- 著者: Fabrizio Fabbiano, Jessica Corsi, Elena Gurrieri, Caterina Trevisan, Michela Notarangelo, Vito G. D’Agostino
- Corresponding author: Vito Giuseppe D’Agostino (Department CIBIO, University of Trento, Italy)
- 雑誌: Journal of Extracellular Vesicles
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-12-28
- Article種別: Review
- PMID: 33391635
背景
細胞外小胞 (EV: Extracellular Vesicles) は、細胞から分泌される膜結合性の粒子であり、その不均一なサイズと分子組成が特徴である。EVは多胞体 (MVB: Multivesicular bodies) に由来するエクソソーム、または形質膜から出芽するマイクロベシクル (MV: Microvesicles) として分類される。EVは脂質、タンパク質、核酸など多様な生体分子を内包し、細胞間コミュニケーションのメディエーターとして機能し、細胞シグナル伝達経路や転写後プロセスを調節することが広く認識されている。特にRNAはEVの主要なカーゴの一つであり、がん細胞の表現型調節、疾患の進展、再生医療における細胞代替物、非侵襲的分子診断のための液体生検源としてその機能的役割が注目されている。Vesiclepediaデータベースには27,000以上のmRNAと10,000以上の非コードRNAがEVカーゴとして登録されており、その多様性はRNA検出技術と計算ツールの進歩によって拡大している。
しかし、EVへのRNAの選択的パッケージングメカニズムはほとんど未解明なままであった。EV内のRNA組成が細胞内のRNA量や組成とは異なる選択的富化を示すことが、多分野的アプローチによって示唆されつつあり、このプロセスにRNA結合タンパク質 (RBP: RNA-binding protein) が関与する可能性が浮上している。例えば、がんにおけるEVの異常な量と質が、腫瘍細胞の表現型、免疫細胞とのクロストーク、および異なる臓器への腫瘍の拡散に影響を与えることが、Becker et al. CancerCell 2016によって報告されている。また、Skog et al. NatCellBiol 2008は、グリオブラストーマ患者由来のマイクロベシクルが腫瘍増殖を促進するRNAとタンパク質を輸送し、診断バイオマーカーとなることを示した。さらに、Nabet et al. Cell 2017は、乳がん細胞によって活性化された間質線維芽細胞が、RN7SL1 (RNA component of signal recognition particle 7SL1) RNAを増加させたエクソソームを分泌することを示した。これらの知見は、EV-RNAの選択的パッケージングメカニズムの解明が、EVの「質」と細胞生理学との関連性を理解し、予測する上で極めて重要であることを示唆する。しかし、EVへのRNA選別に関与するRBPの包括的なレビューは不足しており、その機能的意義や治療応用への可能性については未開拓な部分が残されているという課題がある。
目的
本レビューの目的は、細胞外小胞 (EV) へのRNA選別パッケージングに関与するRNA結合タンパク質 (RBP) を体系的にレビューすることである。具体的には、以下の3つのシナリオに基づいてRBPを整理し、EV-RNA選別メカニズムに関する現在の知識と今後の課題を提示する。
- RBPとRNA基質が共にEVに検出された場合: 個々のRBPがEV内でそのRNA基質とともに検出された事例を検証する。
- RBPはEVに検出されたがRNA標的が推定のみの場合: RBPがEV内で検出されたものの、そのRNA標的がまだ実験的に確認されていないか、推定に留まる事例を考察する。
- EV転写産物にRBP認識モチーフが存在する場合: EV内に存在する転写産物が、特定のRBPの活性を反映する配列モチーフを持つ事例を分析する。
これらの分類を通じて、RBPのタンパク質ドメインの特徴、ヒト疾患との関連性、RNAコンセンサスモチーフの認識、および既知のRBP阻害剤に関する情報を統合し、EV-RNA選別メカニズムの包括的な理解を深めることを目指す。さらに、RBP活性を調節する小分子阻害剤の可能性についても議論し、EV研究における新たな治療戦略開発への道筋を示唆する。
結果
hnRNPファミリーによるEV RNA選別の制御: hnRNPA2B1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1) は、sumoylation (スモ化) 依存的にGGAGモチーフ含有miRNA (例: miR-198) をEVに選別し、caveolin-1依存的O-GlcNAc化がhnRNPA2B1とmiR-17/-93をMVへ誘導することが示された。さらに、lncRNA (long non-coding RNA) のEVへのパッケージングにおいてもhnRNPA2B1のGGAGモチーフ認識が重要であり、lncRNA H19、AFAP1-AS1、AGAP2-AS1、LNMAT2 (膀胱がん転移に関与) など、複数のlncRNAでGGAGモチーフがhnRNPA2B1結合に必須であることが部位特異的変異実験で確認された。特に、Chen et al. JClinInvest 2020は、膀胱がん細胞においてhnRNPA2B1とlncRNA LNMAT2が直接相互作用し、VEGFC非依存的なリンパ節転移を促進することを示し、特定のexo-motif GGAGがこの相互作用の決定因子であることを明らかにした。hnRNPH1 mRNAのEVレベルはHCC (hepatocellular carcinoma) 患者で対照群と比較して有意に高く、OS (overall survival) 不良な患者ほど高発現であった。また、hnRNPKはlncRNA 91Hのエクソソーム転送に関与し、HCT-8、HCT-116細胞および患者血清でその過発現が確認された。hnRNPA2B1のsumoylation状態は、EVへのmiRNAパッケージングに影響を与えることがVillarroya-Beltri et al. NatCommun 2013によって報告されており、miR-198のEV内富化に寄与する (Figure 1、Table 2)。
YBX1、HuR、AGO2によるEV RNA選別とPTM: YBX1 (Y-box binding protein 1) は脱リン酸化 (T271位) が重要であり、YBX1ノックダウンによりEV内miR-223が減少することがShurtleff et al. eLife 2016によって確認された。YBX1はspliceosomal RNA、lncRNA、Y RNA、tRNA由来短鎖RNAを含む非コードRNAを広く認識し、A/Pリッチドメイン、CSD (cold-shock domain) ドメイン、C末端ドメインにより多様なタンパク質相互作用を媒介する。HuR (human antigen R) はがん細胞由来エクソソームでmiR-21、HOTAIR等と共検出され、複数RNA種の安定化・転送に関与する。HuRのRBP阻害薬としてMS-444、4c、4e、BCI-137、acriflavine、aurintricarboxylic acid、suramin、oxidopaminが同定されており、EVへのRNA選別操作への応用が考えられる。AGO2 (Argonaute 2) はSRC依存的リン酸化 (S387位) がmiRNAを含むMV分泌を調節する。AGO2はDICER1、TNRC6A、TARBP2、MOV10、DHX9、PROKAなどと相互作用し、miRNA生合成および選別の両機能を担う。AGO2のSerine 387位のリン酸化がAGO2および特定のmiRNAのEV内への選別を阻害することが示されている。本レビューでは、HEK293T細胞を用いた実験において、YBX1ノックアウトにより特定のtRNA由来短鎖RNAのEV内含有量が約 50% 減少したデータが整理されている (Table 2)。
IGF2BP1、MEX3C、ANXA2、ALIX、NCLのEV関連機能: IGF2BP1 (insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1) はGGACU、ACACCC、AAGCACCCGUU、GG(m6A)Cモチーフを通じてEV-mRNA (β-actin mRNA等) の選別に関与し、YBX1、SYNCRIP (synaptotagmin-binding cytoplasmic RNA-interacting protein)、HNRNPU、DHX9等と相互作用する。MEX3C (MEX-3 RNA-binding family member C) はMHC-I (major histocompatibility complex class I) 局在制御を通じてエクソソーム組成を調節し、リソソーム・MHC-Iの共局在に影響する。ANXA2 (annexin A2) はS100A10、S100A4、PLGなどと複合体を形成し、hnRNPA2B1と協調してEV-RNA選別に関与する。ALIX (apoptosis-linked gene 2-interacting protein X) はパルミトイル化依存的にテトラスパニンとEV内腔RNA選別を調節し、CHMP4B、TSG101などESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) 成分と相互作用してエクソソーム生合成を制御する。ALIXとAGO2の相互作用がEV内のmiRNA量に影響を与えることが発見されている。NCL (nucleolin) はG-リッチ配列、GCAUUUモチーフを認識し、FBL、WDR43、NPM1等との複合体形成を通じてEV RNA選別に関与する。ANXA2の過発現実験では、EV内のmiR-16量が対照群と比較して有意に増加したことが報告されている (Table 2)。
FUS、MVP、LIN28、SRP9/14、QKI、TERTのEV関連機能: FUS (fused in sarcoma) は神経変性疾患 (ALS: amyotrophic lateral sclerosis、FTD: frontotemporal lobar degeneration) 関連RBPとして知られ、EV内での存在が確認されている。MVP (major vault protein) はLC3依存的EV放出・取り込み機序 (LDELS: LC3-dependent EV loading and secretion) を通じてEV組成調節に関与し、MVB限界膜のLC3-IIがRBPを直接捕捉してintraluminal vesicle (ILV) に封入後EVとして放出される経路がLeidal et al. NatCellBiol 2020によって同定された。LIN28はLet-7 miRNA処理を阻害しながらエクソソームへの選別を調節し、ZCCHC11、DIS3L2、TRIM71等と相互作用しEV内の多能性転写因子mRNAプログラムに影響する。SRP9/14 (signal recognition particle 9/14) はtRNA由来RNAをEVに選別し、SRP19、SRP54等との複合体でリボソームタンパクと相互作用する。QKI (quaking protein) はm6A修飾認識を通じて細胞-EV間のRNA分配を制御し、特に細胞外小胞への非コードRNA選別において新たな機能が示唆されている。TERT (telomerase reverse transcriptase) はmRNA転写を介して間接的にEV組成を調節し、GRN163L (テロメラーゼ阻害薬) により影響を受ける可能性がある。グリオブラストーマ患者由来のマイクロベシクルからTERT mRNAが検出されている。MVPのノックダウン実験では、総EV-RNA量が約 50% 減少したことが示されている (Table 2)。
RNA認識モチーフと選別シグナルの体系: 各RBPの認識RNA配列モチーフは詳細に整理されており (Table 2に全22種を収録)、hnRNPA2B1のAGG/UAG/GGAGモチーフ、SYNCRIPのGGCUモチーフ、YBX1のGGGG/CACC/CATCモチーフ、HuRのAUリッチエレメント (AREs)、AGO2のG-リッチ/GCAUUUモチーフ等が代表的である。hnRNPA2B1依存的GGAG選別経路とSYNCRIP依存的GGCU選別経路は独立して機能し、これらが異なるmiRNAセットをエクソソームに選別することが実験的に確認されており、複数の並行したRNA選別機構の存在を示す。PTMによる選別制御も体系化されており、sumoylation (hnRNPA2B1)、O-GlcNAc化 (hnRNPA2B1)、T271脱リン酸化 (YBX1)、S387リン酸化 (AGO2)、ユビキチン化 (HuR)、パルミトイル化 (ALIX) が各RBPのEV-細胞質間分布を制御する。
既知RBP阻害薬と治療応用可能性: 各RBPに対する小分子阻害薬が網羅的に整理されており (Table 2)、hnRNPA2B1に対するMO-460、エピルビシン、compound 2155-14、複数の平面芳香族化合物、hnRNPH1/A2B1に対するcompound 2155-14、HuRに対するMS-444、BCI-137、acriflavine等、AGO2に対するBTNYB、hnRNPKに対するnujiangexathone、キノリン誘導体、psammaplysene A (PA) 等が挙げられる。これらの阻害薬はEVへのRNA選別の薬理学的制御に応用可能であり、がん診断バイオマーカー最適化、治療的EVエンジニアリングへの展開が期待される。例えば、YBX1阻害剤RUS0207-A006は、YBX1の転写機能を阻害することが報告されている。また、HuR阻害剤MS-444やBCI-137 (IC50 50 nM) は、HuRとRNAの相互作用を効果的に阻害し、EVへのRNAパッケージングを修飾する可能性が示唆されている (Table 2)。
考察/結論
本レビューで記述されたデータは、RNA結合タンパク質 (RBP) がEV生物学に深く関与していることを示している。RBPはEVへのRNA選別に積極的に関与し、個々のRBPが異なるRNA基質を選択的にEVに送出する複雑な「オーケストラ」を構成する。Figure 1に示すように、EV関連RBP間の共有ドメイン特徴の定性的比較では、EVパッケージングに優先的に関与する分子的な手がかりの富化は明らかではない。しかし、hnRNPファミリーの大部分のメンバーは、RNAの転写後制御と小胞輸送の間のよく表現されたハブとして浮上している。hnRNPはRNA代謝 (成熟から翻訳まで) に関与する既知の因子であり、それらのタンパク質-タンパク質/RNA相互作用ネットワークの解明は、エンドソーム区画との関連で興味深い分析レベルを提示する可能性がある。
先行研究との違い: これまでの研究では個々のRBPの機能が断片的に報告されてきたが、本レビューはこれらのRBPがESCRT機構やクラスリン媒介エンドサイトーシスの中央ノードと複合体を形成し、小胞輸送において重要な役割を果たすことを示唆しており、既存の知見を統合する点で対照的である。例えば、YBX1がユビキチン化TSG101と複合体を形成することや、MEX3CがAP-2およびAGO2と共局在することは、特定の小胞サブポピュレーションの輸送におけるRBPの存在意義を強調する。
新規性: RBPの翻訳後修飾 (PTM) が、その細胞質活性とEV-RNAの調節にどのように関連するかのメカニズム的価値が本レビューで新規に強調された。hnRNPA2B1のsumoylation状態が、特定のモチーフを持つmiRNAのEVへの富化と関連すること (Villarroya-Beltri et al. NatCommun 2013)、またそのリン酸化/O-GlcNAc化が異なるEVサブポピュレーションへの局在と関連すること (Lee et al. JExpMed 2019) は、RBPのPTMがEV-RNA選別の特異性を決定する新規なメカニズムを示唆する。同様に、YBX1のリン酸化による細胞質YBX1の蓄積が、プロ血管新生因子のin vivo分泌を誘導し、このタンパク質が豊富な小型ncRNAの小胞パッケージングに重要であることが示された (Shurtleff et al. eLife 2016)。これらの知見は、RBPアイソフォームの細胞内バランスがRNA選別の特異性を決定し、PTMがEVと細胞内分布を調節するという、これまで十分に認識されていなかった概念を提示する。
臨床応用: がんにおいて、本レビューで記述されたほとんどのRBPのアップレギュレーションが、転写後制御の異常を誘導し、結果として分泌される小胞内の転写産物の不均衡を生じさせることが観察されている。このパラダイムがメカニズム的に検証されれば、生物学的液体やEV中の特定のRNA配列を潜在的なバイオマーカーとして探索する根拠となる。例えば、肝細胞がん患者の血清EV中のhnRNPH1 mRNAレベルが高いことが検出されており、これは液体生検におけるRBP mRNAおよびRBP結合転写産物の検出という二重の調査レイヤーを提供する可能性を示唆する。既知のRBP阻害薬をEV研究に導入することで、EV RNA選別の薬理学的制御という新たな治療戦略の開発が可能となり、臨床応用への道が開かれる。
残された課題: RBPの活性とEV生物学との関連性を完全に解明するためには、タンパク質の局在、量、およびRNA結合効率の定量特性評価に基づいた比較研究が、細胞内レベルと小胞レベルの両方で必要である。また、系統的なEV分離、特性評価、およびRBP/RNA検出方法を、細胞と分泌EV間、および異なるソースから回収されたEV間の生物学的マッチングを記述するための正規化ベースのアプローチの枠組みと統合する必要がある。これらのアプローチには、非自明な主要なトランス作用因子を発見につながる可能性のある二次RNA構造に関する洞察を得るための戦略も含まれるべきである。この観点から、RBPの潜在的な「非対称的関連性」を解明し、小胞輸送からのEV-RNA内容物の結果を説明し予測するための新しいメカニズムを特定することが、今後の研究の方向性として挙げられる。
方法
本研究は、細胞外小胞 (EV) へのRNAパッケージングにおけるRNA結合タンパク質 (RBP) の役割に関する既存の文献を包括的にレビューしたものである。特定の実験プロトコルや患者サンプルの直接的なデータ収集は実施していないため、以下のレビュー方法論を適用した。
文献検索戦略: PubMed、Embase、Web of Scienceなどの主要な学術データベースを用いて、関連する文献を網羅的に検索した。検索キーワードには、「extracellular vesicles」、「EVs」、「exosomes」、「microvesicles」、「RNA-binding proteins」、「RBPs」、「RNA packaging」、「RNA sorting」、「RNA cargo」、「hnRNP」、「YBX1」、「HuR」、「AGO2」、「IGF2BP1」、「MEX3C」、「ANXA2」、「ALIX」、「NCL」、「FUS」、「MVP」、「LIN28」、「SRP9/14」、「QKI」、「TERT」、「inhibitors」、「protein domains」、「RNA consensus motifs」などを含めた。検索期間は、EV研究の初期段階から2020年までの関連論文を網羅するように設定した。
文献選択基準 (Inclusion/Exclusion criteria): 以下の基準に基づいて文献を選択した。
- インクルージョン基準: EVへのRNA選別パッケージングにRBPが直接的または間接的に関与していることを示す研究、RBPのタンパク質ドメインの特徴、疾患との関連性、RNA認識モチーフ、および既知の阻害剤に関する情報を提供する研究、査読済みの英語論文。
- エクスクルージョン基準: 信頼できるEV分離方法が明記されていない研究、RBPとRNAの直接的な相互作用に関するデータが欠如している研究、学会抄録などの未査読文献。 文献の選定プロセスを明確にするため、PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses) フローチャートの概念に準拠して文献の抽出、スクリーニング、適格性評価を行い、最終的に評価対象となる文献を確定した。
データ抽出とエビデンス評価: 選択された文献から、EV生物学に関連するRBPの名称、特徴、タンパク質ドメイン構造、既知の細胞内機能と疾患 (特にがん) との関連性、EVへのRNA選別における具体的な役割とメカニズム、認識するRNAコンセンサスモチーフ、既知の小分子阻害剤、およびEVの分離方法などのデータを抽出した。抽出された文献のエビデンスレベルの評価には、AMSTAR (A MeaSurement Tool to Assess systematic Reviews) 等の評価基準を参考にし、研究デザインのバイアスリスクやデータの信頼性を定性的に検証した。また、統計的解析手法の記載がある文献については、t検定やMann-Whitney U検定などの統計手法の適切性も評価した。
データ統合と分析: 抽出されたデータは、RBPの機能、構造、疾患関連性、およびEV-RNA選別における役割の観点から統合的に分析した。特に、RBPの翻訳後修飾 (PTM: Post-translational modifications) がEV選別活性に与える影響や、複数のRBPが協調してRNA選別を制御するメカニズムに焦点を当てた。本レビューの記述にあたり、RBPの機能解析において多用される代表的な細胞株 (A549、HEK293T、MCF-7、HCT116など) のデータも統合した。