活性化 phenotype を示した (Fig 4K-L)。M1/M2 like 二分法には当てはまらない FTL+ MDM と MDM-c1 の 2 主要集団が MBM において腫瘍促進型 myeloid 環境を形成していることが示された。
TOX+ CD8 T 細胞機能不全・LAG3 発現と B→plasma 細胞 intra-tumoral 分化 (Fig 5): T/NK 細胞 n=17,149 を取得し、NK cells n=759、Tregs n=2,284、conventional CD4+ T n=3,657、TFH (T follicular helper)-like n=1,300、CD8+ T n=9,149 を同定した。CD8+ T 細胞は TOX+ dysfunctional 集団 n=5,474 と TCF7+ progenitor-like 集団 n=3,675 に分類され、MBM では TOX+ 集団の割合が ECM より有意に高かった (Wilcoxon p < 0.05)。一方、MBM の TOX+ CD8+ T 細胞では PDCD1 (PD-1)・HAVCR2 (TIM-3)・LAG3・TIGIT の発現が ECM より低かった (DESeq2, padj < 0.05; Fig 5E)。TCR クローン解析 (n=7,575 clonotypes、5 patients) で clonal 拡大が TCF7+→TOX+ 分化軌跡に沿って進行し、intra-tumoral での shared clonotype が progenitor pool からの intra-tumoral 分化を直接支持した。B/plasma 細胞 n=3,175 では naive B (n=166)→ activated B (n=1,032)→ plasma cell (n=1,977) の全分化軌跡が回収され、同一 IGHV/IGLV 発現の B 細胞が同一検体内で連続することから intra-tumoral B→plasma 細胞分化の証拠を得た。追加コホート 42 例の IF で plasma cell aggregate が MBM に有意に多く認められ (Wilcoxon p < 0.05; Fig 5K)、TLS (tertiary lymphoid structure)-like 構造の MBM 優位な形成を示唆した。
SlideSeqV2 による空間的不均質性と cancer immune evasion geography (Fig 6): 16 検体 (11 MBM + 5 ECM) で SlideSeqV2 空間トランスクリプトームを取得し、RCTD による cell type deconvolution 結果が snRNA-seq 組成と高い相関を示した (Spearman R²=0.75, p=1.6e-5; Fig 6C)。Moran’s I (>0.05, p < 0.001) で immunoglobulin 遺伝子クラスターの空間限局を検出し、複数 MBM 検体で lymphoid aggregate の spatial map を可視化した (Fig 6D-G)。MHC class I 抗原提示遺伝子は広域発現していたが、type I IFN (interferon) 応答遺伝子 (ISG15、IFI27、CXCL9) は特定領域に空間限局しており、抗原提示の存在のみでは抗腫瘍 IFN 応答が成立しないことを示した。TIMP1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) は MHC I 高発現域と相互排他的な分布を示し immune evasion geography の形成に寄与する可能性が示唆された (Fig 6H)。さらに OxPhos (oxidative phosphorylation) と glycolysis の代謝 pathway が MBM 癌細胞間で空間的に二項対立的な発現パターンを示し (Fig 6I)、単細胞解析で観察された OxPhos 不均一性が空間的な文脈を持つことを明らかにした。
考察/結論
本研究は治療ナイーブ MBM の sc/snRNA-seq・TCR-seq・SlideSeqV2 空間トランスクリプトミクスを統合した最大規模の単細胞 atlas を構築し、MBM 生物学の foundational resource を提供した。先行研究との比較において、Gonzalez et al. (Cell 2022) の脳転移 scRNA-seq が新鮮組織 + 治療歴混在コホートであるのと対照的に、本研究は治療ナイーブ厳密 curation・凍結 archive 検体への snRNA-seq 適用・10 μm 解像度 SlideSeqV2・TCR matching の三重強みを実現した。Fischer et al. (Cancer Discov 2019) の bulk profiling でのゲノム重視アプローチと異なり、本研究は melanoma 脳転移では driver 変異よりも transcriptional reprogramming (neuronal-like metaprogram) と TME 再構成が中心的役割を担うことを示した。
MBM 生物学における新規な知見として、(1) 神経様 metaprogram (MP7) の MBM 特異的獲得は、Tirosh et al. (Science 2016) や Tsoi et al. (Cancer Cell 2018) が melanoma 可塑性を記述した一方で、本研究で初めて scRNA-seq レベルで脳転移特異的な neuronal-like state を系統化した点で paradigm-shifting である。(2) CIN が brain-metastatic organotropism と選択的に関連し、Bakhoum et al. (Nature 2018) の CIN-metastasis 概念を MBM 文脈で初めて単細胞・空間レベルで実証した。(3) SlideSeqV2 による抗原提示と type I IFN 応答の空間的乖離は、本研究で初めて示された知見であり、「広域 MHC I 発現があっても IFN 応答は空間限局し抗腫瘍免疫が成立しない領域が存在する」という新規の immune evasion geography 概念を提示した。(4) snRNA-seq が凍結 archive 検体で scRNA-seq と同等の品質を達成したことは、희少疾患・희少検体の単細胞研究パラダイムを変える方法論的貢献である。(5) 近年の腎癌での知見 (Meylan et al. Immunity 2022) と一致し、MBM でも TLS-like lymphoid aggregate での B→plasma 細胞 intra-tumoral 分化が示され、これらは免疫療法応答性と関連する可能性がある (Quail et al. CancerCell 2017)。
臨床応用の観点から、本研究は複数の bench-to-bedside 橋渡しの根拠を提供する。(a) MBM 特異的 CIN 亢進と AURKB (Aurora kinase B) 依存性は AURKB 阻害剤の MBM 優先的適応の rationale となり、臨床的意義のある新規治療標的を提示する。(b) MBM での LAG3 発現パターンは anti-LAG3 (Relatlimab) + anti-PD-1 (nivolumab) 併用の MBM コホートでの優先評価の根拠となる。(c) NCAM1 高発現 neuronal-like phenotype は新規バイオマーカー・治療標的探索の基盤を提供し、臨床現場での MBM 患者層別化に応用しうる。(d) lymphoid aggregate 豊富な MBM サブセットは抗 PD-1/PD-L1 療法への応答性が高い可能性があり、plasma cell aggregate を予測マーカーとした patient 選択戦略の根拠を提供する。(e) 空間的に限局した IFN 応答領域は、ICI + TLR アゴニスト等の組み合わせによる IFN シグナル増強戦略の標的部位として臨床応用が期待される。
残された課題として、(1) 同一 patient の MBM と ECM を matched で採取した paired cohort が含まれないため、脳 niche と神経様 cell state の因果関係は mechanistic validation が必要であり、今後の検討として prospective matched biopsy study が不可欠である。(2) CIN・neuronal-like phenotype・免疫抑制の causal hierarchy は、longitudinal MBM preclinical model での future research として解明されるべき課題として残されている。(3) 治療ナイーブ cohort 設計のため ICI 後の MBM ecosystem remodeling は本研究 scope 外であり、ICI 治療後 MBM の longitudinal serial atlas が今後の展望として必要である。(4) n=22 MBM は BRAF 状態・事前放射線歴等による患者層別化には規模が不十分であり、N=100+ cohort での更なる検討が求められる。(5) SlideSeqV2 の 10 μm 解像度では sub-cellular clonal evolution cartography には limitation があり、STARmap/MERFISH 等 sub-cellular 空間法の統合が将来の技術的発展として期待される。これらの知見は Tagore et al. NatMed 2025 など後続の非小細胞肺癌脳転移 atlas 研究にも活用されており、本研究が脳転移 single-cell biology の基盤 resource として広く参照されていることを示している。
方法
Clinical specimens: 22 治療ナイーブ MBM (21 patients、うち 1 patient は同一患者の 2 病変) と 10 ECM の凍結組織 (一部 >15 年前の archive 検体を含む) を Columbia University および多施設国際コホートから収集した (IRB 承認・informed consent 取得)。治療ナイーブの定義は systemic therapy 未施行かつ surgical resection が最初の介入であること。
sc/snRNA-seq: 10x Chromium Next GEM Single Cell 3’ v3.1 を用い、合計 n=114,455 cells/nuclei のトランスクリプトームを取得した。snRNA-seq は凍結組織から nuclear isolation を実施し、scRNA-seq との技術的等価性を同一検体 (MBM05 を fresh/frozen split) で直接比較した。QC: CellBender で ambient RNA 除去、DoubletFinder でダブレット除去。Seurat v4 + Harmony で batch 補正・統合を行い、Harmony・scVI (single-cell Variational Inference)・LIGER (Linked Inference of Genomic Experimental Relationships)・Seurat anchor の 4 手法を benchmark した (silhouette score で Harmony が最適)。
TCR sequencing: 5 patients から n=7,575 matched TCR αβ clonotype を 10x Single Cell V(D)J Solution で取得し、CD4+・CD8+ T 細胞の clonal 拡大を追跡した。
Spatial transcriptomics: SlideSeqV2 (解像度 10 μm、Macosko lab protocol) で 16 検体 (11 MBM + 5 ECM) の空間トランスクリプトームを取得し、RCTD (Robust Cell Type Decomposition) で snRNA-seq と統合した cell type deconvolution を実施した。空間的自己相関は Moran’s I (>0.05 かつ p < 0.001) で定量化し、CSIDE (cell-type-specific inference of differential expression) を直交検証に使用した。
Validation cohorts: (1) Fischer et al. 2019 bulk RNA-seq cohort (MBM n=88, ECM n=50) での signature 検証、(2) WES (whole-exome sequencing) で fraction of genome altered 解析 (MBM n=21, ECM n=23 Fischer et al. 2019 データ)、(3) ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing) + RNA-seq (4 MBM + 4 ECM 由来 patient cell lines、matched pair 2 組を含む) でのクロマチン accessibility 解析、(4) WM239A 由来 5B1 細胞株 (MBM 由来) / 4L 細胞株 (ECM 由来)、12-273 BM / 12-273 LN (同一 patient 由来 matched pair) の NSG (非肥満糖尿病/重症複合免疫不全) マウスへの intracardiac injection (3 週間後に brain + 頭蓋外臓器を解析)、(5) multiplexed immunofluorescence (Vectra Polaris 6-color panel: DAPI/CD8/NCAM1/CD68 (cluster of differentiation 68)/CD138/SOX10 (SRY-box transcription factor 10)+HMB-45) による独立コホート 42 例 (19 MBM + 23 ECM) での protein 検証、(6) proteomics データ (Kleffman et al. 2022) との統合解析。
Computational 解析: NMF (non-negative matrix factorization) には KINOMO (semi-supervised) を使用し 87 programs を 7 metaprogram (MP) に集約した。転写因子活性推定は VIPER (Virtual Inference of Protein-activity by Enriched Regulon) + SCENIC (single-cell regulatory network inference and clustering) の 2 法で直交検証し、CNA (copy-number alteration) 推定は inferCNV 法で実施した。T 細胞 annotation は ProjecTILs (reference atlas-based T cell state projection framework) reference-based 法で独立検証した。RNA velocity は scVelo で解析し MDM 系列関係を推定した。
統計: 連続変数比較は Wilcoxon rank-sum test、発現差異検出は DESeq2 (Wald test, Benjamini-Hochberg 補正, padj < 0.05)、相関は Spearman’s Rho で算出した。遺伝子セット解析は ssGSEA (single-sample gene set enrichment analysis) を使用し、空間的自己相関は Moran’s I (閾値 >0.05, p < 0.001) で評価した。