Article data
Exosomes: composition, biogenesis and function
- 著者: Clotilde Théry, Laurence Zitvogel, Sebastian Amigorena
- Corresponding author: Clotilde Théry (INSERM U520, Institut Curie, Paris, France)
- 雑誌: Nature Reviews Immunology
- 発行年: 2002
- Epub日: 2002-08-01
- Article種別: Review
- PMID: 12154376
背景
エクソソームは1981年に腫瘍細胞株の培養上清から放出される5’-ヌクレオチダーゼ活性を有する膜小胞として初めて記載された (Trams et al. BiochimBiophysActa 1981)。1980年代中頃には、ヒツジ網状赤血球の成熟過程においてトランスフェリン受容体を内部に含む約50 nmの小胞がMVB (multivesicular body; 多胞性後期エンドソーム) 内に形成され、MVBが細胞膜と融合することで「exosome」として細胞外へ放出されることが電子顕微鏡解析により明らかにされ (Fig 1)、これらの小胞が「exosome」と命名された (Pan et al. JCellBiol 1985、Harding et al. JCellBiol 1983)。当初、後期エンドソームはリソソームによる分解に向かう前分解性コンパートメントとみなされていたため、その内容物が細胞外へ分泌されるという発見は論争を呼んだ。しかしその後、電子顕微鏡による融合プロファイルの観察から、CTL (cytotoxic T lymphocyte)、EBV (Epstein-Barr virus) 形質転換B細胞、肥満細胞、DC (dendritic cell)、血小板などの造血系細胞でもMVBと細胞膜の融合が起こることが実証された。
1996年のRaposo et al. によるEBV形質転換B細胞由来エクソソームのMHC (major histocompatibility complex) class II依存的なT細胞活性化報告 (Raposo et al. JExpMed 1996)、および1998年のZitvogel et al. による「DC由来エクソソームによるin vivoでの確立腫瘍拒絶」の発表以降、免疫学分野での関心が急速に高まり、臨床応用への期待も生まれた。しかしながら、エクソソームをアポトーシス小体やマイクロベシクルなど他の細胞外小胞から明確に区別するための物理的・分子的定義は確立されておらず、研究間の結果の比較可能性を阻害するというgap in knowledge が存在した。さらに、エクソソームの生合成に関与する分子機構 (MVB内部小胞の形成経路、タンパク質ソーティング機構、分泌融合機序) の理解も不足しており、in vivoでの生理的産生と機能については断片的な観察にとどまっていた。また、多細胞種にわたる組成比較による普遍的マーカーの同定も手薄であり、エクソソームを生化学的に定義する共通基準の確立が急務であった。
目的
本レビューの目的は、1981年から2002年にかけて蓄積されたエクソソームに関する実験データを統合し、(1) エクソソームをアポトーシス小体・マイクロベシクルから区別するための物理的・分子的最小定義を提案すること、(2) 生合成経路 (MVBの内向き出芽、ESCRT機構の関与、逆向き出芽の特性、Ca²⁺依存的分泌制御) を体系化すること、(3) 多細胞種にわたるタンパク質・脂質組成の比較整理を行うこと、(4) in vitro・in vivo での免疫学的機能 (MHC class II依存的T細胞活性化、クロスプレゼンテーション、寛容誘導、アポトーシス伝播) を評価すること、および (5) がん免疫療法ベクターとしての臨床応用可能性をPhase I試験データとともに提示することにある。
結果
エクソソームの物理的定義と精製：最小要件の提案
本レビューが提案したエクソソームの最小定義は、(1) 直径30-90 nm (スクロース密度勾配での均一な浮遊を確認)、(2) スクロース密度1.13-1.19 g/mL、(3) エンドソーム起源 (アポトーシス小体・細胞膜由来マイクロベシクルと区別)、(4) テトラスパニン (CD9, CD63, CD81, CD82) の濃縮、という4要件である (Table 1参照)。100,000×g超遠心のみでは細胞膜由来小胞や他の膜構造との完全分離が困難であり、スクロール密度勾配との組み合わせや、抗CD63・抗MHC class II抗体コートビーズによる免疫アフィニティ分離が推奨された (Fig 2)。EBV形質転換B細胞由来エクソソームではMHC class II陽性ビーズへの吸着が示され、CD63抗体コートビーズによっても精製エクソソームが回収されることが確認された。
脂質組成については、PS (phosphatidylserine; ホスファチジルセリン) が血小板由来エクソソームおよびDC由来エクソソームの表面に存在すること、EBV形質転換B細胞由来エクソソームにはコレステロール富化リピッドラフト様構造が認められることが報告された。網状赤血球またはリンパ球由来エクソソームの脂質組成は産生細胞の細胞膜組成と類似するが、後期エンドソームに濃縮される lyso-bisphosphatidic acid (LBPA) もB細胞由来エクソソームで検出された。これらの特性はエクソソームを「骨fide (真正の) 分泌性サブセルラーコンパートメント」として位置づける根拠となった。
エクソソームの分子組成：普遍的マーカーと細胞種特異的タンパク質
多細胞種にわたる解析から、エクソソームには核・ミトコンドリア・ER・Golgi由来タンパク質は含まれず、サイトゾル・エンドソーム膜・細胞膜に由来するタンパク質のみが選択的に濃縮されることが示された (Table 1)。細胞種を問わず普遍的に検出されるタンパク質として、テトラスパニン (CD9, CD63, CD81, CD82)、HSC70/HSP84 (heat shock protein 84)/HSP90 (heat shock protein 90)、アンネキシン (annexin) I/II/IV/V/VI、Rab7/RAP1B (Ras-related protein 1B)/RABGDI (Rab GTPase GDP dissociation inhibitor)、Gi2α (G-protein alpha subunit 2, inhibitory)・14-3-3タンパク質、エノラーゼ-1が質量分析法などにより同定された Thery et al. JImmunol 2001。テトラスパニンはMHC分子・インテグリンと相互作用する大型多量体タンパク質ネットワーク形成に関与し、エクソソームの最も普遍的なマーカーとして確立された Escola et al. JBiolChem 1998。
細胞種特異的成分として、B細胞・DCではMHC class II・ICAM1 (intercellular adhesion molecule 1)/CD54、DCではCD86・αMβ2インテグリン・MFGE8 (milk fat globule-epidermal growth factor 8)/ラクタドヘリン、T細胞ではTCR (T cell receptor)/CD3/ζ複合体・β2インテグリン、網状赤血球ではα4β1インテグリン・トランスフェリン受容体、血小板ではP-セレクチン、腸管上皮ではCD26 (dipeptidylpeptidase IV)/A33抗原が検出された。一方、Fc受容体・CD28・CD40L・CD45 (T細胞由来)、HLA-DM、インバリアント鎖 (CD74)、LAMP2 (lysosomal-associated membrane protein 2)、v-ATPase (vacuolar ATPase)サブユニット、リソソームプロテアーゼはエクソソームから排除されており、エクソソームが細胞膜断片でもリソソームコンパートメントでもない独立した分泌区画であることが確認された (Table 1)。LAMP2はDC由来エクソソームには検出されるが、B細胞・肥満細胞由来では論争があり (免疫電子顕微鏡では陽性・ウェスタンブロット/FACSでは陰性)、細胞種や精製法により差異があることが指摘された。
エクソソームの生合成：逆向き出芽とESCRT機構
エクソソームはMVBの制限膜 (limiting membrane) から内腔側への「逆向き出芽 (reverse budding)」により ILV (intraluminal vesicle; 内腔小胞) として形成され、MVBが細胞膜と融合する際に細胞外へ放出される (Fig 3)。逆向き出芽の結果、エクソソームはサイトゾルを内包し、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを外表面に露出するという特徴的な膜配向をもつ。これは細胞質側ドメインを表面に露出する通常の輸送小胞とは対照的である (Fig 3a vs 3b)。免疫電子顕微鏡による確認として、HSC70・アンネキシンIIなどのサイトゾルタンパク質に対する抗体はエクソソームホールマウントを標識せず、MHC class II・CD9・αMβ2インテグリンの細胞外ドメインを標的とする抗体は標識することが示された。
エクソソームへのタンパク質ソーティングにはユビキチン化膜カーゴのESCRT機構が関与する Katzmann et al. Cell 2001。酵母のVps23 (tsg101のホモログ) のユビキチン結合能がMVBへのカーゴソーティングに必須であること、tsg101がDC由来エクソソームに検出されること、tsg101はHIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) の出芽にも必要であることから、ウイルス出芽とエクソソーム生合成に共通する逆向き出芽機構の分子的共通性が示唆された。ただし、ユビキチン非依存的ソーティング経路の存在も否定されておらず、ESCRT機構のみがエクソソーム生合成を決定するわけではないことも示された。
エクソソームの分泌タイミングは細胞種により異なる。EBV形質転換B細胞・未成熟DC・上皮細胞では構成的 (constitutive) にMVBが細胞膜と融合してエクソソームが分泌される一方、T細胞および肥満細胞では活性化に伴うCa²⁺濃度上昇を契機とした調節的分泌が観察された。融合にはSNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 機構 — t-SNARE (SNAP23 (synaptosomal-associated protein 23), syntaxin-3/4) とv-SNARE (VAMP7 (vesicle-associated membrane protein 7), VAMP8) — およびシナプトタグミン (synaptotagmin) が関与する可能性が示されたが、これらがエクソソーム分泌を直接制御するかどうかは当時未解明であった。なお、未成熟DCは成熟DCと比較して多量のエクソソームを産生することが報告されており (定量的には報告者間で差異あり)、末梢組織での病原体感知後のエクソソーム産生が免疫応答増幅に寄与するという作業モデルの根拠となった (Fig 4参照)。
エクソソームの免疫学的機能：T細胞活性化とクロスプレゼンテーション
エクソソームによるT細胞活性化として最も詳細に解析されたのはAPC (antigen-presenting cell)由来エクソソームである。Raposo et al. の先駆的研究では、EBV形質転換B細胞由来エクソソームがMHC class II依存的に抗原特異的CD4⁺ T細胞クローンを刺激することが示されたが、そのT細胞刺激効率はB細胞本体の約10-fold to 100-fold 低く (有意なT細胞増殖には、n=500,000-5,000,000個のB細胞が産生するエクソソーム量が必要であり、これはB細胞本体10,000-50,000個相当の刺激能に相当)、in vitroでの活性は限定的であった。MHC class IIを発現するよう操作したラット肥満細胞由来エクソソームによるT細胞刺激もその後報告され (Fig 2)、エクソソームがタンパク廃棄以外の機能を持つ可能性が初めて示された。
DC由来エクソソームは腫瘍ペプチドでパルスしたDCの培養上清から精製され、in vivoでP815確立腫瘍のT細胞依存的拒絶およびTS/A乳腺腫瘍の増殖有意遅延を誘導した。単回皮下投与において、n=500,000-1,000,000個のDCが産生するエクソソーム量が同数のDC自体と同等以上の抗腫瘍免疫応答を誘起することが確認された (Fig 4参照)。また、DC由来エクソソームはナイーブT細胞を単独では活性化できず、成熟DCの共存が必要であることが示された。このことから、エクソソームがDC間でMHC-ペプチド複合体を転送してAPC数を増幅させる——つまり間接的な免疫増幅メカニズムとして機能する——という「DC増幅仮説」が提唱された (Fig 4)。DC由来エクソソームの表面にはMAC1 (αMβ2インテグリン) が存在してT細胞・DC上のICAM1に結合し、MFGE8/ラクタドヘリンがDC上のαvβ3/5インテグリンと結合することで、エクソソームの標的細胞への選択的送達が可能であることも示された。
腫瘍由来エクソソームはメラノーマ細胞よりMHC class I + 腫瘍抗原 (melan-A/MART1 (melanoma antigen recognized by T cells 1)等) を担持した形で放出され、対応するMHC class I拘束要素を持つDCにローディングすることでMHC class I拘束性CTL (cytotoxic T lymphocyte) 応答を誘起した Wolfers et al. NatMed 2001。in vivoではDCにローディングした腫瘍由来エクソソームが腫瘍拒絶を誘導し、同系および同種異系腫瘍に対するクロスプロテクションも観察されたが、その「クロス保護」効果の機序は不明であった (共有腫瘍抗原の濃縮が一因と推察)。一方、エクソソームは免疫抑制にも寄与しうることが示唆された。腸管上皮細胞由来40 nm小胞「tolerosomes」がIFN-γ (interferon-gamma)存在下でOVA (ovalbumin) 特異的寛容を誘導した例、T細胞由来エクソソーム表面のFasL (Fas ligand)/APO2L (apoptosis ligand 2; TRAIL; TNF-related apoptosis-inducing ligand) が周囲T細胞のアポトーシスを誘発する例、メラノーマ細胞由来FasL保有エクソソームがT細胞アポトーシスを誘導し腫瘍免疫回避に寄与する例が報告された。
エクソソームの臨床応用：Phase I試験の知見
MAGE3エピトープ搭載単球由来DC由来エクソソームを用いたPhase I試験 (HLA (human leukocyte antigen)-A1またはB35/HLA-DP.04保有のMAGE3発現転移性メラノーマ患者対象、Institut Gustave Roussy/Institut Curie共同) ではn=15が登録された。主要エンドポイントである安全性は達成され、皮膚および リンパ節腫瘍部位での客観的縮小 (objective clinical regression) が観察された。NSCLC (non-small-cell lung carcinoma; 非小細胞肺癌) 患者を対象とした第I相試験 (Duke大学) では、重度前治療例において prolonged disease stabilization (疾患安定化の持続) が報告され、MAGE3エピトープ特異的CTL前駆体頻度のモニタリングが進行中であった。これらの結果を受け、進行メラノーマおよびNSCLCを対象とした多施設Phase II試験の計画が立案された。また、in vivoでのエクソソーム産生の最も確実な証拠として、Denzer et al. による扁桃リンパ節の濾胞性樹状細胞 (FDC; follicular dendritic cell) 表面に存在するMHC class II陽性エクソソーム様小胞の観察、および癌患者悪性腹水・胸水からのエクソソーム様小胞の精製と自己DCへのローディングによる腫瘍特異的CTL増幅も示された (n=患者数は報告段階)。
考察/結論
本レビューはエクソソームの物性・組成・免疫機能を初めて統合的に整理し、「直径30-90 nm・密度1.13-1.19 g/mL・エンドソーム由来・テトラスパニン濃縮」という最小定義を明示した点で、これまでのEV研究と異なり、エクソソームを独立した分泌性サブセルラーコンパートメントとして確立する転換点となった。既報では、エクソソームとアポトーシス小体・マイクロベシクルとの区別が曖昧であり、研究間の再現性・比較可能性が低かったが、本レビューの定義はその後のISEV (International Society for Extracellular Vesicles) によるガイドライン標準化 (2014/2018/2023) の礎となった。対照的に、当時のEV研究の多くは精製均一性の担保なく機能解析を行っており、本レビューが示した精製基準の重要性は後の研究コミュニティで広く認識された。
新規性の観点では、エクソソーム生合成における逆向き出芽とESCRT機構の関与、tsg101を介したHIV-1出芽との分子的共通性の提示が重要である。「細胞外コミュニケーション小胞」としての新規な生物学的カテゴリの確立は、後のmicroRNA搭載EVやEV-based drug delivery systemというこれまで報告されていない応用領域の概念的基盤を提供した。DC由来エクソソームのin vivoでの抗腫瘍効果と第I相試験での客観的奏効の確認は、細胞フリーがんワクチンという新規アプローチの実現可能性を初めて示したものであり、エクソソーム研究が基礎科学から新規治療開発に橋渡しされる先駆例となった。
臨床応用の面では、DC由来エクソソームを用いたがんワクチンは、従来のDC細胞療法と比較して大量製造・保存・品質管理 (GMP準拠) が容易という利点を持ち、Phase I試験での忍容性と初期の臨床的意義ある効果 (objective regression・disease stabilization) は、エクソソームの臨床応用としての将来的可能性を具体的に示した。現代の視点からは、この2002年の知見がbench-to-bedside研究の先駆例として位置づけられ、現在進行中のEV医薬品開発の方向性を規定したといえる。
残された課題として著者らは、(1) MVB内向き出芽の精確な分子機構 (ユビキチン依存/非依存経路の分担とソーティングシグナルの実体) の解明、(2) エクソソーム精製の標準化と他の小胞コンタミネーションの排除法確立、(3) in vivoでのエクソソーム産生量・動態・標的細胞への送達機序の直接的証明、(4) T細胞プライミングと免疫寛容誘導の決定因子 (DC成熟状態、炎症環境、エクソソーム細胞起源の組み合わせ) の解明、(5) Phase I知見から有効性確立への今後の検討という5点を明示した。特に「in vivoにおけるエクソソームの生理的役割の実験的実証」が今後の研究における最大の挑戦であるとされた。本レビュー執筆時点でのin vivo証拠の最良例がFDC表面のエクソソーム様小胞観察に限られていたことは重要なlimitationであり、その後のin vivo追跡・イメージング技術の進展によって克服される方法論的課題として明示的に提示された。
方法
本研究は、著者ら (Théry/Zitvogel/Amigorenaグループ、Institut Curie/Institut Gustave Roussy) 自身の実験データを含む1981年から2002年に至る文献68報を統合したNarrative review (narrative synthesis) である。文献検索はPubMed/MEDLINEを用い、「exosome」「multivesicular body」「dendritic cell exosome」「tumor vaccination」をキーワードとして実施し、エクソソームの発見から免疫学的機能・臨床応用に関する主要論文68報を対象として narrative synthesis (定性的統合) により知見を整理した。
エクソソームの精製方法として、各原著論文では連続遠心法 (differential centrifugation) — デッドセル除去 (低速遠心)、デブリ除去 (中速遠心)、最終100,000×gの高速超遠心によるエクソソームペレット回収 — にスクロース密度勾配遠心 (浮遊密度1.13-1.19 g/mLでの分画) を組み合わせた手法が採用された。特性評価には免疫電子顕微鏡 (immunoelectron microscopy)、FACS (fluorescence-activated cell sorting)、ウェスタンブロッティング、質量分析法 (mass spectrometry) が用いられた。エクソソームの同定マーカーとして、テトラスパニン (CD9, CD63, CD81, CD82)、HSC70 (heat shock cognate 70)、MHC class I/II分子が複数の研究で一貫して使用された。著者ら自身のDC由来エクソソーム研究では、マウス骨髄由来DCを腫瘍ペプチドでパルスし、in vivo腫瘍モデル (P815マスト細胞腫・TS/A乳腺腫瘍を用いた皮下移植確立腫瘍モデル) での拒絶・増殖遅延実験を実施した。免疫療法への応用としては、MAGE3 (melanoma antigen gene 3) エピトープ搭載単球由来DC由来エクソソームを用いたGMP (good manufacturing process) 準拠のPhase I臨床試験データも統合対象とした。各原著論文では Student’s t-test または Mann-Whitney U test による群間比較が実施され、有意水準 p<0.05 で腫瘍容積変化・T細胞増殖・エクソソーム産生量が評価された。本レビュー自体では formal meta-analysis は実施せず、各原著の定量的知見を定性的に比較整理した。